مقالة منهجية

LED الحرارية تدفق - الجمع بين علم البصريات الوراثي مع التدفق الخلوي

DOI:

10.3791/54707

⸱

ديسمبر 30, 2016

 ,  ,  , 
1Max-Planck Institute for Immunobiology und Epigenetics, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine (SGBM), University of Freiburg, 3Centre for Biological Signaling Studies, BIOSS, University of Freiburg, 4Albert-Ludwigs-Universität, 5Institute for Biology III (Mol. Immunology), Albert-Ludwigs-Universität

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المواد التي يتم التحكم فيها بصريا هي أدوات قوية لدراسة مسارات الإشارات. لتوسيع نطاق التجارب الممكنة ، قمنا بتطوير جهاز لدراسة المواد التي يتم التحكم فيها بصريا في الوقت الفعلي باستخدام قياس التدفق الخلوي: LED Thermo Flow.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
تسمح أدوات الوراثة البصرية

بإجراء تحقيقات وظيفية معزولة لأي جزيء إشارة تقريبا داخل مسارات الإشارات المعقدة. تتمثل العقبة الرئيسية في توصيل الضوء المتحكم فيه إلى عينة الخلية ، وبالتالي فإن الأدوات الأكثر شيوعا للدراسات البصرية الوراثية هي تحليلات الخلايا القائمة على الفحص المجهري والتجارب في المختبر. يتمتع مقياس التدفق الخلوي بمزايا كبيرة مقارنة بالمجهر ، بما في ذلك القدرة على قياس آلاف الخلايا بسرعة بدقة خلية واحدة. ومع ذلك ، لم يتم استخدامه على نطاق واسع بعد في علم البصريات الوراثي. هنا ، نقدم جهازا يجمع بين قوة علم البصريات الوراثي وقياس التدفق الخلوي: LED Thermo Flow. يضيء هذا الجهاز الخلايا بأطوال موجية محددة وشدة الضوء ودرجات الحرارة أثناء قياسات التدفق الخلوي. يمكن بناؤه بتكلفة منخفضة واستخدامه مع مقاييس التدفق الخلوي الأكثر شيوعا. لإثبات فائدتها ، قمنا بتمييز حركية التبديل الضوئي لبروتينات Dronpa في الجسم الحي وفي الوقت الفعلي. يمكن تكييف هذا البروتوكول مع جميع المواد الخاضعة للرقابة بصريا تقريبا ويوسع بشكل كبير مجموعة التجارب الممكنة. والأهم من ذلك ، أنه سيبسط إلى حد كبير اكتشاف وتطوير أدوات بصرية وراثية جديدة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم أدوات علم البصريات الوراثي تكتسب شعبية، في جزء منه لأنها يمكن أن تستخدم لفك الأسلاك من مسارات الإشارات 1-4. وهي تستند إلى قدرة بروتينات photoactivatable تغيير على التشكل وملزمة تقارب عندما مضيئة مع الضوء. دمج هذه البروتينات لعناصر إشارات تسمح لتنظيم محدد من لاعب واحد داخل معقدة مسارات الإشارات بين الخلايا 5-12. وبالتالي، فإن مسار الإشارات يمكن دراستها مع القرار الزماني والمكاني عالية.

معظم الدراسات علم البصريات الوراثي القائم على خلية تستخدم أساليب تعتمد على المجهر جنبا إلى جنب مع زراعة في وجود الضوء، تليها تحليل الكيمياء الحيوية 11،12. في المقابل، تدفق singularizes الكريات الخلايا على طول شعري ويقيس حجم الخلية، تحبب وكثافة مضان. هذا الأسلوب له مزايا كبيرة خلال الفحص المجهري أو البيوكيميائية الطرق، بما في ذلك القدرة على تحليل thousanس من الخلايا في قرار وحيدة الخلية تعيش في وقت قصير جدا. وبالتالي، فمن المستحسن أن الجمع بين علم البصريات الوراثي مع التدفق الخلوي.

على حد علمنا، ليس هناك بروتوكول تأسيس لالتدفق الخلوي علم البصريات الوراثي. إجراء مقبولة على نطاق واسع هو إلقاء الضوء خلايا يدويا من خارج أنبوب تفاعل مع الأجهزة مصباح يدوي. ومع ذلك، والإضاءة اليدوية في تدفق يتطلب الكريات ضوء أن يمر من خلال أنبوب رد فعل، ولتصوير الخلايا الحية، أسطواني، وغرفة للمياه ساخنة. هذا يسبب تشتت الضوء كبير وفقدان للضوء. وعلاوة على ذلك، فإن شدة الضوء التي تقدمها إضاءة يدوية ليست استنساخه بين التجارب (زاوية، والمسافة، الخ) وليس هناك حد عملي لعدد من موجات في تجربة واحدة.

عن طريق بناء جهاز LED الحرارية التدفق، كنا قادرين على التغلب على هذه القيود. مع هذا الجهاز، وخلايا يمكن أن تكون مضيئة مع موجات محددة في درجة الحرارةالطريقة أثناء قياس تدفق cytometric التي تسيطر عليها erature. وهذا يسمح لكميات محددة وقابلة للتكرار للضوء داخل وبين التجارب.

للتدليل على فائدة الجهاز لدينا في الجسم الحي، سجلنا إشارة مضان من Dronpa في الخلايا راموس B خلال photoswitching. وتستمد الخلايا راموس B من سرطان الغدد الليمفاوية بوركيت البشري. Dronpa هو ببروتين موجود كما مونومر، ديمر أو tetramer. في شكله أحادى، فمن غير الفلورسنت. الإضاءة مع 400 نانومتر الخفيفة الحث dimerization وtetramerization ويجعل البروتين الفلوري Dronpa. هذه العملية يمكن عكسها من خلال الإضاءة مع 500 نانومتر الخفيفة. وقد استخدم البروتين Dronpa للسيطرة على وظيفة، والمكان من الإشارات البروتينات 4،13.

هنا، أعربنا عن بروتين Dronpa-رابط-Dronpa في الخلايا راموس B لدراسة photoswitching من Dronpa في قياس التدفق الخلوي. استخدام الجهاز لدينا، كنا قادرين على كفاءة وبتكاثر photoswitch Dronpa أثناء تسجيل كثافة مضان في الوقت الحقيقي. وهذه الطريقة توفر مزايا كبيرة عبر بروتوكولات الإضاءة الحالية مع إضاءة يدوية ويوسع بشكل كبير من ذخيرة تجريبي للأدوات علم البصريات الوراثي والمركبات القفص. استخدام الجهاز لدينا سيسهل بشكل كبير والإسراع في اكتشاف وتطوير أدوات علم البصريات الوراثي جديدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم وبناء جهاز

  1. تجارب رائدة
    ملاحظة: شدة الضوء المطلوبة لعلم البصريات الوراثي أداة وخلية نوع معين قد تختلف بشكل كبير. التجارب الرائدة مع نماذج مفيدة لتقدير الحد الأدنى من شدة الضوء اللازمة. الأداة علم البصريات الوراثي المستخدمة في التجارب التالية هي عبارة عن اندماج بناء Dronpa-رابط-Dronpa. تم الحصول على تسلسل Dronpa تجاريا (انظر قائمة من المواد). تم استنساخ ورابط طويلة بين اثنين من سلاسل Dronpa للسماح للبناء أعرب لتشكيل dimers ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ (وبين الجزيئات). الخطوات الموضحة أدناه يمكن أن تتكيف مع العديد من الأدوات علم البصريات الوراثي الأخرى أو المواد الخاضعة للرقابة بصريا.
    1. تنبيغ الخلايا الليمفاوية B راموس مع Dronpa-رابط-Dronpa تحتوي على بناء باتباع إرشادات الشركة المصنعة لتنبيغ باستخدام طاف تحتوي على فيروسات، من خلايا التعبئة والتغليف. الحصاد وخلايا العد وفقا لمرحلة ما قبلنشرت viously بروتوكول 13.
    2. Resuspend الخلايا بتركيز 1 × 10 6 / مل في المتوسط (RPMI 1640، 10٪ الحرارة المعطل FCS، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / مل البنسلين، و 100 U / مل الستربتومايسين، و 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول) ونقلها إلى أنبوب زجاجي FACS.
    3. إدراج أنبوب إلى قياس التدفق الخلوي وقياس كثافة مضان من Dronpa (قناة GFP) 14،15.
    4. ارتداء النظارات الواقية لجميع المزيد من الخطوات لحماية العينين من موجات ربما ضارة.
    5. يدويا وضع ضوء 500 نانومتر الصمام على السطح الخارجي للأنبوب ونستمر في قياس كثافة مضان من Dronpa.
    6. زيادة عدد و / أو شدة أضواء LED حتى تنخفض Dronpa كثافة مضان.
    7. يدويا وضع ضوء 400 نانومتر الصمام على السطح الخارجي للأنبوب ونستمر في قياس كثافة مضان من Dronpa.
    8. زيادة عدد و / أو شدة أضواء LED حتى فلوو Dronparescence زيادة كثافة.
    9. استخدام ما لا يقل عن العديد من أضواء LED لبناء الجهاز كما يتوقع أن تكون ضرورية من photoswitching في خطوات 1.1.5 و 1.1.7.
  2. بناء الجهاز
    ملاحظة: تم بناء الجهاز عن طريق متجر بالقطع المهنية، وArbeitsgruppe تكنيك من جامعة فرايبورغ. والعرف معظم أنحاء وغير متوفرة تجاريا. وصفت الأبعاد الدقيقة من كل جزء في أرقام 1 و 2. لتوضيح تجميع هذا الجهاز، التكميلية فيديو 1 يتم توفير وموصوفة أهم الخطوات الأساسية أدناه.
    1. مطحنة قطعة ومن البولي فينيل كلورايد (PVC) مع القياسات الدقيقة هو مبين في الشكل 1A.
    2. إدراج أضواء LED في حفر ثقوب في قطعة ووختم كل ثقب مع الغراء بولي كلوريد الفينيل لمنع تسرب المياه.
    3. توصيل المصابيح على محول متعدد القنوات (كل طول موجي يجب أن تحتل chann منفصلشرم) مع انتاج الطاقة القابلة للتعديل 0-29 مللي أمبير.
    4. إرفاق غمد الخارجي (ب) مع 3 مسامير لقطعة وكما هو مبين لحماية المصابيح من الأضرار المادية.
    5. لتكون قادرة على توصيل الجهاز إلى مضخة المياه، والغراء في لقطات أنبوب (C) في حفر ثقوب في قطعة و(يصور في الشكل 1A، المقطع العرضي Y: 9 ملم و 61.5 ملم) باستخدام الغراء بولي كلوريد الفينيل.
    6. قطع أنبوب زجاجي طويل 58.5 ملم (D1).
    7. تصنيع قطع D2 و D3 من زجاجي كما هو مبين في الشكل 2.
    8. الغراء قطعة D3 إلى أسفل D1 مع زجاجي الغراء.
    9. إرفاق المطاط يا الدائري إلى قطعة D2 والغراء إلى أعلى D1 مع زجاجي الغراء.
      ملاحظة: القطع D1 و D2 و D3 معا تشكل قطعة د.
    10. إدراج قطعة D في قطعة ومع 3 مسامير.
    11. اختبار جهاز لتسرب الماء قبل تطبيق السلطة للمحول.

2. قياس حركية لأداة علم البصريات الوراثي

  1. إعداد الخلايا
    1. ثقافة الخلايا راموس B في RPMI المتوسطة (RPMI 1640، و 10٪ الحرارة المعطل FCS، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / مل البنسلين، و 100 U / مل الستربتومايسين، و 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول) في كثافة 3- 10 × 10 6 خلية / مل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    2. حصاد الخلايا راموس B عن طريق الطرد المركزي في 350 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. عد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور باتباع إرشادات الشركة المصنعة و resuspend 1-5 × 10 6 خلايا في 600 ميكرولتر المتوسطة.
    4. نقل الخلايا إلى أنبوب FACS الزجاج، ووضعها على الجليد وحمايتها من ضوء حتى القياس.
  2. إعداد الكريات تدفق والجهاز.
    1. وصل الجهاز إلى مضخة مياه ساخنة وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
    2. عند استخدام أنابيب زجاجية نظام مراقبة الأصول الميدانية، تبادل سوداء يا الدائري من قياس التدفق الخلوي مع المطاط يا الدائري وبالإضافة إلى تطبيق غرام السيليكونسهولة.
  3. قياس
    1. إدراج بعناية الزجاج FACS أنبوب في الجهاز وتوصيله إلى قياس التدفق الخلوي (الشكل 3).
    2. بدء تشغيل قياس وتسجيل Dronpa كثافة الفلورسنت (قناة GFP).
    3. إلقاء الضوء على عينة الخلايا مع 400 نانومتر أو 500 نانومتر الخفيفة على التوالي وسجل كثافة مضان Dronpa (قناة GFP).
  4. تحليل البيانات
    1. تحليل البيانات التجريبية مع تدفق مناسب الكريات البرمجيات. مؤامرة مبعثر إلى الأمام ضد مبعثر sideward وبوابة الخلايا الحية. رسم كثافة مضان Dronpa مع مرور الوقت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام التدفق الحراري LED مع عداد الكريات تدفق

جوهر الوظيفي للجهاز هو غرفة اسطوانية يتم ترتيب أضواء بطريقة دائرية لافتا إلى الداخل التي الصمام. هذه القاعة يمكن توصيل إمدادات المياه والمضخات، والذي يسمح للسيطرة على درجة حرارة المصابيح، فضلا عن عينة الخلية. يتم توصيل المصابيح على المحولات وبالتالي شدة الضوء لكل طول موجي يمكن السيطرة عليها بشكل فردي. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والحرارية تدفق الصمام هو أداة مبتكرة لدراسة أدوات علم البصريات الوراثي في ​​عداد الكريات التدفق.

حتى الآن، تم مضيئة عينات علم البصريات الوراثي فقط مع الليزر المجهر أو الأجهزة مصباح يدوي 11،12. اعتمادا على زاوية ومسافة المصباح للعينة، ومن المتوقع تقلب كبير في كمية الإضاءة بين التجارب. وعلاوة على ذلك، هناك حد اقصى لعدد من البطاريات يمكن لشخص واحد يعمل في تجربة. وهذا يحد من ذخيرة التجريبية والتكاثر. وتم ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر J. Schmidt من جامعة فرايبورغ على بناء الجهاز. نشكر P. Nielsen و D. Medgyesi على دعمهم وقراءتهم النقدية لهذه المخطوطة. تم دعم هذه الدراسة من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft من خلال SFB746 ومبادرة التميز التابعة لمؤسسة البحوث الألمانية (GSC-4 ، مدرسة Spemann للدراسات العليا).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب زجاجي FACSثيرمو فيشر العلمي ؛ والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية14-961-26أنابيب زجاجية من البورسليكات 12x75 مم
مقياس التدفق الخلويBD Bioscienceg ؛ هايدلبرغ ، ألمانيافورتيسا الثانيمن النظام الخاص
Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-NAddgene ؛ كامبريدج ، الولايات المتحدة الأمريكية41645
PolyJetSignaGen ، روكفيل ، الولايات المتحدة الأمريكيةSL100688
LED 505 نانومترAvago Technologies ؛ Boeblingen ، ألمانياHLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 نانومترAvago Technologies ؛ Boeblingen ، ألمانياUV5TZ-400-15
أنبوب زجاجي 15 ممMaertin ؛ فرايبورغ ، ألمانيا76999
زجاج شبكي 3 ممميرتين ؛ فرايبورغ ، ألمانيا692230
زجاج شبكي 2.5 ممميرتين ؛ فرايبورغ ، ألمانيا692225
زجاج شبكي 1.5 ممميرتين. فرايبورغ ، ألمانيا692215
بلاط PVC 5 مممارتين ؛ فرايبورغ ، ألمانيا690020.005
بلاط PVC 6 مممارتين ؛ فرايبورغ ، ألمانيا690020.006
كتلة PVC 50 مممارتين ؛ فرايبورغ ، ألمانيا690020.050
RPMIInvitrogen ، Life Technologies ؛ دارمشتات ، ألمانيا61870-010
2-MercaptoethanolEMD ؛ ألمانيا805740
FCSPAN Biotech; Aidenbach ، ألمانياP30-3302
Penicillin / Strptomycin (10،000 U / mL)Invitrogen ، Life Technologies ؛ دارمشتات ، ألمانيا15140-122
Acrifix زجاجي الغراءEvonic الصناعات ، إيسن ، ألمانيا1R0192
Tangit PVC-U الغراءHenkel ، D & uuml ؛ سلدورف ، ألمانيا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
  2. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
  3. Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
  4. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
  5. Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
  6. Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898(2015).
  7. Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
  8. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925(2014).
  9. Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
  10. Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
  11. Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
  12. Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
  13. Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
  14. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  15. Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).
  16. Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Optogenetics Flow CytometryLED Thermo FlowPhotoswitching KineticsDronpa ProteinsFluorescence IntensityLight IntensityWavelength LEDsFlow Cytometric MeasurementsCell Signaling PathwaysRamos B Lymphocytes

مقالات ذات صلة