نصف هنا نموذج فأر مراسل معدل وراثيا لتصور الخلايا المنتجة ل IL-22 داخل أنسجة الفئران المختلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة لتتبع موقع السيتوكينات الأخرى أو بروتينات السكرتير في الفأر.
مقالة منهجية
نصف هنا نموذج فأر مراسل معدل وراثيا لتصور الخلايا المنتجة ل IL-22 داخل أنسجة الفئران المختلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة لتتبع موقع السيتوكينات الأخرى أو بروتينات السكرتير في الفأر.
وقد استخدمت الفئران مراسل نطاق واسع لمراقبة توطين التعبير عن الجينات المستهدفة. ويركز هذا البروتوكول على وضع استراتيجية لإنشاء نموذج جديد الماوس مراسل المعدلة وراثيا. لقد اخترنا لتصور انترلوكين التعبير الجيني (IL) 22 لأن هذا خلوى ديه الأنشطة الهامة في الأمعاء، حيث أنه يساهم في إصلاح الأنسجة التالفة من الالتهابات. أنظمة مراسل توفر مزايا كبيرة على غيرها من أساليب تحديد المنتجات في الجسم الحي. في حالة IL-22، وكانت دراسات أخرى معزولة أولا الخلايا من الأنسجة ومن ثم إعادة حفز-الخلايا في المختبر. IL-22، الذي يفرز بشكل طبيعي، كان محاصرا داخل الخلايا باستخدام المخدرات، وكان يستخدم تلطيخ الخلايا إلى تصور ذلك. ويحدد هذا الأسلوب خلايا قادرة على إنتاج IL-22، ولكنها لا تحدد ما إذا كانوا يفعلون ذلك في الجسم الحي. تصميم مراسل يشمل إدخال جين لبروتين فلوري (tdTomato) في الجين IL-22 في مثل هذا واذ أن بروتين فلوري لا يمكن أن يفرز وبالتالي لا يزال محاصرا داخل الخلايا المنتجة في الجسم الحي. ويمكن بعد ذلك المنتجين الفلورسنت أن تصور في أقسام الأنسجة أو خارج الجسم خلال تحليل التدفق الخلوي. وشملت عملية البناء الفعلية لمراسل recombineering كروموسوم اصطناعي البكتيرية التي تحتوي على الجينات IL-22. ثم تم عرض هذا الكروموسوم هندسيا في جينوم الفأر. وقد لوحظ التماثل الساكن IL-22 تعبير المراسل في أنسجة مختلفة الماوس، بما في ذلك الطحال والغدة الصعترية، والعقد اللمفاوية، والتصحيح باير ل، والأمعاء، من خلال تحليل التدفق الخلوي. وقد الناجم عن التهاب القولون عن طريق الخلايا التائية (CD4 + CD45RBhigh) نقل، وتصور التعبير مراسل. كانت خلايا T إيجابية الحالي لأول مرة في الغدد الليمفاوية المساريقي، وبعد ذلك تراكمت داخل الصفيحة المخصوصة الأمعاء والقولون الأنسجة الصغيرة البعيدة. الاستراتيجية باستخدام البكالوريا أعطى التعبير مراسل جيدة الدقة مقارنة IL-22 مورينداتاهيتيانونيسيون، وأنه هو أبسط من الإجراءات تدق في.
نوع محدد خلية التعبير عن الجينات مراسل مفيد لتحديد الخلايا معربا بنشاط الهدف في الأنسجة تحت الدول التماثل الساكن وإرتباك. كما يسمح لتنقية هذه الخلايا، التي لا تزال قابلة للحياة، لدراسة خصائص الأخرى. وقد استخدمت الفئران مراسل في توضيح آلية عمل لالسيتوكينات محددة، عوامل النسخ، والعناصر التنظيمية. الاستراتيجيات السابقة 1، 2، 3 اعتمدت إلى حد كبير على ضرب مراسل في مكان الهدف في كروموسوم الماوس، وهو إجراء يستغرق وقتا طويلا ومكلفا. وهكذا، فإن أبسط طريقة لتوليد الفئران مراسل أمر مرغوب فيه.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وتلقى جميع الحيوانات الرعاية المناسبة وفقا للإجراءات التجريبية المحددة في دليل عام 2011 لرعاية واستخدام الحيوانات لجنة مختبر المختبر الوطني فريدريك لأبحاث السرطان.
