يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

وضع العلامات لسرطان الثدي Xenografts المستمدة من المريض مع يمكن عزوها مراسلون لنمو الأورام والدراسات الانبثاث

11.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54944

⸱

نوفمبر 30, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

في هذه المقالة

ملخص

نحن تصف طريقة لوضع العلامات مستقر من xenografts المستمدة من المريض (PDXs) مع جزيئات lentiviral التعبير عن بروتين ووسيفيراز صحفيين الأخضر الفلورسنت. وتسمح هذه الطريقة لتتبع نمو PDXs في الموقع الأساسي، وكذلك الكشف عن الانبثاث عفوية والتجريبية استخدام في أنظمة التصوير الجسم الحي.

الملخص

يعد استخدام النماذج قبل السريرية لدراسة بيولوجيا الورم والاستجابة للعلاج أمرا أساسيا لأبحاث السرطان. غالبا ما تفشل خطوط الخلايا البشرية الراسخة ، والعديد من نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، في تلخيص الجوانب الرئيسية للأورام الخبيثة البشرية. وبالتالي ، يتم تطوير نماذج بديلة تمثل بشكل أفضل عدم تجانس أورام المرضى ونقائلهم. أصبحت نماذج الطعم الغريب المشتق من المريض (PDX) والتي يتم فيها تطعيم عينات الورم المستقطوحة جراحيا في الفئران التي تعاني من نقص المناعة بديلا جذابا حيث يمكن زرعها عبر أجيال متعددة ، وتعكس بشكل أكثر كفاءة عدم تجانس الورم من الطعوم الغريبة المشتقة من خطوط الخلايا السرطانية البشرية. يتمثل أحد القيود المفروضة على استخدام PDXs في صعوبة نقلها أو تحويلها لإدخال مراسلين يمكن تتبعهم أو التلاعب بالتعبير الجيني. يصف البروتوكول الحالي طرقا لنقل الخلايا السرطانية المنفصلة من PDXs بكفاءة نقل عالية ، واستخدام PDXs المسمى للنماذج التجريبية لنقائل سرطان الثدي. يوضح البروتوكول أيضا استخدام PDXs المسمى في نماذج ورم خبيث تجريبية لدراسة عملية استعمار الأعضاء في الشلال النقيلي. يمكن تصور النقائل إلى أعضاء مختلفة وقياسها بسهولة باستخدام التصوير الحيوي في الحية ، أو تعبير GFP أثناء التشريح وفي الأعضاء المستأسولة. توفر هذه الأساليب أداة قوية لتوسيع نطاق استخدام أنواع متعددة من PDXs لأبحاث ورم خبيث.

المقدمة

تطوير xenografts المستمدة من المريض ورم (PDXs)، حيث يتم المغروسة عينات الورم جراحيا مقطوعة مباشرة في الفئران المناعية للخطر، ويقدم العديد من المزايا نماذج طعم أجنبي خط الخلية القياسية، ويمثل تقدما كبيرا في مجال أبحاث السرطان 1،2. PDXs يمكن الحفاظ على وتوسيعها من خلال الممرات المتعاقبة مع تغيير الحد الأدنى من الخصائص الوراثية والبيولوجية للورم نمت في الممر الأول. ويعكس بشكل أدق عدم التجانس ورم من xenografts المستمدة من خطوط الخلايا السرطانية البشرية 3-8. تستخدم الآن هذه النماذج على نطاق واسع باعتباره منصة لإضفاء الطابع الشخصي علاجات السرطان 9،10، كمنصة قبل السريرية في تطوير العقاقير 6،11 وكأداة تجريبية لدراسة سرطان علم الأحياء 4،12.

تزرع معظم PDXs ونشر تحت الجلد، والذي يسمح عمليا قياس نمو الورم أكثر من مرة باستخدام الفرجار. ومع ذلك، وكان المرض المنتشر أكثر صعوبة للنموذج باستخدام PDXs. على وجه التحديد لسرطان الثدي، وقد وصفت xenografts مع قدرة النقيلي إلى أجهزة مختلفة 3،5،13، ولكن وتيرة نشر التلقائي لمواقع النقيلي منخفضة للغاية. حيث ذكرت، وتحديد وتقدير العبء المنتشر يعتمد في الفحص النسيجي شاقة من الأجهزة المستهدفة بعد الوفاة. خطوط الخلايا السرطانية معربا عن إضاءة الحيوية (وسيفيراز، لوك) أو الفلورسنت وتستخدم (البروتين الفلوري الأخضر، GFP) للصحفيين الجين عادة في النماذج التجريبية الانبثاث سرطان الثدي إلى الدماغ والرئة والعظام والكبد بعد داخل القلب، الذيل الوريد، intrafemoral وحقن الطحال 14-16. في حين أن هذه النماذج تجاوز نشر من الأورام الأولية، فهي قيمة لدراسة آليات مع الأجسام الجهاز والاستعمار النقيلي. ومع ذلك، يمكن أن الخلايا المشتقة من الأورام وPDXs المريض الأساسية وتدني ترنسفكأيشن أو معدلات التنبيغ النقيبز الإجراءات القياسية. بديل واحد هو لإنشاء خطوط الخلايا المشتقة PDX في المختبر 17، والتي يمكن بعد ذلك وصفت باستخدام بروتوكولات زراعة الأنسجة التقليدية. هذا النهج ومع ذلك، ليست مناسبة لوصفها معظم PDXs، الذي خط خلية الاشتقاق هو الصعب، ويمكن تغيير النمط الظاهري للخلايا. هنا نقدم بروتوكول للتنبيغ الخلايا السرطانية فصلها PDX مع ناقلات lentiviral مناسبة للتصوير في الجسم الحي. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف الانبثاث التجريبي باستخدام الحقن داخل القلب من خلايا PDX فصلها لوك-GFP المسمى في الفئران المناعة.

قد سبق ووصف البروتوكول الأساسي لتنبيغ organoids فصل PDX مع الجينات مراسل التعبير عن الفيروسة البطيئة 18. في البروتوكول الحالي وصفنا طرق إضافية لإثراء للخلايا السرطانية البشرية والحصول على قرب 100٪ كفاءة ترنسدوكأيشن، فضلا عن استخدام PDXs المسمى للكشف عن سرطان الثدي التجريبيالانبثاث. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لوصفها أنواع متعددة من السرطان من PDXs مع مختلف علامات الانارة والفلورسنت وكذلك تعديل التعبير الجيني (أي ضربة قاضية shRNA الجينات من الفائدة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع الخطوات التي تتطلب استخدام الحيوانات في هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية من جامعة كولورادو جنة أخلاقيات البحوث الحيوانية (IACUC).

1. إعداد الآلات، وسائل الإعلام الثقافة والكواشف أخرى

  1. mammosphere إعداد 100 مل سائل الإعلام التي تحتوي التعديل النسر متوسطة وهان المتوسطة Dulbecco وF-12 (DMEM / F12) (1: 1)، والتعليم الأساسي الخلايا الليفية عامل النمو (bFGF، 20 نانوغرام / مل)، عامل نمو البشرة (EGF، 10 نانوغرام / مل )، الهيبارين (4 ميكروغرام / مل)، 1X B27، البنسلين (100 U / مل)، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل). جعل وسائل الإعلام في ظروف معقمة وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  2. إعداد عازلة تخصيب الظهارية (EEB) تحتوي على برنامج تلفزيوني الرقم الهيدروجيني 7.2، 0.5٪ الأبقار مصل الزلال (BSA)، 2 مم EDTA. تعقيم تصفية وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  3. جعل 5 مل قسامات العازلة الهضم في العقيمة 15 مل أنابيب مخروطية ومخزن في -20 درجة مئوية لمدة أشهر. في الليلة التي سبقت عملية الهضم الورم، عازلة تحسن الهضم (5 مل لكل 500 ملغورم) على الجليد، في 4 درجات مئوية. إضافة مزيج من المضادات الحيوية مضاد فطري 1X قبل الاستخدام.
  4. الأوتوكلاف (121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) على الأقل ملقط، مشرط ومقص لتشريح PDXs.
  5. جعل 500 مل غسل العازلة التي تحتوي على DMEM: F12 و 5٪ مصل بقري جنيني (FBS). تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة أشهر. قسامة 10 مل لكل ورم اليوم من تشريح الورم.
  6. إعداد المخزون polybrene في 4 ميكروغرام / ميكرولتر مع الماء المعقم. تصفية وقسامة إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge تحتوي على 100 ميكرولتر لكل منهما، مخزن في -20 درجة مئوية.

2. الجيل السامية العيار الحجمي Lentiviral الجسيمات حمل يمكن عزوها علامات

  1. شراء أو توليد عالية عيار الجسيمات lentiviral يحمل الجين مراسل (أي، GFP ولوك في الجسم الحي تتبع نمو الورم) 18،19.
    ملاحظة: عيار lentiviral من> 10 8 TU / ينصح مل (وحدات تنبيغ في المليلتر) للتنبيغ بنجاح PDXs. وlentiviral صوينبغي أن تكون المواد pseudotyped مع مغلف G بروتين سكري من فيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G)، مما يسمح تنبيغ مجموعة واسعة من خلايا الثدييات.
    ملاحظة: بروتوكول يستخدم هنا للتوليد والمعايرة من جزيئات lentiviral ارتفاع عيار متاح في www.kottonlab.com . ناقلات المستخدمة في هذا البروتوكول هي pSIH1-H1-copGFP-T2A-بورو والمروج المزدوج فج-EF1aL-وسيفيراز-UBC-GFP-W. تم إنشاء هذا ناقلات عن طريق استبدال عن dsRed مع الجين وسيفيراز المصب EF1aL المروج في ناقلات فج-EF1aL-عن dsRed-UBC-GFP-W، هدية عينية من داريل Kotton، جامعة بوسطن.

3. الجيل من Xenografts المستمدة من المريض

  1. توليد المريض المستمدة xenografts (PDX) من سرطان الثدي من خلال زرع أورام الثدي الأولية أو المنتشر في لوحة الدهون الثديية من الفئران المناعة 3،4. توليد الأورام في الحد الأقصى لحجم الموصى بها من 1 سم القطر مثل الأورام الكبيرة هي لikely لاحتواء النوى الميتة.
    يتم وصف مفصل طرق لإنشاء وزرع xenografts في ديروز وآخرون 18: ملاحظة. نمو تأسيس استنساخها PDXs إلى> 1 الأورام سم القطر يأخذ ما بين 4 و 24 أسبوعا بعد زرع في NOD المناعة / SCID / ILIIrg - / - (مجموعة موردي المواد النووية)، اعتمادا على معدلات نمو الورم الجوهرية. بينما يصف هذا البروتوكول تنبيغ PDXs سرطان الثدي، ويمكن استخدامها لتنبيغ الفيروسية من أي ورم مناسبة للالأجل القصير في مرور المختبر. حساسية PDXs إلى المدى القصير (24-96 ساعة) في البقاء على قيد الحياة في المختبر هي الجوهرية لكل ورم ويجب أن تحدد تجريبيا.

تشريح 4. ورم وتفكك الخلايا السرطانية المشتقة PDX-

  1. الموت ببطء الفئران تحمل PDX باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 استنشاق تليها خلع عنق الرحم (يتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية). غمر الفئران في الفصل 0.2٪حل lorhexidine لمدة 1 دقيقة. تعيين الماوس على موقف ضعيف على رأس مجلس تشريح، واستخدام الدبابيس لتثبيت أطرافه العلوية والسفلية الممتدة إلى المجلس.
  2. باستخدام تقنية العقيم، واستخدام مشرط لقطع الجلد حول الورم. سحب الجلد مع مجموعة من الملقط وفصلها عن الورم باستخدام مشرط نظيفة حتى يتعرض الورم تماما. باستخدام مجموعة نظيفة من الملقط ومشرط، وإزالة الورم ووضعه في 5 مل غسل وسائل الإعلام على الجليد.
  3. خذ الورم تشريح في مجلس الوزراء BLS2 لمزيد من المعالجة. إزالة وسائل الاعلام وشطف الورم مع 10 مل من المتوازن ملح الصوديوم هانك التعديل مع 10 ملي HEPES (HBSS / HEPES)، مرتين.
  4. إسقاط ورم في 60 سم لوحة زراعة الأنسجة وزنه قبل معقمة. وزن لوحة تحتوي على الورم لتقدير كتلة الورم.
  5. باستخدام مشرط، وقطع ورم في النصف، ثم قص قرص 3 ملم من نصف ووضعه في وعاء مع 10٪ من الفورمالين لمدة 24 ساعة. استخدام هذه الأنسجة للتحقق من عدم تجانسعينة الورم (الوالدين PDX). إضافة 200 ميكرولتر من HBSS / HEPES (ما يكفي لتجنب الأنسجة لتجف) واللحم المفروم الورم المتبقية في أصغر قطعة ممكنة باستخدام ملقط ومشرط نظيفة.
  6. نقل الورم المفروم في أنبوب مخروطي 50 مل العقيمة. إضافة 1 مل على الأقل من العازلة الهضم التي تحتوي على 1X مضاد فطري للمضادات الحيوية لكل 100 ملغ من الورم.
    ملاحظة: إضافة المضادات الحيوية / مضاد فطري يمنع تلوث من الخلايا السرطانية في المختبر.
  7. هضم الورم لمدة 3 ساعة على 30 درجة مئوية، والهز في 125-200 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: زيادة درجة حرارة تصل إلى 37 درجة مئوية يزيد من كفاءة الهضم (أكثر من الخلايا وحيدة مع مرور الوقت) ولكن تصاحب عادة لها عن طريق زيادة موت الخلايا. بالنسبة لمعظم الأورام، والهضم عند 30 درجة مئوية لمدة 3 النتائج ساعة في أعداد كافية من خلايا نأت قابلة للحياة للشروع في خطوة وصفها.
  8. وقف الهضم إضافة 35 مل غسل وسائل الإعلام (DMEM / F12 مع 5٪ FBS). التصفية من خلال النايلون 70 ميكرون شبكة في نظيفة 50 مل جأنبوب onical لإزالة الأنسجة غير المهضومة. أجهزة الطرد المركزي وسائل الإعلام التي تمت تصفيتها تحتوي على خلايا هضمها في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
  9. نضح وطاف بيليه resuspend في 1 ملليتر دم أحمر عازلة خلية تحلل. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  10. إضافة 10 مل غسل العازلة (DMEM: F12، 5٪ FBS) لوقف تحلل. تمر الخلايا من خلال النايلون 40 ميكرومتر شبكة لإزالة كتل. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة طاف، ومكان على الجليد.
  11. و resuspend هضمها الخلايا في 5 مل غسل العازلة وعدد الخلايا على حد سواء قابلة للتطبيق وغير قابلة للحياة في استخدام استبعاد التريبان الأزرق. لفترة وجيزة، مزيج 50 ميكرولتر من الخلايا و50 ميكرولتر من التريبان الأزرق وعدد الخلايا باستثناء التريبان زرقاء باستخدام عدادة الكريات.
    ملاحظة: هذا المنتج الهضم الخام سوف تحتوي على خلايا السرطانية البشرية المستمدة من PDX، وكذلك خلايا فأر اللحمية (الخلايا الليفية، وخلايا الدم، الخ.). ويمكن الآن خلايا هضمها تتم معالجتها لوضع العلامات (الخطوة 6)، أو خلايا سرطانية بشرية يمكن إثراء باستخدام أحد الإجراءات الموضحةفي الرقم 5.

5. إثراء خلايا الإنسان الظهارية للسرطان

  1. المستنفدة لخلايا فأر انسجة باستخدام النسب (لين +) خلية نضوب مجموعة 20.
    ملاحظة: لا ينصح به للأورام أوعية دموية للغاية و / أو الأورام مع محتوى انسجة الكبير الذي التعبير EpCAM غير معروف أو خسر).
    1. يستغرق ما يصل الى 10 7 خلايا قابلة للحياة في أنبوب البولي بروبلين 5 مل نظيفة، إضافة EEB 2 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. ماصة قبالة طاف تماما.
    2. بيليه الخلية resuspend في 40 ميكرولتر من EEB المثلج في 10 7 خلايا.
    3. إضافة 10 ميكرولتر من الكوكتيل البيوتين الأجسام المضادة في 10 7 الخلايا، مزيج من قبل pipetting بلطف واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (كوكتيل يحتوي على أجسام مضادة لخلايا فأر لين +).
    4. إضافة 30 ميكرولتر من EEB البارد في 10 7 الخلايا، مزيج من قبل pipetting بلطف.
    5. إضافة 20 ميكرولتر من ميكروبيدات مكافحة البيوتين في 10 7 خلايا مزيج من قبل pipetting بلطف واحتضان عند 4 & #176؛ ج لمدة 15 دقيقة.
    6. غسل الخلايا مع 3 مل EEB الباردة، الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح بعناية طاف. بيليه resuspend في 500 ميكرولتر من EEB ومكان على الجليد.
    7. وضع عمود في المجال المغناطيسي للفاصل المغناطيسي. شطف العمود مع العازلة تخصيب الظهارية 0.5 مل والسماح لها بالتنقيط من خلال. لا تسمح للعامود لتجف.
    8. وضع أنبوب جديد لجمع البولي بروبلين تحت العمود. ببطء، إضافة 500 ميكرولتر التي تحتوي على الخلايا المسمى على العمود (لين + المسمى سيتم الاحتفاظ الخلايا في العمود المغناطيسي). جمع النفايات السائلة ككسر مع الخلايا غير المسماة، وهو ما يمثل الخلية جزء المخصب نسب سلبية (ورم).
    9. شطف العمود 3 مرات مع 500 ميكرولتر من المد وجمع النفايات السائلة في الأنبوب نفسه كما النفايات السائلة من خطوة 5.1.8. إبقاء المخلفات على الجليد، والشروع في وضع العلامات خطوة (6).
    10. اختياري: خذ العمود خارج الحقل المغناطيسي للأرض. وضع أنبوب البولي بروبلين جديد أسفلوأزل جزء لين + بإضافة 500 ميكرولتر من EEB، ثلاث مرات، وباستخدام المكبس المقدمة.
  2. إثراء EpCAM + الخلايا السرطانية الظهارية البشرية (موصى به للأورام المعروفة للتعبير CD326 + واحتواء ارتفاع محتوى انسجة الماوس).
    1. يستغرق ما يصل الى 10 7 خلايا قابلة للحياة في أنبوب البولي بروبلين 5 مل نظيفة، إضافة 2 مل EEB الباردة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. ماصة قبالة طاف تماما.
    2. بيليه الخلية resuspend في 60 ميكرولتر من انحسار الجليد الباردة في 10 7 خلايا.
    3. إضافة 20 ميكرولتر من ميكروبيدات EpCAM في 10 7 الخلايا، مزيج من قبل pipetting بلطف واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    4. غسل الخلايا مع 3 مل EEB الباردة، الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح بعناية طاف. بيليه resuspend في 500 ميكرولتر من EEB وضعت على الجليد.
    5. وضع عمود في المجال المغناطيسي للفاصل صغير. شطف العمود مع EEB 0.5 مل والسماح لها بالتنقيط من خلال. لا تسمح للعمود حتى يجفخارج.
    6. وضع أنبوب جديد لجمع البولي بروبلين تحت العمود. ببطء، إضافة 500 ميكرولتر التي تحتوي على الخلايا المسمى على العمود (سيتم الاحتفاظ EpCAM + الخلايا المسمى في العمود المغناطيسي). جمع النفايات السائلة ككسر مع الخلايا غير المسماة، تمثل خلايا فأر اللحمية.
    7. شطف العمود 4 مرات مع 500 ميكرولتر من ME العازلة وجمع النفايات السائلة في الأنبوب نفسه كما النفايات السائلة من خطوة 5.1.8.
    8. خذ العمود خارج الحقل المغناطيسي للأرض. وضع أنبوب البولي بروبلين جديد أسفل وأزل EpCAM + جزء بإضافة 500 ميكرولتر من ME العازلة، ثلاث مرات. طرد الخلايا المسمى مغناطيسيا عن طريق دفع بقوة المكبس في العمود. جمع النفايات السائلة التي تحتوي على التخصيب EpCAM + الخلايا السرطانية جزء والحفاظ على الجليد. انتقل إلى الخطوة 6.

6. تنبيغ من الخلايا السرطانية المشتقة PDX-

  1. الطرد المركزي فصل الخلايا السرطانية في 300 GX 5 دقائق و resuspend في 2 مل mammosphere ميديا. عد خلايا قابلة للحياة في استخدام استبعاد التريبان الأزرق كما في 4.11.
  2. إعداد 10 مل من وسائل الاعلام mammosphere تحتوي على 8 ميكروغرام / مل polybrene (2 ميكرولتر من polybrene الأسهم لكل مل من وسائل الاعلام).
  3. تحديد حجم اللازمة ل2 × 10 5 الخلايا السرطانية قابلة للحياة. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، وبيليه resuspend في 2 مل من polybrene تحتوي على وسائل الاعلام. لوحة 2 × 10 5 الخلايا السرطانية قابلة للحياة لكل بئر في 6 جيدا منخفضة للغاية لوحة زراعة الأنسجة الالتزام.
    ملاحظة: هذا هو العدد الأمثل من الخلايا اللازمة لتنبيغ مع ناقلات lentiviral واحد.
    يجب التعامل مع تنبيه! الجسيمات Lentiviral وجميع المواد الاستهلاكية المستخدمة مع جزيئات lentiviral اتباع الإجراءات المؤسسية لخطورتها الحمض النووي المؤتلف.
    ملاحظة: التنبيغ Lentiviral من خلايا الثدي الابتدائية تفضل بقوة خلايا عضلية ظهارية الذي يمكن أن يؤدي إلى وضع العلامات الفقراء من الخلايا اللمعية واختيار جزء من السكان الخلايا السرطانية خلال وصفها 21.
    4. <لى> احتضان الفيروس مع 200 / مو مل النورامينيداز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل تنبيغ لزيادة الربط من الجسيمات الفيروسية لمختلف الفئات السكانية الخلية الأولية والصحيح لهذا التحيز المحتمل 21.
  4. إضافة جزيئات lentiviral في 10 وزارة الداخلية (2 × 10 6 TU ل2 × 10 5 خلايا قابلة للحياة) إذا نضبت خلايا نأت PDX-من خلايا فأر لين + أو التخصيب في الخلايا EpCam +. إضافة جزيئات lentiviral في 30 وزارة الداخلية (6 × 10 6 TU ل2 × 10 5 خلايا قابلة للحياة) في حالة استخدام غير مخصب خلايا نأت PDX.
    ملاحظة: إن زيادة زارة الداخلية يسمح لالتنبيغ كفاءة حتى في وجود كميات كبيرة من الحطام والخلايا الميتة في استخراج النفط الخام. الحفاظ على ما يرام واحد مع الخلايا غير المسماة لتكون بمثابة الرقابة على سلامة وكفاءة ترنسدوكأيشن.
  5. دوامة خلط فيروس مع الخلايا. احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة تصل إلى 96 ساعة. إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام mammosphere جديدة 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. والخلايا لا أتاكح لوحات، لا نضح وسائل الإعلام.

7. تقييم تنبيغ الكفاءة وإعادة زرع الخلايا المسمى في الفئران نقص المناعة

  1. مراقبة تعبير عن علامة يمكن تتبعها (GFP) كل 24 ساعة باستخدام مجهر فلوري في 10X التكبير.
    ملاحظة: التعبير GFP يمكن ملاحظتها في أقرب وقت 24 ساعة بعد الإصابة ولكن في معظم PDXs التعبير GFP مرئيا بوضوح بعد 72 ساعة (الشكل 1).
  2. تقدير كفاءة تنبيغ من خلال تقييم نسبة GFP + الخلايا داخل البئر الكلي.
    ملاحظة: منذ الثقافات تحتوي على الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية المتبقية، والخلايا الميتة بدرجات متفاوتة، والآبار مع ما يصل الى 10٪ GFP + الخلايا يمكن زرعها في الماوس المضيف.
  3. نقل خلايا transduced من 6 لوحات جيدة إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 1 مل من وسائل الاعلام mammosphere إلى البئر لجمع كل الخلايا تركوها وراءهم. مكان على الجليد.
  4. إضافة 10 مل من HBSS / HEPES إلى خلايا transduced وجentrifuge في 300 x ج لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية. نضح بعناية وطاف resuspend في 50 ميكرولتر استخراج الطابق السفلي مصفوفة (BME) على الجليد.
    ملاحظة: يجب أن يتم إذابة قسامات BME على الجليد، 1-2 ساعة قبل استخدامها. سوف BME يصلب في درجة حرارة الغرفة. الحفاظ على الجليد في جميع الأوقات.
  5. تحميل خلايا جزءا لا يتجزأ من BME-إلى حقنة الأنسولين 0.5 مل، والحفاظ على الجليد، وتقديمهم إلى منشأة الحيوان لإعادة الزرع في الفئران مجموعة موردي المواد النووية.
  6. تخدير الأنثى 4-8 الاسبوع الفئران مجموعة موردي المواد النووية القديمة، وذلك باستخدام 5٪ الأيزوفلورين / 95٪ من الأكسجين ل5min، تليها 2٪ الأيزوفلورين / 98٪ من الأكسجين أو وفقا لأخلاقيات البحوث الحيوانية وافق وافق البروتوكول.
  7. عندما الحيوان لا يستجيب للمؤثرات الألم (أخمص القدمين قرصة)، وتنظيف منطقة الحقن مع betadine تليها مناديل الايثانول، وحقن 50 ميكرولتر من الخلايا في 4 تشرين الثديية منصة الدهون. توفير الفئران مع التسكين للتخفيف من حدة حقن مشقة كما هو مبين في بروتوكول المعتمد.
  8. تسمح للخلايا لتشكيل أورام (2-12 أسابيع) ومراقبة GFP و / أوluciferase النشاط باستخدام نظام ضوء الانضباطي و / أو في الجسم الحي نظام وسيفيراز التصوير (الشكل 2).
    ملاحظة: اتبع إرشادات للتخدير، تسكين، وقياسات عبء الورم ومعايير القتل الرحيم كما وافقت عليها الحيوان المؤسسي لجنة أخلاقيات البحث.

8. مراقبة الجودة من PDXs إعتبر

  1. تحديد كفاءة وضع العلامات من خلال تقييم وسيفيراز والتعبير GFP في الأورام المسمى.
    وافقت اتبع جنة أخلاقيات البحوث الحيوانية المؤسسي إجراءات في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي التصوير (الشكلان 2 و 3): ملاحظة.
    1. تشريح الأورام من الفئران الموت الرحيم عندما حجم الورم وصلت 1،0-1،5 قطرها سم (أو قبل وفقا لبروتوكولات المعتمدة، كما هو موضح في 4). يجب أن يتم تنفيذ تشريح تحت ضوء النظام الانضباطي (أو نظام ما يعادل يسمح بتقييم مضان GFP).
    2. من كل ورم، وتقدير نوعيا في بيrcentage من GFP + الورم باستخدام المجهر. إذا كانت أقل من 100٪، تشريح GFP + جزء فقط. تشريح قرص 3 مم وإصلاح في 10٪ من الفورمالين لتضمين البارافين والتحليل النسيجي، وتوفير قطعة صغيرة لRNA أو التحليلات المطلوبة الأخرى، وتوفير أكبر قدر من الورم ممكن في الفردي 1.5 مل cryotubes تحتوي على 90٪ FBS / 10٪ DMSO لحفظ البرودة.
  2. قطع إعادة زرع الورم المسمى إلى مستلم جديد مجموعة موردي المواد النووية الفئران 18 إلى توسيع واستخدامها في دراسات الانبثاث التجريبية.
  3. أداء تلطيخ المناعى القياسية من البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج التي تم الحصول عليها من الأورام قبل التنبيغ وفي كل جيل بعد ذلك للتحقق من أن تظل PDXs المسمى مماثلة تشريحيا إلى PDXs الأصلية.
    ملاحظة: إن علامات تستخدم لمراقبة الجودة تختلف مع كل PDXs. لPDXs سرطان الثدي والتعبير عن مستقبلات هرمون الاستروجين، ومستقبلات هرمون البروجسترون، عامل نمو البشرة مستقبلات 2 (HER2)، عامل نمو البشرة مستقبلات 1 (HER1 أو EGFR)، والسلطة الفلسطينيةن cytokeratin (عموم CK) ويوصى لفحص الأولي.

9. نماذج التجريبية الانبثاث مع PDXs إعتبر

  1. اتباع الخطوات الموضحة في قسم 4، فصل الخلايا السرطانية من PDX المسمى. إذا الورم أوعية دموية للغاية أو غنية سدى الماوس، نفذ تخصيب الخلايا السرطانية كما هو موضح في 4.5 أو 4.6.
  2. عد خلايا قابلة للحياة في استخدام استبعاد التريبان الأزرق، وتمييع 250،000 الخلايا في 100 ميكرولتر PBS (الكالسيوم 2+، والمغنيسيوم 2+ مجانا) في الفئران. تبقي الخلايا على الجليد. للحقن الفئران متعددة، وضبط الأعداد وفقا لذلك (وأعدوا وجود فائض من حقن إضافي واحد على الأقل لحساب الأخطاء pipetting ل).
  3. جلب الخلايا على الجليد إلى غرفة إجراء الحيوان المناسبة، والشروع في الحقن داخل القلب وفقا لبروتوكول IACUC المعتمدة.
    وقد وصفت مفصلة بروتوكولات للحقن داخل القلب من الخلايا السرطانية في أماكن أخرى 22،23: ملاحظة.
  4. تتبع وقياس النقيليانتشرت على مر الزمن باستخدام التصوير إضاءة الحيوية. تصور الانبثاث العيانية في الأجهزة المختلفة باستخدام تلألؤ بيولوجي و / أو التصوير GFP من أجهزة معزولة في التشريح 24 (الشكل 6).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يصف هذا الأسلوب تنبيغ من خلايا سرطان الثدي فصل PDX باستخدام عالية عيار ناقلات lentiviral pSIH1-H1-copGFP-T2A-بورو وفج-EF1aL-وسيفيراز-UBC-GFP-W. هذه النواقل تعبر عن علامة فلوري الذي يسمح تقدير كفاءة ترنسدوكأيشن في المختبر، في أقرب وقت 24 ساعة بعد الإصابة (الشكل 1A). بالنسبة لمعظم PDXs، سيتم تأجيل التعبير عن GFP تصل إلى 72 ساعة بعد الإصابة (الشكل 1B)، في هذا الوقت لوحظ تشكيل المجاميع خلية عادة. التنبيغ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخطوات الحاسمة في البروتوكول:

استخدام جزيئات lentiviral ارتفاع عيار (> 10 8 TU / مل) هو خطوة حاسمة في نجاح هذا البروتوكول، كما يتيح التحكم الدقيق للتكوين وسائل الإعلام في المختبر خلال تنبيغ. في حين أساليب متعددة لإنتاج جزيئات فيروسية عالية عيار وقد وصفت جيدا 18،19. يستخدم هذا البروتوكول الجسيمات lentiviral المنتجة كما هو موضح بالتفصيل في

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

الكتاب أشكر الدكتور داريل Kotton في جامعة بوسطن لتوفير فج-EF1aL-عن dsRed-UBC-GFP-W ناقلات والبروتوكولات لارتفاع عيار إنتاج lentiviral المستخدمة في هذه الدراسات. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الدفاع BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC)، ACS IRG # 57-001-53 (DMC)، NCI K22CA181250 (DMC) و R01 CA140985 (CAS) منحة .NCI مركز P30CA046934 دعم في مجال التصوير فيفو وزراعة الأنسجة النوى في جامعة كولورادو AMC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEM / F12 (1: 1)HycloneSH30023.01
bFGFBD Biosciences354060
EGFBD Biosciences354001
HeparinSigmaH4784
B27Gibco / Thermo Fisher17504-44
HycloneSV30010
المضادة للفطريات والمضادات الحيويةAccumaxInnovative Cell TechnologiesAM-105-500Digestive Buffer
FBSAtlanta BiologicalsS11550
HBSS Red Ca2 + < / sup> / Mg 2 + < / sup> FreeHycloneSH30031.02
Hepes
10x PBSHycloneSH30258.01
CultrexCultrex3433-005-01مستخلص مصفوفة الطابق السفلي (BME) 30
&# 176 ؛ C شاكرنيوبرونزويك العلمية CO. INCسلسلة 25 حاضنة شاكر
70 &# 956; م مرشحاتFalcon7352350
مشارطفيشر22079690
كلوريكسيدين مطهرDurvet  NDC # 30798-624-35
الدم الأحمر كاشف تحلل الخلاياSigmaR7757
NeuraminidaseSigmaN7885-1UN
EpCAM (CD326 +) microbeads *Miltenyil Biotec130-061-101
طقم استنفاد خلايا النسب ، الماوس *Miltenyil Biotec130-090-858
فاصل MiniMACS   ؛Miltenyil Biotec130-042-102
Mini MACS حامل مغناطيسيMiltenyil Biotec130-042-303
MS الأعمدة يمكناستخدام أعمدة Miltenyil Biotec130-042-201MS أو LS ، وضبط عدد الخلايا.
Illumatool نظام الضوء القابل للضبطLightools البحثالمتنوعللتصوير الفلوري في الجسم الحي
جهاز تصوير XenogenIVIS200 مختلفلتصوير اللمعان في الجسم الحي
استنساخ السيتوكيراتين البشري MNF116 الجسم المضاد أحاديالنسيلة DAKOM0821عموم السيتوكيراتين  
الأجسام المضادة لمستقبلات عامل نمو البشرة4267SEGFR
إشارات

المراجع

  1. Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
  2. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  3. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  4. Kabos, P., et al. Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures. Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).
  5. Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
  6. Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research. Curr Protoc Pharmacol. , (2012).
  7. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).
  8. Garrido-Laguna, I., et al. Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).
  9. Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Res. 15 (1), 201(2013).
  10. Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy. Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).
  11. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  12. Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Res. 16 (2), R36(2014).
  13. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
  14. Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).
  15. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
  16. Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
  17. Powell, E., et al. p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).
  18. DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. , (2013).
  19. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
  20. Indumathi, S., et al. Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology. Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).
  21. Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias. Nat Commun. 6, 6927(2015).
  22. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (67), e4260(2012).
  23. Kang, Y. Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis. Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).
  24. Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).
  25. Lawson, D. A., et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نماذج مشتقة من مريض لسرطان الثديترانسدكشن فيروسي لينتيوسم الخلايا الورميةالتصوير بالتلألؤ البيولوجيتعبير البروتين الفلوري الأخضرتفكيك الورمالإثراء الظهاريالتصوير داخل الجسم الحي
وضع العلامات لسرطان الثدي Xenografts المستمدة من المريض مع يمكن عزوها مراسلون لنمو الأورام والدراسات الانبثاث
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.