مقالة منهجية

التصوير من التعديلات خلية الشكل والحركة الخلية في ذبابة الفاكهة المعيدة عن طريق DE-كادهيرين مراسل الذباب المعدلة وراثيا

DOI:

10.3791/54764

⸱

ديسمبر 29, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Biotechnology and Genetic Engineering Department, Jahangirnagar University, 2JT Biohistory Research Hall, 3Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University, 4Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 5Institute of Genetics and Animal Breeding of the Polish Academy of Sciences

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نصف إجراء لالتقاط صور حية لذبابة الفاكهة المعدة. وقد مكننا هذا من فهم الانقباض القمي الذي ينطوي عليه التطور المبكر بشكل أفضل وتحليل الآليات التي تحكم الحركات الخلوية أثناء تعديل بنية الأنسجة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكون المعيدة هي أول مجموعة من الفعاليات الحيوية شكليا التي تحدث أثناء التطور الجنيني من الحيوانات متعددة الخلايا مثل ذبابة الفاكهة. يتم التعرف على هذا التغيير الصرفي أيضا الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT). ويرتبط ديسريغولاتيون من EMT يعانون من التليف والانبثاث السرطان. وهناك أدلة الناشئة التي EMT مسيطر عليها من قبل عدد من الآليات الجزيئية. على هذا النحو، فإن العديد من الجينات الرئيسية التي تتحكم في انقباض قمي ومن المعروف أيضا أن يكون من العوامل الهامة في EMT لوحظ في الانبثاث السرطان. مثل EMT خلال ذبابة الفاكهة تكون المعيدة، الخلايا الظهارية يمكن أن يتسبب في تغيير شكلها وإعادة برمجتها لإعادة توجيه مصير خلية تجاه مختلف أنواع الخلايا الأخرى. هنا نقدم طريقة التصوير قوية من ذبابة الفاكهة تكون المعيدة لفحص بدء الحركات الخلوية التخلق وتحديد مصير الخلايا خلال هذه المرحلة من التطور الجنيني. باستخدام هذه الطريقة، أن نحدد جالذراع إعادة ترتيب في وقت تكون المعيدة وإظهار أهمية انقباض قمي خلال المعيدة باستخدام GFP المسمى DE-كادهيرين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكون المعيدة هي أول مجموعة من الفعاليات الحيوية شكليا التي تحدث أثناء التطور الجنيني من الحيوانات متعددة الخلايا مثل ذبابة الفاكهة 1،2. ومن المثير للاهتمام، شواهد تشير إلى أن هذه العملية ينظم من خلال التفاعل بين الآليات الميكانيكية والجزيئية 3. وعلاوة على ذلك، هو تورط الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT)، وهي عملية حاسمة في تكون المعيدة، وأيضا في عمليات الأمراض البشرية مثل سرطان خبيث 4-8. على هذا النحو، فإن العديد من الجينات التي تتحكم في انقباض قمي ومن المعروف أيضا أن تكون العوامل الرئيسية في EMT لوحظ في سرطان خبيث 9. وهكذا، انقباض قمي في وقت تكون المعيدة هو نموذج ممتاز للتحقيق في الآليات التنظيمية المشار إليها وتعزيز فهمنا لورم خبيث من السرطان. والاستفادة من هذه التقنية هو أن نتمكن من مراقبة حركة الخلية في وقت تكون المعيدة في الوقت الحقيقي، وبالتالي، سنكونقادرة على فحص الجينات المسؤولة عن تكون المعيدة وكذلك الانبثاث سرطان.

على الرغم من أن غير معروف نسبيا، ويعتقد التصاق الخلية الى خلية للعب دور مركزي في انقباض القمي 1. علم الوراثة ذبابة الفاكهة هي مناسبة تماما للتحقيقات واحدة على مستوى الخلية استكشاف الآليات الجزيئية التنظيمية. وهذا النموذج سوف تمكننا من كشف أهمية انقباض قمي خلال المعيدة. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لفحص الجينات المسؤولة في الانبثاث السرطان. والتقاط الصور الحية من ذبابة الفاكهة تكون المعيدة مزيد مكنتنا من فهم بمزيد من التفصيل الآليات الجزيئية التي تحكم إعادة ترتيب الأنسجة. هنا، ونحن نقدم وصفا شاملا لطريقة بسيطة لتحقيق ذلك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: الذباب المعدلة وراثيا المستخدمة في هذه الدراسة ما يلي: DE-نذل :: GFP 10.

1. إعداد أبل لوحة

  1. تحضير خليط من 12.5 غ أجار، 125 مل 100٪ المتاحة تجاريا عصير التفاح، 12.5 غرام جلوكوز، و 375 مل H 2 O. حرارة المزيج في الميكروويف وسكبه في 3 سم طبق ثقافة الخلية. تخزين الخليط في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل.
  2. بعد إعداد لوحة التفاح، إضافة طبقة رقيقة من معجون معجون الخميرة على أعلى من ذلك للسماح للالذباب لوضع البيض.

2. الأجنة إعداد وبروتوكول تصوير لايف

  1. وضع حوالي 50 الذباب (25 ذكور و 25 إناث) في زجاجة للتزاوج ووضع البيض في وقت لاحق بين عشية وضحاها على لوحة التفاح المشمولة في خميرة تعجن. تعيين لوحة عصير التفاح في فم الزجاجة. إبقاء زجاجة رأسا على عقب في حاضنة. التفاف الزجاجات البلاستيكية الأسهم ذبابة الفاكهة بورق الألمنيوم للمطالبة عشرالبريد الذباب لوضع المزيد من البيض.
  2. في صباح اليوم التالي، تحل محل القديمة لوحة عصير التفاح مع واحدة جديدة.
  3. اسمحوا الذباب تضع البيض لمدة 3 إلى 4 ساعات بواسطة التفاف زجاجة مع رقائق الألومنيوم.
  4. بعد ثلاث إلى أربع ساعات، وجمع الأجنة في مصفاة الجنين من لوحة عصير التفاح باستخدام فرشاة أو القطن سيئة وغسلها مع برنامج تلفزيوني. غسل الأجنة 2-3 مرات مع برنامج تلفزيوني في أطباق ثقافة 12-جيدا.
  5. Dechorionate الأجنة مع التبييض 50٪ لمدة 5 دقائق في أطباق ثقافة 12-جيدا.
  6. بعد عملية dechorionation، وغسل الأجنة 2-3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
  7. نقل الأجنة إلى صحن ثقافة الخلية 3 سم تحتوي على برنامج تلفزيوني ثم اختر المرحلة 5 الأجنة تحت المجهر استنادا إلى مستوى من الشفافية في حدودها. ماصة للأجنة نظموا باستخدام 200 ميكرولتر ماصة.
  8. بعد ذلك، وضع اثنين من الأجنة المختارة على ساترة الزجاج، وإزالة الزائد برنامج تلفزيوني مع المناديل الورقية الملتوية ناعما. توجيه الأجنة الجانب الظهري حتى علىساترة باستخدام المناديل الورقية الملتوية ناعما. بعد ذلك، ونعلق الأجنة إلى ساترة الزجاج مع الشحوم السيليكون باستخدام إبرة رفيعة والمناديل الورقية الملتوية.
  9. إضافة قطرة صغيرة من زيت الهالوكربون 700 على الأجنة ووضع ساترة تحتوي على أجنة رأسا على عقب على الشريحة بادئة، وترك بعض المساحة في أسفل الشريحة.
  10. فحص الأجنة باستخدام نظام متحد البؤر التصوير، والأرجون / 488 ليزر، وهدف النفط الغمر (63X).
    ملاحظة: تحديد الجنين في هذه المرحلة التنموية المناسبة مهمة لالتقاط الصور لهذا الحدث تكون المعيدة. في ظل هذه الظروف، ومراقبة تقريبا جميع الأجنة تتطور عادة ما يصل إلى ما لا يقل عن مرحلة 14. الجنين تحليلها يمكن تربيتها مواصلة تطوير كشخص بالغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم لك مجموعة من الأحداث تكون المعيدة للجنين ذبابة الفاكهة ولمحة عامة عن إجراءات إعداد الجنين (الشكل 1). وصفت أغشية الخلايا باستخدام DE-كادهيرين :: GFP وأن يتم التصوير المباشر لحركات الخلية في وقت تكون المعيدة في ذبابة الفاكهة (الشكل 2). منذ الذباب DE-كادهيرين GFP تسمح لنا تصور تقاطعات الالتزام خلية، ونحن قادرون على تتبع قمي الشكل والحركات التي تستخدم هذا النظام الخلية. الأهم من ذلك، فإن هذا النظام ك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أننا أبلغنا سابقا عن إجراء مماثل لالتقاط صور حية لعملية المعدة في Drosophilla1 ، إلا أن الطريقة التي وصفناها هنا مفصلة وسهلة التتبع لتعبير الكاديرين الداخلي ، وبالتالي فهي مفيدة جدا للفحص الجيني للعوامل الرئيسية المشاركة في المعدة. لتحقيق أقصى قدر من النجاح في إجراء التصوير هذا ، من الضروري استخدام شريحة ذات مسافة بادئة. يتسبب الضغط الميكانيكي أحيانا في الموت الجننيني. لذلك ، من المهم أيضا التعامل مع الأجنة بلطف قدر الإمكان لأن أي إجهاد ميكانيكي يمكن أن يعطل عملية المعدة الجنينية. سيؤدي ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة Astellas لأبحاث اضطرابات التمثيل الغذائي (HT) ، ومؤسسة Takeda Science Foundation (HT) ، والبرنامج المدعوم من MEXT لمؤسسة البحوث الاستراتيجية في الجامعات الخاصة (HT).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
زيت الهالوكربون 700SigmaMKBH 5726
فراغ الشحوم سيليكونبيكمان335148
غطاء زجاجي سمك زجاج ماتسوناميرقم 124 - 36 مم
زجاجات الجنينCorningCorning3477
زجاجات مخزون ذبابة الفيلا البلاستيكيةHitecMKC-100
DE-Cadherin ضربة في الذبابREF (10)

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
  2. Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
  3. Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
  4. Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3(2013).
  5. Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
  6. Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
  7. Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
  8. Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
  9. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
  10. Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GFP

مقالات ذات صلة