1. جيل من الفئران مراسل IL-22-tdTomato التي كتبها BAC Recombineering
ملاحظة: يجب أن تكون الفئران فاقد الوعي ولا تتحرك استجابة لحافز الضارة. تعقيم المنطقة الجراحية مع 70٪ من الإيثانول وتعقيم جميع الأدوات الجراحية باستخدام معقم الزجاج حبة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم إنشاء الفئران IL-22 مراسل التحوير باستخدام recombineering لتعديل كروموسوم اصطناعي البكتيرية تحمل موضع IL-22. ويبين الشكل 1 رسم تخطيطي للناقلات pBACe3.6 التي تحتوي على الجين sacBII، علامة إيجابية للاختيار، والكلورامفينيكول المضادات الحيوية المقاومة الجين 11. بعد إدخال tdTomato في اكسون 1، تعطلت تسلسل إشارة الببتيد، كما هو مبين في الشكل 2. وهكذا، كان محاصرا مراسل tdTomato داخل الخل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
IL-22 يلعب دورا أساسيا في الفطري دفاع المضيف والأنسجة التجديد. وقد تم تحديد IL إنتاج 22 الخلايا خارج الجسم عن طريق تلطيخ الخلايا. ومع ذلك، فإنه لا يزال من الصعب تتبع التعبير IL-22 في الموقع، سواء في الحالة العادية أو في حالات الالتهابات. يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لتطوير IL-22 مراسل نموذج الفأر، والتي تمكننا من حصر الخلايا، معربا عن مراسل في الجسم الحي. تم إدراج الترميز TdTomato مراسل الجين في موضع IL-22 في الموقع الذي يعطل تسلسل إشارة. هذه النتائج ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
نشكر كيلي سيارا وميغان كاروان على المساعدة الفنية للحيوان ، وكاثلين نوير وروبرتا ماثاي للمساعدة في قياس التدفق الخلوي ، ودونا بوتشر وميريام ر. أنفر لتحليل علم الأمراض. تم دعم هذا المشروع بمنحة من مؤسسة Ely and Edythe Broad Foundation (إلى Scott Durum) وتم تمويله كليا أو جزئيا بأموال فيدرالية من المعهد الوطني للسرطان ، المعاهد الوطنية للصحة ، بموجب رقم العقد. HHSN261200800001E (MRA).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| RP23-401E11 BAC | ثيرمو فيشر العلمي | RPCI23. C | تحتاج معرف الجين: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB مرق | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1 لتر: 10 جم SELECT Peptone 140 ، 5 جم مستخلص الخميرة SELECT ، 5 جم كلوريد الصوديوم ؛ |
| مضاد للفأر CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| مضاد للفأر CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| مضاد للفأر CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| مضاد للفأر CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| مضاد للفأر RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS ، خال من الكالسيوم ، بدون مغنيسيوم ، لا يحتوي على فينول أحمر | حراري فيشر 14175145 العلمي | KCl ، KH2< / sub>PO4< / sub> ، Na 2< / sub>HPO4< / sub> ، NaHCO3< / sub> ، كلوريد الصوديوم ، D-Glucose | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK محلول المحلول | الحراري فيشر العلمي | A1049201 | |
| Percoll | GE علوم الحياة للرعاية الصحية | 17-0891-01 | |
| كولاجيناز D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (البروتياز المحايد ، الدرجة الثانية) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 مجهر مضان مقلوب | أوليمبوس | اسأل عن عرض أسعار | |
| نيكون Eclipse 80i مجهر | نيكون | اسأل عن عرض أسعار | |
| شاكر دينال | علم المجهر الإلكتروني | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | اسأل عن عرض أسعار | |
| LSRII SORP / قياس التدفق الخلوي | Becton, Dickinson and Company | اسأل عن عرض أسعار |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن