نقترح بروتوكولا لتحديد الأحماض الدهنية دون الحاجة إلى تنقيتها. فهو يجمع بين المعلومات المتعلقة بأوقات الاحتفاظ مع الأطياف الكتلية لثلاثة أنواع من مشتقات الأحماض الدهنية: استرات ميثيل الأحماض الدهنية (FAMEs) ، ومشتقات 4،4-ثنائي ميثيل أوكسازولين (DMOX) ، و 3-استرات بيريديل كاربينيل (بيكولينيل).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أنواع بكتيريا تحتوي على تشعبت سلسلة والأحماض الدهنية غير المشبعة (FAS) مع المواقف المختلفة للفرع الميثيل (ايزو أو anteiso) والرابطة المزدوجة. تغييرات في تكوين اتحاد كرة القدم تلعب دورا حاسما في التكيف من البكتيريا إلى بيئتهم. هذه التعديلات تنطوي على تغيير في نسبة ايزو مقابل anteiso تشعبت اتفاقات الصيد، ونسبة غير المشبعة اتفاقات الصيد بالنسبة إلى اتفاقات الصيد المشبعة، مع ضعف السندات التي تم إنشاؤها في مواقع محددة. تحديد دقيق للوضع الاتحاد الانجليزي ضروري لفهم آليات التكيف من أنواع بكتيريا.
العديد من اتفاقات الصيد من العصيات ليست متاحة تجاريا. الاستراتيجية المقترحة في هذه الوثيقة تحدد اتفاقات الصيد من خلال الجمع بين المعلومات على الوقت الاحتفاظ (عن طريق حساب طول سلسلة يعادل (ECL)) مع أطياف الشامل من ثلاثة أنواع من المشتقات FA: استرات الدهنية الميثيل حمض (جوع)، 4،4-ثنائي ميثيل oxazoline المشتقات (DMOX)، واستر 3-pyridylcarbinyl (picolinyl). هذه الطريقة يمكن التعرف على اتفاقات الصيد دون الحاجة إلى تنقية اتفاقات الصيد غير معروف.
وبمقارنة ملامح الكروماتوغرافي من FAME أعدت من الشمعية عصية مع خليط التجاري للمعايير تسمح لتحديد مستقيمة السلسلة المشبعة اتفاقات الصيد، وحساب من أطلق بيت التمويل الخليجي، وفرضيات على هوية اتفاقات الصيد الآخر. جوع من تشعبت المشبعة اتفاقات الصيد، ايزو أو anteiso، عرض تحول سلبي مستمر في ECL، مقارنة خطية المشبعة اتفاقات الصيد مع نفس عدد ذرات الكربون. جوع من غير المشبعة اتفاقات الصيد يمكن الكشف عن كتلة أيونات الجزيئي، ويؤدي إلى تحول إيجابي في ECL مقارنة اتفاقات الصيد المشبعة المقابلة.
موقف المتفرعة فاس وموقف الرابطة المزدوجة من غير المشبعة اتفاقات الصيد يمكن تحديدها من قبل أطياف الكتلة التأين الإلكترون من picolinyl وDMOX المشتقات، على التوالي. ويحدد هذا النهج كل فرع المشبعة غير معروفإد اتفاقات الصيد، غير المشبعة على التوالي سلسلة اتفاقات الصيد واتفاقات الصيد تشعبت غير المشبعة من B. استخراج الشمعية.
المقدمة
الأحماض الدهنية استر الميثيل (FAME) اللوني للغاز (GC) هو وسيلة أساسية لتوصيف الدهون. أنه يفصل بسرعة والكمي مختلف الأحماض الدهنية (FAS) من عينة بعد خطوة استخراج قصيرة. مشتقات استرات الميثيل متقلبة جدا ومستقرة والخاملة نحو العمود الكروماتوغرافي، وبالتالي تجنب قمم المخلفات. التعرف عليهم واضح وصريح للغاية عندما تتكون عينة فاس معروفة لأن ملامح الكروماتوغرافي إما المنشورة أو مقارنة بالمعايير. وبالإضافة إلى ذلك، لا يلزم الحقن المتكررة للمعايير معايرة لتقدير مختلف اتفاقات الصيد، نظرا استجابة ثابتة تقريبا لكشف اللهب التأين (ااا) 1.
بالإضافة إلى الاستثمارات الخارجية المباشرة، ويوفر الطيف الكتلي (MS) الكشف عن مجموعة متكاملة من المعلومات لتأكيد جوع. ومع ذلك، عندما اتهم جوع باستخدام التأين الإلكترون (EI)، والأطياف الناتجة لا تسمح دائما عشرتحديد (ه) من الاتحاد الانجليزي هيكل غرامة. على سبيل المثال، المتفرعة موقف (أي مجموعة الميثيل تشعبت) من الصعب التنبؤ لأن أيونات التشخيص صعبة للكشف عن 1 والتغيير مميزة في وفرة ايون الهدف تعتمد على آلة، ومنع استخدام المكتبات أطياف الجماعية 2. تحد آخر يكمن في تحديد موقف الرابطة المزدوجة لEI يسبب هجرة السندات مزدوجة. وهكذا، أيزومرات الاتحاد الانجليزي مع اختلاف المواقف السندات مزدوجة لا يمكن تفريقها أطياف الشامل بهم. لحسن الحظ، تم تطوير أدوات أخرى لتحديد الاتحاد الانجليزي. على سبيل المثال، فإن وجود وموقف المتفرعة أو سندات مزدوجة في اتفاقات الصيد يمكن حدسيا عن طريق حساب طول سلسلة يعادل (ECL) 3.
طرق اشتقاق أخرى تؤدي إلى أطياف الإعلام المختلفة، اعتمادا على مكان وجود رابطة ثنائية أو مجموعة الميثيل متفرعة. 4،4-ثنائي ميثيل المشتقات oxazoline (DMOX) 4 تسمح لقمة شرق اسياتحديد ذ من موقف ضعف السندات غير المشبعة الاحادية الأحماض الدهنية. 3-pyridylcarbinyl استر (picolinyl استر) المشتقات تسمح لتحديد واضح للموقع الميثيل تشعبت اتفاقات الصيد 5. الجمع بين الاحتفاظ الكروماتوغرافي (ECL) والأطياف كتلة (DMOX وpicolinyl) تتيح المعلومات للتعرف على معظم اتفاقات الصيد دون الحاجة إلى استخدام وسائل معقدة للتنقية، على النحو المطلوب لالرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيف، وطريقة لا شك فيه لتوصيف هيكلي 1 .
البكتيريا من جنس العصيات، والتي تشمل بعض مسببات الأمراض للإنسان والحيوان، هي قادرة على استعمار منافذ متنوعة للغاية، وبالتالي توزع على نطاق واسع في البيئة 6. بين جنس العصيات، ويتأثر تكوين اتحاد كرة القدم من مكانة الايكولوجية من الأنواع مع التحويرات في أنماط الاتحاد الانجليزي للتكيف مع مجموعة واسعة من التغيرات البيئية (على سبيل المثال، متوسطة النمو، ودرجة الحرارة،درجة الحموضة، الخ) 7-9. بسبب التجانس النسبي للنمط كرة القدم عبر الأنواع في جنس العصيات أثناء النمو في ظروف موحدة، وتحديد تكوين اتحاد كرة القدم هي واحدة من المعايير الأساسية المستخدمة لتحديد أنواع بكتيريا. سمة فريدة من جنس العصيات هي وفرة فاس تشعب سلسلة تحتوي على 12-17 الكربون 10-12 مع النسبة بين ايزو وanteiso أيزومرات كونه محددا رئيسيا للتكيف مع الظروف البيئية. الأنواع عصية على التكيف أيضا لتقلبات البيئية عن طريق تغيير نسبة من الأحماض الدهنية غير المشبعة. في بعض الأنواع، مثل الشمعية عصية، واثنين من إنزيمات دياستيريز الأحماض الدهنية خلق روابط ثنائية في مواقع مختلفة من سلسلة الألكيل 13 مع أدوار مختلفة في التكيف 9. على سبيل المثال من جنس العصيات يوضح أهمية تحديد بدقة موقف الرابطة المزدوجة واتحاد كرة القدم المتفرعة. جمعively، وتحديد أنماط العصوية الاتحاد الانجليزي لديها العديد من التطبيقات المفيدة. هنا، نقترح نهجا GC-MS رواية لتحديد نمط عصيات كرة القدم أن يتغلب على القيود المتأصلة في تحليل GC-MS الكلاسيكية.
هذا النهج المبتكر يمكن استخدامها مباشرة على المواد البيولوجية الخام، ويتكون من مزيج من التقنيات الموجودة: معلومات عن الاحتفاظ مرات (ECL) والأطياف الشامل لمختلف المشتقات اتفاقات الصيد (FAME، DMOX وpicolinyl استر).
نحن نستخدم التسمية الاتحاد الانجليزي التالية. ط، لذلك، ون تشير ايزو، تشعبت anteiso الميثيل، ومباشرة سلسلة الأحماض الدهنية، على التوالي. سميت اتفاقات الصيد غير المشبعة التي كتبها C: d حيث C هو عدد ذرات الكربون في الأحماض الدهنية ود هو عدد الروابط الثنائية. Δ س يشير إلى موقف الرابطة المزدوجة، حيث يقع الرابطة المزدوجة على السندات بين الكربون xth، عد من نهاية الحمضية الكربوكسيلية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الثقافات البكتيرية
- إعداد العشب من البكتيريا (العصوية الشمعية سلالة ATCC 14579) من خلال نشر 100 ميكرولتر من ثقافة بين عشية وضحاها من سلالة المحتضنة في 30 درجة مئوية في LB (لوريا، Bertani المتوسطة)، على سطح لوحة من LB أجار المتوسطة. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
2. أطلق بيت التمويل الخليجي: سلسلة تعادل طول
- حساب أطلق بيت التمويل الخليجي على النحو التالي:
مع:
ط، المذاب في المصالح؛
ن، وعدد من الكربون استر الميثيل سلسلة الأحماض الدهنية المشبعة على التوالي يبلغ حجمه قبل المذاب الأول؛
ن + 1، وعدد من الكربون استر سلسلة المشبعة الأحماض الدهنية الميثيل على التوالي يبلغ حجمه بعد المذاب الأول؛
RTI، RTN، الرايت (ن + 1) مرات الإبقاء على قمم FAME المذكورة أعلاه.
ملاحظة: للحصول على الاحتفاظ مرات من استرات سلسلة الأحماض الدهنية المشبعة الميثيل على التوالي عن طريق الحقن من خليط من المعايير (Bآمي).
3. إعداد وتحليل FAME
- من أجل الحصول على الأحماض الدهنية الدهون والخلايا البكتيرية الحصاد عن طريق كشط المستعمرات من لوحة أجار ونقل 40 ملغ (الوزن الطازج، أي ما يعادل 10 9 خلايا قابلة للحياة) من البكتيريا في أنبوب زجاجي 10 مل مع قبعات المسمار والأختام PTFE.
- أداء أسترة عبر استر طريقة ارتباط 14،15 المفصلة أدناه.
- إضافة 5 مل من 0.2 M KOH في الميثانول إلى الخلايا البكتيرية الطازجة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. يتكون هذا رد فعل من تحلل الميثانول القلوية، وقطع الصلة استر في الدهون وإنتاج استرات الميثيل الأحماض الدهنية.
- إضافة 1 مل من 1 M حمض الخليك لخفض درجة الحموضة إلى 7.0. تحقق من درجة الحموضة مع شرائط اختبار درجة الحموضة.
- إضافة 3 مل من الهكسان لاستخراج جوع.
- نقل طاف (المرحلة العضوية) في أنابيب نظيفة والتركيز عن طريق التبخر في درجة حرارة الغرفة تحت تدفق مستمر من النيتروجين للحصول على ما يقرب من 200 ميكرولتراستخراج. نقل العينة إلى قارورة GC مع إدراج.
- حقن مقتطفات في الطيف اللوني الشامل الغاز (GC-MS) النظام.
4. GC / MS شروط
- حقن عينات FAME إلى أداة GC-MS مجهزة العمود الشعري ZB-شمع (طول، 30 متر، وقطره 0.25 مم؛ سماكة الفيلم، 0.25 ميكرون).
- تعيين منفذ حقن (في الوضع splitless) درجة الحرارة إلى 250 درجة مئوية. استخدام الهيليوم بوصفها الناقل للغاز، مع سرعة خطية من 37 سم / ثانية. عقد درجة حرارة الفرن عند 50 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، يرتفع إلى 190 درجة مئوية في معدل 20 درجة مئوية / دقيقة، ويرتفع على درجة حرارة النهائية من 230 درجة مئوية بمعدل 2 درجة مئوية / دقيقة.
- لMS، تسجيل أطياف الشامل التي كتبها التأين الإلكترون (EI) في 70 فولت، وتعيين الاستحواذ من إجمالي أيون الحالية بين 50 و 400 وحدة ذرية كتلة (اتحاد المغرب العربي) (2 بالاشعة / ثانية).
- عند الاقتضاء، وضخ DMOX وpicolinyl مشتقات تحت نفس حالة excepر الفرن برنامج درجات الحرارة على النحو التالي:
DMOX: 50 ° C (1 دقيقة)، 20 ° C / دقيقة حتى 210 درجة مئوية و 2 درجة مئوية / دقيقة حتى 240 درجة مئوية (5 دقائق).
Picolinyl: 6 ° C (1 دقيقة)، 20 ° C / دقيقة حتى 220 درجة مئوية و 2 درجة مئوية / دقيقة حتى 250 درجة مئوية (20 دقيقة).
5. إعداد استر Picolinyl من FAME 16
- تتبخر استخراج شهرة من القسم 3 مع تدفق النيتروجين (لا يقل عن 10 ملغ المادة الجافة) وتذوب في 1 مل من ثنائي كلورو ميثان الجاف.
- إعداد محلول 1.0 M من البوتاسيوم ثالثا تي باتوكسايد في رباعي هيدرو الفوران.
- إضافة استخراج FAME و 0.2 مل 3-pyridinemethanol إلى 0.1 مل من محلول في الخطوة 5.2.
- الحرارة الحل عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في قنينة مغلقة.
- بعد التبريد لدرجة حرارة الغرفة، وإضافة الماء منزوع الأيونات النقي (2 مل، انظر المواد الجدول) والهكسان (4 مل). خلط مع دوامة، والسماح مرحلة لفصل، وجمع المرحلة العضوية.
- الدكتورذ بإضافة كبريتات الصوديوم اللامائية حتى المرحلة العضوية واضح تماما. نقله في أنبوب نظيفة. ثم تتبخر إلى 200 ميكرولتر. نقل العينة إلى قارورة GC مع إدراج.
6. إعداد DMOX من FAME 17
- تتبخر استخراج شهرة من القسم 3 مع تدفق النيتروجين (لا يقل عن 10 ملغ المادة الجافة).
- لاستخراج الجافة FAME، إضافة 250 ملغ من 2-أمينو-2-ميثيل-1-بروبانول. مطاردة السفينة مع النيتروجين، إضافة سدادة، ووضعه في كتلة التدفئة بين عشية وضحاها في 190 درجة مئوية.
- بعد التبريد لدرجة حرارة الغرفة، إضافة 3 مل ثنائي كلورو ميثان إلى أنبوب، و 5 مل تنقية الماء منزوع الأيونات (انظر الجدول المواد).
- يهز لفصل المرحلة ومن ثم إزالة المرحلة المائية.
- تغسل المرحلة العضوية مع 5 مل من الماء. يهز لفصل المرحلة ومن ثم إزالة المرحلة المائية.
- الجاف بإضافة كبريتات الصوديوم اللامائية حتى المرحلة العضوية من الواضح تماما ونقله في أنبوب نظيفة. تتبخر تحت تيار من النيتروجين حتى يصل إلى حجم 200 ميكرولتر. نقل العينة إلى قارورة GC مع إدراج.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وقدمت استراتيجية لتحديد الهوية كرة القدم من الخلايا البكتيرية في الشكل 1. توفر كل خطوة من المعلومات الطيفية تكميلية أو معلومات حول الاحتفاظ الكروماتوغرافي. الخطوة 1 تتكون من تحديد الاتحاد الانجليزي الأولي باستخدام محلول قياسي. الخطوة 2 تسمح لتفسير FAME EI الأطياف وأطلق بيت التمويل الخليجي، ومن أجل تحديد مبدئيا المنتجات. الخطوة 3 تحدد موقع المتفرعة بالضبط في تشعبت سلسلة اتفاقات الصيد. وأخيرا، الخطوة 4 يحدد بدقة موضع الرابطة المزدوجة...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لمحات اللوني اتفاقات الصيد هو مبين في الجدول رقم 1 تتوافق مع B. الشمعية آي تي سي سي 14579 نمت على سطح لوحة أجار. تم الحصول عليها ملامح مشابهة عندما كانت تزرع البكتيريا في وسائل الإعلام السائل الغازي في نفس درجة الحرارة 8. في حالة البكتيريا نما في وسائل الإعلام السائلة، يتم جمع الكتلة الحيوية البكتيرية بواسطة الطرد المركزي من متوسط النمو ويمكن غسلها وفقا لبروتوكولات الموصوفة سابقا اعتمادا على 8،19 ظروف النمو. التعرف على مختلف اتفاقات ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
الكتاب ممتنون لتوماس Mison لدعمه الفني، وراشيل Kopec لمراجعة المخطوطة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| GC / MS | Shimadzu | QP2010 | |
| العمود الشعري ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 م × 0.25 مم × 0.25 ؛ ومايكرو. م |
| ميثانول Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| هيدروكسيد البوتاسيوم | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| ثنائي كلورو ميثان | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| ثلاثي بوبوتوكسيد البوتاسيوم | ألدريتش | 156671 | |
| 2-أمينو-2-ميثيل-1-بروبانول | A-9879 | ||
| MilliQ أكاديمي | ميليبور | ZMQS50001 | |
| حمض بكتيري ميثيل استر (BAME) مزيج | سيجما ألدريتش | 47080-U Supelco |
المراجع
- Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis 4th Edition. , Oily press. (2010).
- HÜbschmann, H. -J. Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , Wiley-vch. (2015).
- Sasser, M. Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).
- Spitzer, V. Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review. Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).
- Harvey, D. J. Advances in lipid methodology. Volume 1. Christie, W. W. , Oily press. Dundee. 19-80 (1992).
- Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -H., Broussolle, V., Brillard, J. Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. Front Microbiol. 6, (2015).
- Brillard, J., et al. Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).
- de Sarrau, B., et al. Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).
- Diomandé, S. E., et al. Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth. Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).
- Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P. Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. Berkeley, R. C. W. , Blackwell Science Publ. 1-7 (2002).
- Kämpfer, P. Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species. System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).
- Kaneda, T. Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference. Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).
- Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).
- Sasser, M., et al. Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).
- Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
- Destaillats, F., Angers, P. One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids. J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).
- Fay, L., Richli, U. Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization. J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).
- Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids. Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).
- de Sarrau, B., et al. Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions. Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).
- Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters. Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).
- van Den Dool, H., Kratz, P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).
- Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids. J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
