لا تزال الطرق البسيطة للكشف عن التنشيط الانتقائي لبروتينات G بواسطة المستقبلات المقترنة ببروتين G تمثل تحديا بارزا في إشارات الخلية. هنا ، تم تطوير المستشعرات الحيوية لنقل طاقة الرنين (FRET) عن طريق الربط الزوجي لببتيدات بروتين GPCR إلى G لاستكشاف التغيرات التوافقية بتركيزات خاضعة للرقابة في الخلايا الحية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
موافقات لهذه العملية من G البروتين انتقائية تقاس باستخدام الحنق مجسات في لايف تعليق خلية التألق الفحص
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
Fӧrster نقل الطاقة الرنين (الحنق) المستندة أصبحت الدراسات شائعا بشكل متزايد في التحقيق في هذه العملية من الإشارات. وضعت مجموعة بحثنا جهاز استشعار الحنق داخل الجزيئية للكشف عن التفاعل بين مفارز Gα وGPCRs في الخلايا الحية بعد التحفيز ناهض. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول للكشف عن تغيرات في الحنق بين مستقبلات الأدرينالية β 2 وGαs C-محطة الببتيد على العلاج مع 100 ميكرومتر ايزوبروتيرينول هيدروكلوريد كما تتميز سابقا 1. استشعار الحنق لدينا هو ببتيد واحد يتألف بشكل متسلسل لهذه العملية من طول كامل، fluorophore الحنق متقبل (mCitrine)، وهو ER / K نوبة (منهجية البروتين تقارب قوة التحوير) الربط، وهو fluorophore الحنق المانحة (mCerulean)، وGα C الببتيد -terminal. هذا البروتوكول سوف إعداد خلية التفاصيل والظروف ترنسفكأيشن، وإعداد المعدات، وتنفيذ فحص وتحليل البيانات. هذا التصميم التجريبي بالكشف عن الفصل صغيرفي نفس الفئة في الحنق يدل على تفاعلات البروتين البروتين، ويمكن أن تستخدم أيضا لمقارنة قوة التفاعل عبر بروابط وهذه العملية من الجميع حدودا البروتين. لتعزيز الإشارات إلى الضجيج في قياساتنا، هذا البروتوكول يتطلب الدقة المتزايدة في جميع الخطوات، ويرد هنا لتمكين تنفيذ استنساخه.
المقدمة
مستقبلات جانب G-بروتين (GPCRs) هي مستقبلات سبعة الغشاء. الجينوم البشري يحتوي على وحده ما يقرب من 800 الجينات الترميز لGPCRs، والتي يتم تفعيلها من خلال مجموعة متنوعة من بروابط بما في ذلك الضوء، عطر، والهرمونات، والببتيدات، والمخدرات، وغيرها من الجزيئات الصغيرة. ما يقرب من 30٪ من جميع الأدوية الموجودة حاليا في GPCRs السوق المستهدفة لأنها تلعب دورا كبيرا في العديد من الحالات المرضية 2. وعلى الرغم من عقود من العمل المكثفة التي بذلت على هذه العائلة المستقبلة، لا تزال هناك أسئلة معلقة كبيرة في هذا المجال، خاصة فيما يتعلق الآليات الجزيئية التي تدفع التفاعلات النوع من الاختزال المستجيب. حتى الآن، تم نشر واحدة فقط التركيب البلوري عالية الدقة، وتوفير نظرة ثاقبة على التفاعل بين مستقبلات β 2 الأدرينالية (β 2 -AR) والبروتين غس 3. جنبا إلى جنب مع بحوث واسعة النطاق في العقود الثلاثة الأخيرة، وتكرر العنصر الهيكلي معين واحد هو أن حاسمة في هذاالتفاعل: وGα فرعية محطة سي. هذا الهيكل هو مهم لكلا تنشيط بروتين G من قبل هذه العملية من 4 و G اختيار البروتين 5-6. وبالتالي، توفر Gα سي صول رابط حيوي بين التحفيز يجند لهذه العملية من وانتقائية تنشيط بروتين G.
الأبحاث على مدى العقد الماضي تشير إلى أن GPCRs ملء المشهد بتكوين واسع، مع يجند ملزمة استقرار مجموعات فرعية من التشكل النوع من الاختزال. في حين أن العديد من التقنيات، بما في ذلك البلورات، NMR ومضان الطيفي، وقياس الطيف الكتلي المتاحة لدراسة المشهد بتكوين النوع من الاختزال، هناك قلة من النهج لتوضيح أهمية وظيفية في اختيار المستجيب 7. هنا، ونحن الخطوط العريضة لنهج المستندة Fӧrster نقل الطاقة الرنين (الحنق) للكشف عن G-بروتين انتقائية التشكل النوع من الاختزال. تعتمد الحنق على القرب والتوجه الموازي اثنين fluorophores مع تداخل الانبعاثات (المانحة) لالثانية الإثارة (متقبل) الأطياف 8. كما تأتي المانحة ومتقبل fluorophores أقرب معا نتيجة إما تغيير متعلق بتكوين في البروتين أو تفاعل البروتين البروتين، والحنق بينهما يزيد، ويمكن قياسها باستخدام مجموعة من الأساليب 8. وقد استخدمت أجهزة الاستشعار القائم على الحنق على نطاق واسع في مجال النوع من الاختزال 9. تم استخدامها لتحقيق التغييرات التشكل في هذه العملية من خلال إدخال المانحة ومتقبل في حلقة الخلايا الثالثة وهذه العملية من محطة سي. وقد تم تصميم أجهزة استشعار للتحقيق في هذه العملية من والتفاعلات المستجيب من وصفها بشكل منفصل النوع من الاختزال والمستجيب (بروتين G مفارز / arrestins) مع زوج الحنق 10؛ بعض أجهزة الاستشعار أيضا اكتشاف التغيرات متعلق بتكوين في بروتين G 11. وقد مكنت هذه الحساسات مجال لطرح العديد من الأسئلة العالقة بما في ذلك التغيرات متعلق بتكوين في هذه العملية من والمستجيب، هذه العملية من المستجيب حركية التفاعل، وبروابط تفارغي 12. مجموعتناكان مهتما بشكل خاص في خلق جهاز الاستشعار البيولوجي والتي قد كشف G-بروتين معين التشكل النوع من الاختزال في ظل ظروف يحركها ناهض. ويعتمد هذا جهاز الاستشعار البيولوجي على التكنولوجيا التي تم تطويرها مؤخرا اسمه نوبة (منهجية البروتين تقارب قوة التحوير) 13. ويشمل التشنج الربط التفاعل المجالات البروتين باستخدام ER / ك رابط، التي تسيطر على تركيزات على نحو فعال. المرافقة رابط مع زوج الحنق من fluorophores يخلق الأداة التي يمكن أن يقدم تقريرا عن حالة التفاعل بين البروتينات 12. قبل 1 تم استخدام وحدة التشنج إلى حبل على Gα C-محطة لالنوع من الاختزال ورصد تفاعلاتها مع fluorophores الحنق، mCitrine (المشار إليها في هذا البروتوكول من قبل البديل في المعروف، البروتين أصفر نيون (YFP)، الإثارة / ذروة الانبعاثات في 490/525 نانومتر) وmCerulean (المشار إليها في هذا البروتوكول من قبل والذي يعرف عادة البديل البروتين سماوي نيون (CFP)، الإثارة / ذروة الانبعاثات 430/475 نانومتر). من N- لمحطة سي، تيله المشفرة وراثيا ببتيد واحد يحتوي على: كامل طول النوع من الاختزال، الحنق متقبل (mCitrine / YFP)، و 10 نانومتر ER / ك رابط، الحنق المانحة (mCerulean / CFP)، والببتيد Gα محطة سي. في هذه الدراسة، ويختصر أجهزة الاستشعار التي النوع من الاختزال-رابط طول Gα الببتيد. يتم فصل جميع المكونات من قبل غير منظم (الغليسين-سر-الغليسين) 4 رابط والتي تمكن دوران حر من كل مجال. توصيف مفصل لهذه المجسات وقد سبق القيام بها باستخدام اثنين GPCRs نموذجية: β 2 -AR وأوبسين 1.
وtransfected هذا الاستشعار عابر في الخلايا كلوة-293T والقائم على التألق يعيش تجارب الخلايا قياس مضان أطياف الزوج الحنق في وحدات التعسفي من التهم في الثانية (CPS) في وجود أو عدم وجود يجند. وتستخدم هذه القياسات لحساب نسبة الحنق بين fluorophores (YFP ماكس / CFP كحد أقصى). ثم يتم احتساب أي تغيير في الحنق (ΔFRET) بطرح متوسط نسبة الحنقالعينات غير المعالجة من نسبة الحنق من عينات يجند المعالجة. ΔFRET يمكن مقارنتها عبر بنيات (β 2 -AR 10 نانومتر Gαs الببتيد مقابل بيتا 2 -AR 10 نانومتر أي الببتيد). هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول للتعبير عن هذه المجسات في الخلايا كلوة-293T الحية، ورصد التعبير عنها، وإعداد وتنفيذ وتحليل الخلية الحية القائمة على التألق الحنق قياس دون علاج مقابل شروط المخدرات المعالجة. في حين أن هذا البروتوكول هو محدد لنانومتر Gαs استشعار الببتيد β 2 -AR 10 تعامل مع 100 بيطرطرات ميكرومتر ايزوبروتيرينول، فإنه يمكن أن يكون الأمثل لمختلف أزواج النوع من الاختزال-Gα وبروابط.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الحمض النووي
- استشعار تصميم يبني باستخدام نظام الاستنساخ وحدات. يرجى الرجوع إلى β 2 -AR تصميم أجهزة الاستشعار مفصل من قبل 1.
- تحضير الحمض النووي وفقا لبروتوكول تجاري عدة miniprep وأزل في 2 حل ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8، في ≥ تركيز 750 نانوغرام / ميكرولتر، A 260/280 من 1،7-1،9، A 260/230 من 2،0 حتي 2،29.
2. خلية التحضير الثقافة
- ثقافة الخلايا كلوة-293T-FLP ن في DMEM تحتوي على 4.5 غرام / لتر مد الجلوكوز، على أن تستكمل مع 10٪ FBS (المعطل الحرارة) (ت / ت)، 1٪، الجلوتامين ملحق، 20 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.5 في 37 ° مئوية في جو مرطب على 5٪ CO 2. التعامل مع الخلايا في غطاء السلامة البيولوجية لخطوات لاحقة.
- تسمح للخلايا أن تنمو إلى أحادي الطبقة متموجة قبل الركض في أطباق ستة جيدا. الوقت لتحقيق confluency يعتمد على كثافة الطلاء الأولي. استخدام لوحات التيتأتي إلى confluency ضمن 1-2 أيام من الطلاء لمدة ستة جيدا الطلاء. طبق تعامل ثقافة متكدسة 10 سم الأنسجة لديها كثافة الخلايا ما يقرب من 4 × 10 6 خلية / مل. انظر الشكل رقم 1 لصورة نمو ثقافة الخلية.
- غسل الخلايا مع 10 مل في برنامج تلفزيوني، ويعرض للتريبسين مع التربسين 0.25٪ (انظر مناقشة، الفقرة 2). لوحة 8 × 5 10 خلايا / جيد في 2 مل من وسائل الاعلام في زراعة الأنسجة المعاملة ستة أطباق جيدا، والسماح لتنضم ل16-20 ساعة.
3. شروط ترنسفكأيشن
- ارباك تعداء للبنيات التي قد تتطلب كميات مختلفة من الوقت لتحقيق أقصى قدر من التعبير (بين 20 - 36 ساعة). مزامنة الظروف لفترة تجربة موحد. لدينا أيضا السيطرة untransfected جيدا في كثافة الخلايا تعادل لاستخدامها الضوضاء في الخلفية والطرح تشتت أثناء التحليل.
- جلب الكواشف ترنسفكأيشن إلى درجة حرارة الغرفة: انخفاض وسائل الإعلام في الدم، الحمض النووي، وترنسفكأيشن الكاشف.
- فيغطاء السلامة البيولوجية الجمع بين الكواشف في أنبوب microcentrifuge العقيمة في الترتيب التالي: مزيج 2 ميكروغرام الحمض النووي مع 100 ميكرولتر تقليص وسائل الاعلام المصل. ارتفاع 6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن إلى مزيج سائل الإعلام / الحمض النووي دون لمس سطح خليط أو الجانب من الأنبوب. إعداد رد فعل ترنسفكأيشن واحد لكل بئر. شروط ترنسفكأيشن يمكن أن يكون الأمثل (1-4 ميكروغرام من الحمض النووي، 3-6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن) لتحقيق مستويات التعبير متسقة. انظر الجدول رقم 1 لنسب أكثر الأمثل.
- احتضان الخليط في RT في غطاء السلامة البيولوجية ل15-30 دقيقة. لا تستخدم رد فعل إذا ما تركت لاحتضان لمدة أكثر من 30 دقيقة.
- إضافة رد الفعل إلى الخلايا بطريقة قطرة من الحكمة كذلك عبر ويهز بلطف ستة جيدا لضمان خلط دقيق. إضافة رد فعل واحد لكل بئر.
- بعد 20 ساعة من التعبير، ورصد مضان باستخدام زراعة الأنسجة مضان المجهر. تقييم التعبير السكان مع 10X توطين موضوعي والبروتين في الخلية في 40X. طب التوليدerve للتعبير البروتين في غشاء البلازما (بعد الظهر). إذا لاحظت استيعاب كبير، ومراقبة ترنسفكأيشن حتى يتم الكشف عن التعبير كبيرا في PM.
4. الكاشف وإعداد المعدات
- إعداد 100 سهم المخدرات ملم ومخزن في -80 ° C: بيطرطرات ايزوبروتيرينول (100 ملم في DH 2 O يحتوي على 300 ملي حمض الاسكوربيك). جعل على الجليد / في غرفة باردة، وفلاش للتجمد فورا. قسامات يمكن إجراء وتستخدم ما يصل الى سنة واحدة.
- إعداد العازلة الخليوي (~ 2 مل / حالة) وتخزينها في 37 درجة مئوية الماء الحمام. جعل الطازجة كل يوم. إشارة الجدول رقم 2 للخلية مكونات العازلة.
- إعداد العازلة المخدرات (10 مل)، وتخزين في درجة حرارة الغرفة. إشارة الجدول رقم 2 للمكونات العازلة المخدرات.
- حامض يغسل cuvettes باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز. تحييد مع قاعدة ضعيفة (1 M KOH)، ويغسل جيدا cuvettes مع DH 2 O.
- إعداد محطة عمل حول التألق مع عدةصناديق من 10، 200، و 1،000 نصائح ميكرولتر ماصة، الموقت مع مجموعة العد التنازلي 10 دقيقة، وهو خط فراغ يمكن الوصول إليها مع نصائح لتنظيف كفيت، وتقضي مهمة حساسة، وزجاجة بخ مع عالى النقاء H 2 O.
- تسخين ماء الحمام الخارجي لالتألق والحرارة كتلة إلى 37 درجة مئوية.
- بدوره على التألق. وضع برنامج لجمع مضان لجمع CFP إلى الإثارة 430 نانومتر، ممر الموجة 8 نانومتر. مجموعة انبعاث 450 نانومتر - 600 نانومتر، ممر الموجة 4 نانومتر. لجمع YFP فقط عن مراقبة أجهزة الاستشعار (انظر مناقشة) مجموعة الإثارة إلى 490 نانومتر، ممر الموجة 8 نانومتر، ومجموعة الانبعاثات 500-600 نانومتر، ممر الموجة 4 نانومتر. وسوف تستخدم إعدادات جمع CFP للحصول على الطيف الحنق في هذه التجربة.
- وضع اثني عشر 1.5 مل أنابيب microcentrifuge في كتلة الحرارة كما هو مبين في الشكل 2 أدناه. هذه الأنابيب هي أصحاب الأنابيب خلية قسامة (500 ميكرولتر أنابيب microcentrifuge.) ضع قطعة صغيرة من الأنسجة في أصحاب 1 و 7 لتخفيف cuvettes وضعها هنا.
ملاحظة: استخدام cuvettes منفصلة عن حالة غير المعالجة وحالة المخدرات لمنع انتقال التلوث.
الشكل 2. microcentrifuge لأنبوب إعداد والمرجعي الوظيفة في حرارة كتلة كوفيت للعينات غير المعالجة في الموضع 1؛ أنابيب الخلايا قسامة هي في مناصب 2 - 6. كوفيت لعينات المخدرات المعالجة هي في موقف 7؛ أنابيب الخلايا قسامة هي في مواقف 8 - 12. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- ملء أصحاب 2-6 و8-12 مع ~ 750 ميكرولتر من الماء لخلق مصغرة 37 ° C حمام الماء.
- وضع 500 عشرة أنابيب microcentrifuge ميكرولتر لقسامات الخلية إلى حمامات المياه مصغرة (أصحاب 2-6، 8-12). وسيكون لكل أنبوب يكون تكرار الفردي للحالة (5 untreateد، 5 المخدرات المعالجة).
- مراقبة الخلايا للتعبير (راجع الخطوة 3.6).
5. تجربة وجمع البيانات
الشكل 3. التجريبية التخطيطي. دليل مفصل خطوة حكيمة لالتجريبية إعداد والتنفيذ. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
- إشارة الشكل 3 لالتخطيطي التجريبية. عندما الخلايا جاهزة للحصاد، على أساس التعبير البروتين الكشف مع المجهر مضان (انظر مناقشة، الفقرة 4): في غطاء السلامة البيولوجية، وإزالة بلطف ~ 1 مل من وسائل الاعلام، وخلايا resuspend في ثقافتهم مع P1،000 ونقل إعادة تعليق في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
ملاحظة: تجنب استخدام التربسين لأنها قد هضم N-محطة و/أو جيب من أجهزة الاستشعار لهذه العملية من ملزمة. - عد الخلايا لضمان كثافة الخلايا السليمة في إعادة تعليق. تحسين حجم إعادة تعليق لمدة 4 × 10 6 خلية / مل.
- تدور الخلايا في الدلو المتأرجح أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة، 290 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف بعد الطرد المركزي.
- و resuspend بلطف الخلايا في 1 مل العازلة الخليوي (المخزنة عند 37 درجة مئوية) وكرر الخطوة 5.3. خلال تدور الثاني، وجمع 100 ملم قسامة الأسهم المخدرات من -80 درجة مئوية. جعل 1: 100 التخفيف في مخزن المخدرات عن 1 ملم الأسهم العمل والحفاظ على RT.
- بعد الطرد المركزي الثاني، وإزالة وطاف Resuspend الخلايا برفق في 1 مل من الاحتياطي الخليوي (4 × 10 6 خلية / مل). قياس OD 600 من العينة في معمل باستخدام 1 مل من الخلايا و1 مل من الاحتياطي خلية كما فارغة. الاستغناء الخلايا في كوفيت البلاستيك القابل للتصرف ونقل مرة أخرى إلى أنبوب microcentrifuge مباشرة بعد الطيفي.
- من أجل السيطرة على سل untransfectedl حالة الطيف، و resuspend بلطف خلايا untransfected في الواق 1 مل الخليوي مع P1،000 الماصة، إضافة 90 ميكرولتر من الخلايا لكفيت والحصول على الطيف الحنق في الإثارة 430 نانومتر، ممر الموجة 8 نانومتر، والانبعاثات 450-600 نانومتر، ممر الموجة 4 نانومتر. جمع 3-5 تكرار الأطياف مع الطازجة 90 ميكرولتر من الخلايا. الحفاظ على المخزون من الخلايا عند 37 درجة مئوية بين المواصفات، و resuspend بلطف مع P1،000 بين كل قسامة عينة، وشطف كفيت مع عالى النقاء H 2 O بين العينات.
- لظروف تجريبية، قسامة 90 ميكرولتر من خلايا transfected إلى كل من 500 أنابيب ميكرولتر في أصحاب 2-6، 8-12 في كتلة الحرارة. و resuspend بلطف الأسهم من الخلايا مع الماصة P1،000 بين كل قسامة.
- بعد aliquoted الخلايا، إضافة 10 ميكرولتر من الاحتياطي المخدرات لأنابيب 2-6 للعينات حالة غير المعالجة.
- تبدأ التجربة من خلال إضافة 10 ميكرولتر من 1 ملم حل المخدرات في أنبوب 8، بدء موقت العد التنازلي من 10 دقيقة، وبلطف مزيج أنبوب مع P200 الماصة. أنبوب الوثيق والعودة إلى 37° C كتلة الحرارة.
- اختيار فورا أنبوب 2، المزيج بلطف مع P200 (استخدام معلومات جديدة)، إضافة 90 ميكرولتر من التعليق الخلية إلى حالة غير المعالجة كفيت، ومكانها في التألق.
- الحصول على الطيف الحنق في الإثارة 430 نانومتر، ممر الموجة 8 نانومتر، والانبعاثات 450-600 نانومتر، ممر الموجة 4 نانومتر.
- في 9 دقيقة - 10 ثانية، وارتفاع أنبوب 9 مع 10 ميكرولتر من 1 ملم حل المخدرات، بلطف مزيج مع P200 (استخدام معلومات جديدة)، والعودة أنبوب للحرارة كتلة.
- كرر الخطوات 5،10-5،11 مع أنبوب 3 و 5.12 مع أنبوب 10.
- كرر الخطوات 5،10-5،13 في 1 فترات دقيقة (08:10، 07:10، الخ) حتى يتم جمع الأطياف لجميع العينات حالة غير المعالجة، وتمت إضافة دواء لجميع العينات حالة المخدرات. استخدام معلومات سرية جديدة كل خطوة الماصة لمنع انتقال التلوث.
- في 5 دقائق - 10 ثانية، ويبدأ خلط أنبوب 8 (حالة المخدرات) بلطف مع P200 الماصة، إضافة 90 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كوفيت منفصلة لعينة المخدرات المعالجة ومكان في التألق.
- الحصول Fالطيف RET (راجع الخطوة 5.11 لإعدادات).
- كرر الخطوات 5،15-5،16 في 1 فترات دقيقة (04:10، 03:10، الخ) لالمتبقية عينات حالة المخدرات (أنابيب 9-12).
- بعد انتهاء التجربة، وحفظ ملفات المشاريع، اغسل cuvettes مع عالى النقاء H 2 O، وإعادة الأوراق المالية أنابيب للحالة القادمة. الحرص على منع انتقال التلوث في الخطوة غسل. تغيير تلميح على زجاجة O H 2، وكذلك على خط فراغ بين يغسل.
تحليل 6. البيانات
- حفظ الملفات وتصدير البيانات في شكل SPC لاستخدامها في التحليل. غير متوفرة للتنزيل من نشر موقع سيفاراماكريشنان مختبر برامج التحليل.
- إنشاء ملفات مسار برامج التحليل والتي تشمل برامج التحليل (V9، V15)، ملفات عينات untransfected (راجع الخطوة 5.6 لجمع خلية الطيف untransfected)، ملف بيانات الناتج، والقيم مفصولة بفواصل ملفات (CSV) لإدخال البيانات.
- أدخل المعلومات التاليةفي ملف CSV (انظر العينة في الجدول 3) وتعيين الشروط الخاصة بكل عينة، بما في ذلك:
اسم الملف - الفردية الملفات الرسم البياني SPC
مستقبلات - تم اختبار المكلف الذي بناء النوع من الاختزال (على سبيل المثال، Β2)
بيندر - المكلف الذي تم اختباره الببتيد البديل للبناء (على سبيل المثال، S)
ناهض - تعيين دون علاج (N) أو (D) شروط المخدرات المعالجة
الدليل - المجلد المسار الذي يتم حفظ ملفات SPC، التي نظمتها التاريخ عادة
OD - سجلت كثافة ضوئية من عينة من معمل - أدخل أسماء الملفات لعينات untransfected (الخطوة 5.6) إلى طرح العازلة ونثر الضوضاء من العينات.
- أدخل شروط في برنامج التحليل.
- برامج تشغيل لتحليل العينات في غضون الظروف الفردية (V9) وعبر الشروط (V15).
- استبعاد ملفات العينة التي هي القيم المتطرفة واضحة في مجموعة البيانات، أو ضبط الطرح عن طريق زيادة أو خفض قيمة OD من indiviالملفات المزدوجة.
