مقالة منهجية

عالية الدقة قياس التنفس لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في Permeabilized وخلايا سليمة

DOI:

10.3791/54985

⸱

فبراير 8, 2017

 , 
1Department of Intensive Care Medicine, Inselspital, Bern University Hospital, University of Bern

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم عالية الدقة قياس التنفس لتحديد استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا. هذا هو أسلوب واضحة لتحديد المجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا "(I-IV) وتيرة التنفس، أقصى قدرة الميتوكوندريا نظام نقل الإلكترون، والميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأوكسغراف عالي الدقة هو جهاز لقياس استهلاك الأكسجين الخلوي في نظام غرفة مغلقة بدقة وحساسية عالية جدا في العينات البيولوجية (الخلايا السليمة والنفاذة أو الأنسجة أو الميتوكوندريا المعزولة). تم تجهيز جهاز الأوكسجين عالي الدقة بغرفتين ويستخدم مستشعرات الأكسجين البولاروغرافي لقياس تركيز الأكسجين وحساب استهلاك الأكسجين داخل كل غرفة. يتم حساب معدلات استهلاك الأكسجين باستخدام البرنامج ويتم التعبير عنها على أنها بيكومول في الثانية لكل عدد من الخلايا. تحتوي كل غرفة أوكسغراف عالية الدقة على سدادة مع منافذ حقن، مما يجعلها مثالية لعمليات المعايرة بالتحليل الحجمي لمثبطات فصل الركيزة أو بروتوكولات معايرة المنظفات لتحديد التركيزات الفعالة والمثلى لنفاذية غشاء البلازما. يمكن تطبيق هذه التقنية لقياس التنفس في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا وتوفر أيضا معلومات عن جودة الميتوكوندريا وسلامتها ، وقدرة نظام نقل الإلكترون التنفسي للميتوكوندريا القصوى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا الوفاء أدوارا هامة في التمثيل الغذائي للطاقة الخلوية، وخاصة باستخدام الأكسجين لإنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). كانوا متورطين في موت الخلايا وفي العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان. الفسفرة المؤكسدة الميتوكوندريا (OXPHOS) يجمع بين نقل الإلكترون على طول سلسلة نقل الإلكترون مع استهلاك الأكسجين والتوليف اعبي التنس المحترفين. وتشارك حمض (TCA) دورة الثلاثي الكربوكسيل الميتوكوندريا في تحويل البروتينات والكربوهيدرات والدهون إلى طاقة المركبات الغنية ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد الأدينين (NADH) وفلافين ثنائي النوكليوتيد الأدينين (القوات المسلحة الهايتية 2). ثم يتم نقل الإلكترونات من NADH والقوات المسلحة اله....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلية ثقافة

  1. ثقافة الخلايا البشرية الكبدي HepG2 6 في 25 سم 2 قوارير زراعة الخلايا في المتوسط Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) تحتوي على 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة (5٪ CO 2، 95٪ الهواء) (البذر الكثافة: 1 × 10 6 خلايا في 25 سم 2 خلية الثقافة قارورة، فترة حضانة في الحاضنة 37 درجة مئوية: 48 ساعة، كثافة الخلايا في confluency: 4-5 × 10 6 خلايا في 25 سم قارورة الثقافة 2 الخلية).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد الأمثل ديجيتونين تركيز الخلوية Permeabilization: ديجيتونين المعايرة تجربة

يتم تنفيذ ديجيتونين المعايرة لتحديد تركيز الأمثل لpermeabilization الخلايا HepG2. لهذه التجارب، ومعاير ديجيتونين في خلايا سليمة في وجود روتينون، السكسينات (الميتوكوندريا المجمع الثاني الركيزة) وكمية تشبع من ADP تقاس، وأمراض الجهاز التنفسي معدلات في الأساس وبعد كل (مجمع II-.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان الهدف من هذا البروتوكول إلى استخدام عالية الدقة قياس التنفس لقياس المجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا "(I-IV) وتيرة التنفس، أقصى قدرة نظام نقل الإلكترون الميتوكوندريا والميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي.

هناك بعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. أولا، وتطبيع معدلات استهلاك الأوكسجين الخلوية عادة إلى عدد من الخلايا (بمول / [ثانية × عدد خلايا]). لذلك، قبل مراقبة استهلاك الأكسجين الخلوية، فمن الأهمية.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (Grant nº 32003B_127619).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ADPSigmaA 4386Chemical
Antimycin ASigmaA 8674Chemical ، تذوب في الإيثانول
AscorbateMerck1.00127الكيميائية
BSASigmaA 6003الكيميائية
FCCPSigmaC 2920الكيميائية ، تذوب في الإيثانول
عداد الخلايا الآلي الكونتيسة   ؛Thermo Fisher ScientificN / Aأداة عد الخلايا الآلي
Cytochrome cSigmaC 7752
Chemical DigitoninSigmaD 5628الكيميائية ، تذوب في DMSO
DMEMGibco31966021متوسطة
EGTAfluka3779الكيميائية
FBSGibco26010-074مكون متوسط
الغلوتاماتسيجماجي 1626الكيماوية
هيبسسيجماH 7523الكيميائية
KClميرك1.04936كيميائي
KH2< / sub>PO4< / sub>Merck1.04873كيميائي
K-lactobionateSigmaL 2398كيميائي
MgCl2< / sub> سيجماإم 9272كيميكال
O2K-كور: Oxygraph-2k & nbsp ؛Oroboros Instruments10000-02أداة قياس إعادة التدوير عالية الدقة
OligomycinSigmaO 4876الكيميائية ، تذوب في الإيثانول
البنسلين الستربتومايسينجيبكو15140122الكيميائية
أزيد الصوديومSigmaS2002الكيميائية
RotenoneSigmaR 8875الكيميائية ، تذوب في الإيثانول
سكسيناتسيجماS 2378التورين الكيميائي
سيجماT 8691الكيماكيال
TMPDSigmaT 3134الكيماوية
التربسينسيجماT 4674الكيميائية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
  2. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
  3. Zhang, J., et al.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة