عالية الدقة قياس التنفس لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في Permeabilized وخلايا سليمة

Summary

يستخدم عالية الدقة قياس التنفس لتحديد استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا. هذا هو أسلوب واضحة لتحديد المجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا "(I-IV) وتيرة التنفس، أقصى قدرة الميتوكوندريا نظام نقل الإلكترون، والميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي.

Abstract

الأوكسغراف عالي الدقة هو جهاز لقياس استهلاك الأكسجين الخلوي في نظام غرفة مغلقة بدقة وحساسية عالية جدا في العينات البيولوجية (الخلايا السليمة والنفاذة أو الأنسجة أو الميتوكوندريا المعزولة). تم تجهيز جهاز الأوكسجين عالي الدقة بغرفتين ويستخدم مستشعرات الأكسجين البولاروغرافي لقياس تركيز الأكسجين وحساب استهلاك الأكسجين داخل كل غرفة. يتم حساب معدلات استهلاك الأكسجين باستخدام البرنامج ويتم التعبير عنها على أنها بيكومول في الثانية لكل عدد من الخلايا. تحتوي كل غرفة أوكسغراف عالية الدقة على سدادة مع منافذ حقن، مما يجعلها مثالية لعمليات المعايرة بالتحليل الحجمي لمثبطات فصل الركيزة أو بروتوكولات معايرة المنظفات لتحديد التركيزات الفعالة والمثلى لنفاذية غشاء البلازما. يمكن تطبيق هذه التقنية لقياس التنفس في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا وتوفر أيضا معلومات عن جودة الميتوكوندريا وسلامتها ، وقدرة نظام نقل الإلكترون التنفسي للميتوكوندريا القصوى.

Introduction

الميتوكوندريا الوفاء أدوارا هامة في التمثيل الغذائي للطاقة الخلوية، وخاصة باستخدام الأكسجين لإنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). كانوا متورطين في موت الخلايا وفي العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان. الفسفرة المؤكسدة الميتوكوندريا (OXPHOS) يجمع بين نقل الإلكترون على طول سلسلة نقل الإلكترون مع استهلاك الأكسجين والتوليف اعبي التنس المحترفين. وتشارك حمض (TCA) دورة الثلاثي الكربوكسيل الميتوكوندريا في تحويل البروتينات والكربوهيدرات والدهون إلى طاقة المركبات الغنية ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد الأدينين (NADH) وفلافين ثنائي النوكليوتيد الأدينين (القوات المسلحة الهايتية _2). ثم يتم نقل الإلكترونات من NADH والقوات المسلحة الهايتية ₂ إلى المجمعات بروتين سلسلة نقل الإلكترون التنفسية (من الأول إلى الرابع) الموجود في غشاء الميتوكوندريا الداخلية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمسارين الأكسدة الأخرى نقل الإلكترونات إلى إلكترون سلسلة النقل: ط) الميتوكوندريا الإلكترون نقل بروتين فلافيني (ETF) الذي يقع على وجه مصفوفة من ميتو الداخليغشاء chondrial، واللوازم الإلكترونات من الأحماض الدهنية β للأكسدة. والثاني) الميتوكوندريا سكرولي نازعة الذي يتأكسد سكرولي إلى فوسفات ثنائي هيدروكسي أسيتون ويغذي الإلكترونات إلى سلسلة نقل الإلكترون الميتوكوندريا. رابعا مجمع (المتقبلة الإلكترون النهائي) بنقل الإلكترونات إلى جزيء أكسجين واحدة، وتحويل الأوكسجين إلى جزيئين من الماء. ويقترن تتحرك الإلكترونات من الجهاز التنفسي مجمع سلسلة نقل الإلكترون من الأول إلى الرابع مع تدفق بروتون من المصفوفة الميتوكوندريا إلى الفضاء intermembrane التي تنص على التدرج الكهروكيميائي عبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا. بعد ذلك، الميتوكوندريا الخامس معقدة (ATP سينسيز) المكوكات أيونات الهيدروجين مرة أخرى إلى مصفوفة الميتوكوندريا ويجمع جزيئات ATP. ويمكن تقييم وظيفة OXPHOS في المجراة في المختبر باستخدام مختلف التقنيات ومختلف الدول التنفس الميتوكوندريا يمكن الحصول عليها. في الميتوكوندريا عزلة الجه التاليةيمكن للدول راي أن تقاس: ط) القاعدية التنفس الميتوكوندريا (الدولة 1)، والثاني) استهلاك الأوكسجين بعد إضافة ركائز محددة من المجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا (الدولة 2)، ج) أقصى استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا بعد إضافة تشبع تركيزات ثنائي فسفات الأدينوزين (ADP) (الدولة 3) و، والرابع) يستريح التنفس بعد استهلاك ADP (تحويلها إلى ATP) (الدولة 4). في خلايا سليمة يمكن قياس دول الجهاز التنفسي التالية: أ) القاعدية الخلوية استهلاك الأكسجين في وجود ركائز الداخلية وشرطة أبوظبي، والثاني) القاعدية الخلوية استهلاك الأكسجين في وجود أوليغوميسين (أوليغوميسين-حساس التنفس) وأوليغوميسين تراعي التنفس (ATP دوران)، الثالث) FCCP التنفس وفكت، والرابع) التنفس غير الميتوكوندريا بعد إضافة أنتيمايسين إيه وروتينون. في الخلايا permeabilized، ركائز محددة من المجمعات سلسلة نقل الإلكترون وADP يمكن إضافة والقصوى التي تعتمد على مجمع وتيرة التنفس الصورةاوك I- معقدة، ثانيا: ومعدلات التنفس IV-تعتمد يمكن قياسها.

قياسات التنفس الخلوي توفر نظرة ثاقبة قدرة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا محددة لالمجمعات من الأول إلى الرابع، سلامة الميتوكوندريا والطاقة والتمثيل الغذائي ^{1، 2، 3.} واحد من الأجهزة التي تتيح قياس استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا مع دقة عالية، قرار والحساسية هي عالية الدقة oxygraph ^4. يحتوي الجهاز عالية الدقة oxygraph غرفتين مع منافذ الحقن وتم تجهيز كل غرفة مع جهاز استشعار الأكسجين البولاروجرافي. وأثار الخلوية أو معزولة تعليق الميتوكوندريا مستمر في مقياس التنفس. لتقييم وظيفة الميتوكوندريا، ركائز ومثبطات للنشاط معقد الميتوكوندريا يمكن أن تضاف التالية البروتوكولات القياسية. ركائز ومثبطات يمكن معاير التي كتبها الباحث حقنس مخادع oxygraph، ومعدلات استهلاك الأوكسجين وتحسب باستخدام البرمجيات ويعبر عنه picomoles في الثانية الواحدة في عدد من الخلايا. يقدم عالية الدقة قياس التنفس العديد من المزايا الأجهزة الكهربائي الأكسجين البولاروجرافي التقليدية والتقليدية بما في ذلك زيادة الحساسية والقدرة على العمل مع أعداد صغيرة من عينات بيولوجية مثل خلايا سليمة أو permeabilized. وبالإضافة إلى ذلك، كل جهاز يحتوي على غرفتين، ومعدلات التنفس يمكن تسجيلها في وقت واحد لمقارنة تركيزات الأكسجين. لديه عالية الدقة oxygraph أيضا ميزة تقليل تسرب الأوكسجين من غرف جهاز مقارنة بالأجهزة الأكسجين الكهربائي التقليدية البولاروجرافي. جهاز آخر وضعت مؤخرا لقياس استهلاك الأوكسجين الخلوية هو 96-جيدا محلل تدفق خارج الخلية ^5. وقد تم تجهيز محلل تدفق خارج الخلية مع مضان بدلا من أجهزة الاستشعار البولاروجرافي. مزايا خارج الخليةلذا محلل تدفق مقارنة مع ذات الدقة العالية oxygraph هي ط) هو جهاز آلي إلى حد كبير، والثاني) أنه من الممكن لقياس استهلاك الأوكسجين في 24- ولوحات 96-جيدا لفحص الإنتاجية العالية، التي تتطلب كميات أقل من العينات البيولوجية، وج) قياس إضافية من تدفق حال السكر الخلوي هو ممكن. مساوئ محلل تدفق خارج الخلية بالمقارنة مع ذات الدقة العالية oxygraph هي ط) التكاليف العالية للجهاز والمواد الاستهلاكية مثل لوحات نيون، والتي هي غير قابلة لإعادة الاستخدام، والثاني) مركبات أربعة فقط في فحص / جيد هي غالبا عن طريق الحقن وبالتالي فإن هذا النظام لا يمكن لبروتوكولات المعايرة الركيزة uncoupler المانع.

في هذه الدراسة، ونحن نستخدم عالية الدقة قياس التنفس لتحديد التنفس الميتوكوندريا. للتجارب استهلاك الأوكسجين الخلوية، وpermeabilized الخلايا لتسمح بدخول ADP خارجي وركائز الميتوكوندريا أكسدة لتغذية الإلكترونات إلى المركبالصورة من الجهاز التنفسي. هذا النهج يسمح للتشريح من المجمعات الميتوكوندريا الفردية قدرات الجهاز التنفسي، والذي هو ميزة واضحة مقارنة مع خلايا سليمة (العديد من ركائز هي الخلية impermeant). ومع ذلك، فإن غشاء الخلية permeabilization تعطيل الحاجز بين العصارة الخلوية والفضاء خارج الخلية والمتوسطة (تغسل المواد المذابة عصاري خلوي) وتشكيل الفضاء داخل الخلايا ومعايرتها مع المتوسط ​​خارج الخلية. واحدة من مساوئ الخلايا permeabilized على خلايا سليمة هو أن الغشاء الخارجي الميتوكوندريا يمكن أن تتلف إذا استخدمت كميات كبيرة من المنظفات خلال permeabilization الخلية. في خلايا سليمة، القاعدية، إلى جانب وفكت التنفس من خلايا سليمة يمكن قياسها. هذه طريقة تقييم استهلاك الأوكسجين من خلايا سليمة من دون إضافة ركائز الخارجية وشرطة أبوظبي، إعادة إنتاج وظيفة الجهاز التنفسي في خلية متكاملة، وكذلك توفير المعلومات عن الأقصى TRANSPO الإلكترون الميتوكوندرياالقدرة غ ^{6 و 7.} واحدة من مزايا خلايا سليمة على الخلايا permeabilized هو أن البيئة الخلوية لا تتعطل والميتوكوندريا على اتصال مع مكونات كاملة من الخلايا. من أجل permeabilize غشاء البلازما الخلوي، وقد استخدمت المنظفات مثل ديجيتونين ^8. ومع ذلك، الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي يمكن أن يتعرض للخطر إذا استخدمت كميات كبيرة من ديجيتونين. للتأكد من أن الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي عدم المساس في الخلايا permeabilized، يتم تنفيذ المعايرة ديجيتونين لتحديد تركيز الأمثل لpermeabilization الخلوي. لهذه التجارب، ومعلق الخلايا في المتوسط ​​التنفس ومعاير تركيز ديجيتونين بواسطة قياس التنفس في وجود ركائز الميتوكوندريا وشرطة أبوظبي، ومعدلات التنفس وقياس. لا يتم تحفيز التنفس من خلايا سليمة وغير permeabilized بحضور mitochoركائز ndrial وشرطة أبوظبي. ومع ذلك، فإن اللاحقة المعايرة ديجيتونين تدريجي تسفر permeabilization التدريجي للأغشية البلازما، ويتم الحصول على التركيز ديجيتونين الأمثل. ويتضح ذلك من زيادة التنفس حتى permeabilization الكامل. جودة الميتوكوندريا وسلامة الغشاء الخارجي يمكن التحقق منها من خلال إضافة خارجية السيتوكروم ج ^{2، 9.} السيتوكروم هو 12 كيلو دالتون الإلكترون البروتين الدفترية للالميتوكوندريا سلسلة نقل الإلكترون ^{10 و 11 و 12.} يكون موضعيا في الفضاء intermembrane الميتوكوندريا، وتشارك في استهلاك الأوكسجين، ويحمل الإلكترونات من مجمع الثالث إلى الرابع معقدة. مرة واحدة تلف الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، يتم تحريرها السيتوكروم ج، ويتم تقليل استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا. على إضافة الخارجية السيتوكروم ج، أي زيادة في التنفس الميتوكوندريا هو مؤشر علىتعطلت الغشاء الخارجي الميتوكوندريا.

في الخلايا permeabilized، ركائز ومثبطات النشاط المعقد الميتوكوندريا وأضاف التالية بروتوكولات مختلفة ^{3، 9.} على سبيل المثال من أجل التحقيق في وتيرة التنفس الميتوكوندريا يحركها المجمع، وبروتوكول التالية يمكن استخدامها. بعد permeabilization من الخلايا، أولا أنا معقدة يتم تحفيز من قبل مالات ركائز والغلوتامات، التي تولد NADH باعتبارها الركيزة إلى السلسلة التنفسية واستفزاز تفعيل أولا تعقيدا بعد ذلك، يتم إضافة ADP لتحويلها إلى ATP (الدولة 3، نشط أنا التي تعتمد على مجمع التنفس). بعد الوصول إلى إشارة مستقرة، وتدار روتينون (مجمع الميتوكوندريا أنا المانع) لمنع أولا معقدة ويتبع روتنون التي كتبها السكسينات إلى القوات المسلحة الهايتية ₂ وتفعيل مجمع الثاني (الدولة 3، ونشط مجمع التنفس II-التابعة). من أجل قياس معقدة التنفس التي تعتمد على الرابع، أول مجمع الثالثهو تحول دون التنفس معتمد على طريق إضافة أنتيمايسين إيه (الميتوكوندريا مجمع الثالث المانع). بعد ذلك، يتم تحفيز معقدة التنفس التي تعتمد على الرابع بالإدارة أسكوربات وtetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD يمكن لصناعة السيارات في أكسدة في المخزن المؤقت التنفس، وبالتالي يتم احتساب الأقصى معقدة معدل التنفس التي تعتمد على الرابع (الدولة 3) عن طريق طرح معدلات التنفس قبل وبعد إضافة أزيد الصوديوم، مثبط لالرابع معقدة الميتوكوندريا. ويمكن إجراء التجارب التنفس في غرفتين من oxygraph في مواز واحد بمثابة التحكم (الخلايا unstimulated)، وأخرى تحتوي على خلايا حفز. ومن الواضح أن الخلايا يمكن أن تكون مرحلة ما قبل المعاملة بطرق مختلفة، على سبيل المثال، مع العقاقير التي تؤثر على وظائف الميتوكوندريا، قبل أن يتم قياس استهلاك الأكسجين في الغرفة oxygraph. يسمح هذا البروتوكول الفحص الوظيفي للمجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا الفردية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن قياس ADP-حفز القصوىالتنفس (الدولة 3) من الخلايا permeabilized، وذلك باستخدام الأحماض الدهنية خارجي في شكل بالميتات. في هذا البروتوكول، ومترافق الأسهم تتركز بالميتات الصوديوم مع الأحماض الدهنية جدا البقري مجانا ألبومين المصل (BSA) (6: 1 المولي نسبة بالميتات: BSA). بعد ذلك، الخلايا أولا وpermeabilized مع التنفس ديجيتونين والميتوكوندريا يتم تقييمها من خلال إضافة الكارنيتين وبالميتات تليها إضافة ADP (الدولة 3، التنفس القصوى). ثم، يضاف أوليغوميسين لتقليد الدولة 4 (4O الدولة) ونسبة سيطرة الجهاز التنفسي (RCR قيمة) يتم احتساب كدولة 3 / دولة 4O. β للأكسدة تعزز إنتاج الاسيتيل جنة الزراعة (الذي يدخل في دورة TCA) والجيل القوات المسلحة الهايتية ₂ و NADH، والإلكترونات التي تم تمريرها إلى سلسلة نقل الإلكترون من بروتين فلافيني-نقل الإلكترون وβ-هيدروكسي، لجنة الزراعة نازعة. الميتوكوندريا هي في مركز استقلاب الأحماض الدهنية وصفت بروتوكول بالميتات-BSA يمكن استخدامها من قبل الباحثين دراسة الدهونتاي أكسدة الأحماض. في خلايا سليمة، تضاف تفعيل ومثبطات النشاط المعقد الميتوكوندريا التالية بروتوكول آخر ^{6 و 9.} لهذه التجارب، ويتم قياس استهلاك الأوكسجين الأول من خلايا غير permeabilized في غياب ركائز الخارجية (phosphorylating معدل التنفس). ثم، يتم قياس معدل التنفس غير phosphorylating بعد إضافة أوليغوميسين، الذي هو المانع من سينسيز ATP الميتوكوندريا. بعد ذلك، يتم إدارتها من protonophore الكربونيل السيانيد ف trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) بتركيزات مختلفة ويتم قياس معدل التنفس وفكت الميتوكوندريا القصوى. Protonophores مثل FCCP يمكن أن تحفز على زيادة في نفاذية بروتون من الغشاء الداخلي، والسماح حركة سلبية من البروتونات لتبديد التدرج التناضح الكيميائي. زيادة نفاذية بروتون uncouples التنفس الأكسدة (أي إنتاج ATP) ويستحث زيادة في ساستهلاك xygen. بعد ذلك، يتم إضافة روتينون وأنتيمايسين إيه لمنع التنفس الميتوكوندريا، ويتم طرح التنفس غير الميتوكوندريا من كل الأسعار الجهاز التنفسي الأخرى.

ويمكن التعبير عن معدلات استهلاك الأوكسجين كما IO ₂ [بمول س ثانية ^-1 × 10 ^-6 الخلايا] (تدفق الأوكسجين في خلايا مليون) والذي يحسب بقسمة حجم معين تدفق الأكسجين (في غرفة الأوكسجين مغلقة)، JV، يا ₂ [بمول س ثانية ^-1 س ^-1 مل] من تركيز خلية في غرفة الخلية (عدد الخلايا في حجم [10 ⁶ خلايا ∙ مل ^{1]) 15.} خلايا الشامل محدد تدفق الأكسجين، JO ₂ [بمول س ثانية س ^-1 ملغ ^-1]، هو تدفق في الخلية، IO ₂ [بمول س ثانية ^-1 × 10 ^-6 خلايا]، مقسوما على كتلة كل خلية [ملغ ∙ 10 ⁶ خلايا]. أو حجم معين تدفق، JV، O ₂ [بمول س ثانية ^-1 س ^-1 مل]، مقسوما على كتلة في المجلدأوميا [ملغ ∙ مل ^1]. JO ₂ هو تدفق الأكسجين في بروتين الخلية، الوزن الجاف أو حجم الخلية.

في هذه الدراسة باستخدام عالية الدقة قياس التنفس، نحن تصف بروتوكولات لتحديد ط) تركيز ديجيتونين الأمثل لكامل permeabilization الخلوي غشاء البلازما (ديجيتونين المعايرة فحص)، ب) الميتوكوندريا الخارجي سلامة غشاء باستخدام خارجية السيتوكروم ج، ج) الميتوكوندريا المجمعات السلسلة التنفسية أنا ومعدلات التنفس القصوى الثاني والرابع في الخلايا HepG2-permeabilized ديجيتونين في حضور ADP خارجي والميتوكوندريا ركائز السلسلة التنفسية، والرابع) القاعدية، إلى جانب والقصوى التنفس وفكت (أقصى طاقة النقل الإلكترون) من خلايا سليمة من دون إضافة ركائز الخارجية وADP، إعادة إنتاج وظيفة الجهاز التنفسي في خلية متكاملة.

Protocol

1. خلية ثقافة

1. ثقافة الخلايا البشرية الكبدي HepG2 ⁶ في 25 سم ² قوارير زراعة الخلايا في المتوسط Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) تحتوي على 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة (5٪ CO _2، 95٪ الهواء) (البذر الكثافة: 1 × 10 ⁶ خلايا في 25 سم ² خلية الثقافة قارورة، فترة حضانة في الحاضنة 37 درجة مئوية: 48 ساعة، كثافة الخلايا في confluency: 4-5 × 10 ⁶ خلايا في 25 سم قارورة الثقافة ² الخلية).
2. إجراء التجارب عندما الخلايا هي 90٪ إلى 95٪ متموجة.

2. عالية الدقة قياس التنفس معايرة مجسات الأكسجين البولاروجرافي

1. ماصة 2.1 مل من العازلة التنفس الى غرفة oxygraph ويقلب المخزن المؤقت باستمرار باستخدام شريط التحريك المغناطيسي موجودة في الغرفة (700 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة حتى إشارة مستقر تدفق الأكسجين ليتم الحصول على الأوكسجين الاستشعار البولاروجرافي.
   ملاحظة: الأقطاب الأكسجين البولاروجرافي داخل كل تركيز قياس الأكسجين غرفة oxygraph وحساب استهلاك الأوكسجين (تدفق) في كل غرفة. يتم عرض تركيز الأكسجين ومعدلات استهلاك الأوكسجين (تدفق) في الوقت الحقيقي على الانترنت في جهاز الكمبيوتر باستخدام برنامج للحصول على البيانات وتحليلها.
2. إجراء معايرة الهواء من الأوكسجين الاستشعار البولاروجرافي وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة ^14.
   ملاحظة: يتم تنفيذ معايرة أجهزة استشعار الأكسجين البولاروجرافي في وسائل الإعلام التنفس وتركيز الأكسجين في وسائل الإعلام في تشبع الهواء درجة الحرارة التجريبية فقط مرة واحدة يوميا في الصباح. بعد ذلك وسائل الإعلام يمكن إزالتها من الدوائر والخلايا معلق في وسائل الإعلام التنفس جديدة تضاف إلى غرفة oxygraph ويتم قياس وتيرة التنفس. بعد التجربة الأولى، وغرفة يمكن غسلها وسلسلة إضافية من التجارب لا يمكن أن يؤديها في تيانه نفس الغرفة دون مزيد من المعايرة.

3. Trypsinization من خلايا منتسب، عد خلايا

1. في يوم من التجربة، ونضح DMEM من 25 سم ² خلية قارورة الثقافة.
2. شطف أحادي الطبقة زراعة الخلايا في قارورة الثقافة مع 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
3. ماصة 0.5 مل من 25 ملغ / مل من محلول التربسين (prewarmed إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي 37 ° C) في أحادي الطبقة خلية في قارورة الثقافة واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة (5٪ CO ₂ ، 95٪ الهواء).
4. ماصة 5 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS إلى خلايا منفصلة في قارورة زراعة الخلايا وتعليق الخلايا من قبل pipetting.
5. نقل معلق الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 x ج في درجة حرارة الغرفة وصب وطاف.
6. resuspend الكرية خلية في 1 مل من التنفس عازلة ¹³ (T قادرة 1).
ط> عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا و resuspend لهم في المخزن المؤقت التنفس إلى الكثافة النهائية من 1 × 10 ⁶ خلية / مل. منذ سيتم تطبيع معدلات التنفس الخلوية لعدد الخلايا، عد الخلايا مع عداد الخلايا صحيحة ودقيقة.

4. عالية الدقة قياس التنفس

1. بعد معايرة الهواء (يؤديها مرة واحدة فقط يوميا، الخطوات 2.1-2.2)، نضح في والمتوسطة التنفس من غرفة من oxygraph وإضافة 2.1 مل من تعليق خلية (1 × 10 ⁶ خلية / مل) من الخطوة 3.7 إلى الغرفة.
2. إغلاق غرفة oxygraph ذلك بإدخال سدادة.
3. تحريك الخلايا بشكل مستمر باستخدام شريط التحريك المغناطيسي موجودة في الغرفة (700 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 5-10 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
   ملاحظة: تركيز الأوكسجين وإشارة الأكسجين تدفق يتم عرض في الوقت الحقيقي على الانترنت في جهاز الكمبيوتر باستخدام برنامج للحصول على البيانات وتحليلهاالصورة = "XREF"> 14.
4. بعد ذلك، وضخ ركائز ومثبطات للتنفس الميتوكوندريا من خلال الموانئ حقن التيتانيوم من سدادات باستخدام البروتوكولات التالية.

5. ديجيتونين المعايرة في خلايا سليمة من قياس التنفس

1. إعداد تعليق خلية غرفة oxygraph تحتوي على (1 × 10 ⁶ / مل) بعد الإجراء هو موضح في الخطوات 4،1-4،3 من البروتوكول.
2. حقن 2 ميكرولتر من 0.2 ملي روتينون (0.2 ميكرومتر) 'تنبيه' إلى غرفة oxygraph تحتوي على تعليق خلية عن طريق ميناء حقن التيتانيوم سدادة الغرفة باستخدام حقنة وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 5-10 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تدفق .
   ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الحقن في الخطوات التالية من خلال الموانئ حقن التيتانيوم من سدادات باستخدام الحقن. إضافة روتينون اختيارية (يمنع تدفق الإلكترونات العكسي) ويمكن حذف للتجارب المعايرة ديجيتونين، انظرخطوة 6.3.
3. ضخ 20 ميكرولتر من 1 M السكسينات (10 ملم) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 5-10 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
4. ضخ 10 ميكرولتر من 0.5 M ADP (2.5 ملم) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 5-10 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
5. حقن 2 ميكرولتر من 2 ملي ديجيتونين (2 ميكرومتر) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 2-5 دقائق حتى يتم التوصل إلى إشارة الأوكسجين مستقرة.
6. مرة أخرى لضخ 2 ميكرولتر من 2 ملي ديجيتونين في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 2-5 دقائق حتى يتم التوصل إلى إشارة الأوكسجين مستقرة.
   ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك بالتدريج من ديجيتونين إلى الخلايا تحفز زيادة في استهلاك الأوكسجين الخلوية وإشارة الأكسجين تدفق وزيادة.
7. تواصل عن طريق الحقن 2-4 ميكرولتر من 2 ملي تدريجي ديجيتونين (2-4 ميكرومتر كل خطوة) في الغرفة. بعد كل خطوة، تسجيل التنفس الخلوي لمدة 2-5 مفي حين حقق استقرارا إشارة الأكسجين تغير مستمر.
   ملاحظة: إيقاف ضخ ديجيتونين عندما تصل إشارة الأكسجين تدفق مستوى الحد الأقصى وحقن مزيد من ديجيتونين لا يزيد من معدل التنفس. يجب على القراء تحديد تركيز ديجيتونين الأمثل في مختبراتهم باستخدام الكواشف الخاصة واستخدام الحصول على تركيز ديجيتونين الأمثل في الخطوات 6.2 و 7.2 من البروتوكولات التالية لتجاربهم.

6. تقييم غشاء النزاهة الميتوكوندريا الخارجي: السيتوكروم C

1. إعداد تعليق خلية غرفة oxygraph تحتوي على (1 × 10 ⁶ / مل) بعد الإجراء هو موضح في الخطوات 4،1-4،3 من البروتوكول.
2. حقن 2 ميكرولتر من 8 ملي ديجيتونين (8 ميكرومتر) في غرفة oxygraph التي تحتوي على تعليق خلية (1 × 10 ⁶ / مل)، وpermeabilize الخلايا لمدة 5 دقائق.
3. ضخ 20 ميكرولتر من 1 M السكسينات (10 ملم) في غرفة oxygraph وتسجيل respirat الخلويايون لمدة 5-10 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
4. ضخ 10 ميكرولتر من 0.5 M ADP (2.5 ملم) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 5-10 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
   ملاحظة: إضافة ADP إلى الخلايا تحفز أنا معقدة وتحفز زيادة في استهلاك الأوكسجين، وسوف إشارة الأكسجين تدفق زيادة واستقرار.
5. حقن 5 ميكرولتر من 4 مم السيتوكروم ج (10 ميكرومتر) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 5-10 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
6. وأخيرا حقن 1 ميكرولتر من 4 ملغ / مل أوليغوميسين (2 ميكروغرام / مل)، وتسجيل التنفس الخلوي حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.

7. التنفس حفز ADP-القصوى (الدولة 3) من خلايا Permeabilized HepG2

1. إعداد تعليق خلية غرفة oxygraph تحتوي على (1 × 10 ⁶ / مل) بعد الإجراء هو موضح في الخطوات 4،1-4،3 من البروتوكول.
2. حقن 2 ميكرولتر من 8 ملي ديجيتونين (8 ميكرومتر) في غرفة oxygraph التي تحتوي على تعليق خلية وpermeabilize الخلايا لمدة 5 دقائق.
3. ضخ 12.5 ميكرولتر من 0.8 M من مالات (5 ملم) و 10 ميكرولتر من 2 M من الغلوتامات (10 ملم) في غرفة oxygraph. ويتحقق التنفس الخلوي رقم قياسي حتى مستقر إشارة الأكسجين تغير مستمر.
4. ضخ 10 ميكرولتر من 0.5 M ADP (2.5 ملم) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى الأكسجين زيادات إشارة تدفق واستقرار.
   ملاحظة: إضافة ADP إلى الخلايا تحفز زيادة في استهلاك الأوكسجين وإشارة الأكسجين تدفق وزيادة.
5. حقن 2 ميكرولتر من 0.2 ملي روتينون (0.2 ميكرومتر) 'تنبيه' إلى غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى انخفاض إشارة الأكسجين تدفق واستقرار.
6. بعد ذلك، وضخ 20 ميكرولتر من 1 M السكسينات (10 ملم) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى الزيادات إشارة الأكسجين تدفقوتستقر.
7. ثم، وضخ 2 ميكرولتر من 5 ملم أنتيمايسين إيه (5 ميكرومتر) 'تنبيه' إلى غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى انخفاض إشارة الأكسجين تدفق واستقرار.
8. ثم ضخ 2.5 ميكرولتر من 0.8 ملي أسكوربات (1 ملم) وعلى الفور بعد حقن 2.5 ميكرولتر من 0.2 ملي TMPD (0.25 ملم) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى الأكسجين زيادات إشارة تدفق واستقرار.
9. وأخيرا حقن 10 ميكرولتر من 1 M أزيد الصوديوم (5 ملم) 'تنبيه' إلى غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى انخفاض إشارة الأكسجين تدفق واستقرار.

8. استهلاك الأكسجين للخلايا السليمة

1. إعداد تعليق خلية غرفة oxygraph تحتوي على (1 × 10 ⁶ / مل) بعد الإجراء هو موضح في الخطوات 4،1-4،3 من البروتوكول.
2. حقن 1 ميكرولتر من 4 ملغ / مل أوليغوميسين (2 ميكروغرام / مل) في غرفة oxygraph تحتوي على تعليق خليةويتحقق د قياسي التنفس الخلوي حتى مستقر إشارة الأكسجين تغير مستمر.
3. بعد ذلك حقن 1 ميكرولتر من 0.2 ملي من FCCP (0.1 ميكرومتر) 'تنبيه' إلى غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى الأكسجين زيادات إشارة تدفق واستقرار.
4. ضخ 3 ميكرولتر من 0.2 ملي من FCCP (0.4 ميكرومتر) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى الزيادات إشارة الأكسجين تدفق المزيد واستقرار.
5. عاير FCCP في 0،1-0،3 ميكرومتر الخطوات عن طريق حقن 1-3 ميكرولتر من 0،2-1 ملم FCCP (0،1-2 ميكرومتر تركيز النهائي في الغرفة) في غرفة oxygraph حتى تصل إشارة الأكسجين تدفق المستويات القصوى وأي زيادات أخرى ثم يبدأ في الانخفاض.
   ملاحظة: إيقاف ضخ FCCP عندما تصل إشارة الأكسجين مستوى الحد الأقصى ويبدأ في الانخفاض.
6. ثم، وضخ 2 ميكرولتر من 0.2 ملي روتينون (0.2 ميكرومتر) و 2 ميكرولتر من 5 ملم أنتيمايسين إيه (5 ميكرومتر) في الغرفة. سجل التنفس حتى رانه الأكسجين تدفق انخفاض إشارة واستقرار.

Results

تحديد الأمثل ديجيتونين تركيز الخلوية Permeabilization: ديجيتونين المعايرة تجربة

يتم تنفيذ ديجيتونين المعايرة لتحديد تركيز الأمثل لpermeabilization الخلايا HepG2. لهذه التجارب، ومعاير ديجيتونين في خلايا سليمة في وجود روتينون، السكسينات (الميتوكوندريا المجمع الثاني الركيزة) وكمية تشبع من ADP تقاس، وأمراض الجهاز التنفسي معدلات في الأساس وبعد كل (مجمع II-...

Discussion

وكان الهدف من هذا البروتوكول إلى استخدام عالية الدقة قياس التنفس لقياس المجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا "(I-IV) وتيرة التنفس، أقصى قدرة نظام نقل الإلكترون الميتوكوندريا والميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي.

هناك بعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. أولا، وتطبيع معدلات استهلاك الأوكسجين الخلوية عادة إلى عدد من الخلايا (بمول / [ثانية × عدد خلايا]). لذلك، قبل مراقبة استهلاك الأكسجين الخلوية، فمن الأهمية...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical ، تذوب في الإيثانول
Ascorbate	Merck	1.00127	الكيميائية
BSA	Sigma	A 6003	الكيميائية
FCCP	Sigma	C 2920	الكيميائية ، تذوب في الإيثانول
عداد الخلايا الآلي الكونتيسة   ؛	Thermo Fisher Scientific	N / A	أداة عد الخلايا الآلي
Cytochrome c	Sigma	C 7752
Chemical Digitonin	Sigma	D 5628	الكيميائية ، تذوب في DMSO
DMEM	Gibco	31966021	متوسطة
EGTA	fluka	3779	الكيميائية
FBS	Gibco	26010-074	مكون متوسط
الغلوتامات	سيجما	جي 1626	الكيماوية
هيبس	سيجما	H 7523	الكيميائية
KCl	ميرك	1.04936	كيميائي
KH2< / sub>PO4< / sub>	Merck	1.04873	كيميائي
K-lactobionate	Sigma	L 2398	كيميائي
MgCl2< / sub>	سيجما	إم 9272	كيميكال
O2K-كور: Oxygraph-2k & nbsp ؛	Oroboros Instruments	10000-02	أداة قياس إعادة التدوير عالية الدقة
Oligomycin	Sigma	O 4876	الكيميائية ، تذوب في الإيثانول
البنسلين الستربتومايسين	جيبكو	15140122	الكيميائية
أزيد الصوديوم	Sigma	S2002	الكيميائية
Rotenone	Sigma	R 8875	الكيميائية ، تذوب في الإيثانول
سكسينات	سيجما	S 2378	التورين الكيميائي
	سيجما	T 8691	الكيماكيال
TMPD	Sigma	T 3134	الكيماوية
التربسين	سيجما	T 4674	الكيميائية