- تصدير البيانات إلى ملف الإخراج للوصول إلى حساب الحنق نسب (525 نانومتر / 475 نانومتر).
- حساب ΔFRET بطرح متوسط نسبة الحنق لحالة غير المعالجة من نسب الحنق الفردية للتعامل (المخدرات) الظروف.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
التخطيطي المعمم من التجربة انشاء ومفصلة التنفيذ في الشكل (3).
من أجل الكشف عن تغيير الحنق في النطاق الديناميكي الضيق من أجهزة الاستشعار، فمن الأهمية بمكان أن تلتزم الفروق الدقيقة في النظام يجب الالتزام بها. جودة خلية أمر حتمي لتعبير البروتين وكذلك الاتساق في أخذ العينات الشكل 1 ملامح الصور من الخلايا المستزرعة تنمو في أحادي الطبقة متناسقة (10X) التي هي الأمثل لتصفيح ستة جيدا وترن...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
النطاق الديناميكي ضيق قياسات الحنق في هذا النظام يعزز ضرورة مراقبة الجودة الحساسة في كل خطوة من هذا البروتوكول. أهم الخطوات لضمان تجربة الحنق الناجحة هي 1) خلية زراعة، 2) ترنسفكأيشن 3) التعبير بروتين و 4) في الوقت المناسب، والتنسيق الدقيق أثناء تنفيذ الفحص.
صحة الخلايا وجودة الصيانة / الطلاء يمكن أن يكون لها تأثير كبير على الضوضاء إشارة إلى النظام التجريبي واعتلال الصحة خلية يمكن أن تجعل من المستحيل للكشف عن أي ت...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل رم من قبل زمالة الجمعية الأمريكية للقلب ما قبل الدكتوراه (14PRE18560010). وقد تم تمويل البحث من قبل جمعية القلب الأمريكية للتنمية عالم غرانت (13SDG14270009) والمعاهد الوطنية للصحة (1DP2 CA186752-01 و1-R01-GM-105646-01-A1) إلى SS
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| B2-AR-10 نانومتر مستشعر الببتيد الغازي | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas / Fisher Sci | FERK0503 | Elute في 2 ملي مولار Tris الشطف عازلة |
| HEK-293T-Flp-n | خلايا Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25٪) | Technologies | 25200056 | |
| DMEM- تقنيات حياة الجلوكوز العالية | 11960-044 | دافئة في 37 درجة ؛ حمام مائي C قبل الاستخدام | |
| FBS ، معتمد ، معطل بالحرارة ، منشأ | أمريكي Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | وسائط مصل مخفضة ؛ أحضره إلى RT قبل الاستخدام |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | موصى به بشدة لتناسقه. أحضره إلى RT قبل الاستخدام |
| FluoroMax 4 | Horiba | استخدم مع برنامج FluorEssence V3.8 | |
| كوفيت كوفيتز | 3 مم Starna | NC9729944 (16.45F-Q-3 / z8.5) | قد يتطلب حامل / محول كوفيت للاستخدام في مقياس الفلور ، متوفر من Starna |
| Sc100-S3 مضخة حمام مائي متداولة ساخنة | فيشر Scientific | 13-874-826 | دافئ إلى 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | دافئ إلى 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام |
| استخدام تقنيات الحياة 10977015 الخالية من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي فائق | في RT | ||
| D (+) - الجلوكوز ، اللامائي | Sigma | G5767 | |
| البروتينين من رئة البقر | Sigma | A1153 | |
| ليوببتين هيميسولفات | EMD | 10-897 | |
| حمض الأسكوربيك L، كاشف الصف | Sigma | A0278 | |
| (-)- isoproterenol (+) -bitartrate | Sigma | I2760 | استخدم aliquot طازجا في كل تجربة |
المراجع
- Malik, R. U., et al. Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells. J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Alexander, N. S., et al. Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release. Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Conklin, B. R., et al. Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation. Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).
- Onaran, H. O., Costa, T. Where have all the active receptor states gone. Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
- Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
- Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells. Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).
- Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
- Stumpf, A. D., Hoffman, C. Optical probes based on G protein-coupled receptors - added work or added value. Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).
- Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
