يوضح هذا الأسلوب وسيلة فعالة لإعداد النسخ المتماثل أو المعيبة مخزونات فيروس ترميز الجين الورمي الإنسان ، واستخدمت لاحقا لتحريض مرض التكاثر النقيي في نموذج الفأر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنتاج النسخ المعيبة للفيروسات الارتدادية التي ترنسفكأيشن عابر للخلايا 293T
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لدينا مختبر دراسات الأمراض التي يسببها الإنسان من خلال التكاثر النقيي المسرطنة مثل BCR - ABL أو مستقبلات عامل النمو المشتق المسرطنة (ZNF198 - FGFR1 ، BCR - PDGFRα ، الخ). ونحن قادرون على نموذج ودراسة الأمراض التي تصيب البشر ، كما هو الحال في نموذج الفأر لدينا ، عن طريق زرع خلايا نخاع العظم المصاب سابقا مع الارتجاعي التعبير عن الجين الورمي في المصالح. النسخ المتماثل أو المعيبة الارتجاعي ترميز الجين الورمي الإنسان وتنتج علامة (GFP ، RFP ، والمضادات الحيوية الجينات المقاومة ، الخ) عن طريق بروتوكول ترنسفكأيشن عابرة باستخدام الخلايا 293T ، من حقوق الإنسان الكلوي خط الخلايا الظهارية تحويلها من قبل الجين المنتج E1A اتش. 293 الخلايا لديها خاصية غير معتادة للغاية التي يجري transfectable فوسفات الكالسيوم (كابو 4) ، مع ما يصل الى 50-80 ٪ كفاءة ترنسفكأيشن يمكن بلوغه بسهولة. هنا ، وشارك في 293 transfect نحن مع الخلايا ناقلات فيروسات التعبير عن الجين الورمي من الفائدة والبلازميد التي تعبر عن وظائف التغليف هفوة ، بول الحياة الفطرية ، مثل الجينوم واحدة والتغليف يبني القات أو PCL ، في هذه الحالة EcoPak البلازميد. كذلك تم تحسين ترنسفكأيشن الأولية باستخدام الكلوروكين. مخزونات فيروس ecotropic ، التي جمعت في 48 ساعة الثقافة طاف. بعد ترنسفكأيشن ، يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية وتستخدم للعدوى من خطوط الخلوي في ضوء التحول والدراسات في المختبر ، أو الخلايا الأولية مثل خلايا فأر نخاع العظام ، التي يمكن استخدامها للزراعة في نموذج الفأر لدينا .
البروتوكول
- في المساء قبل أن تحول الخلايا لوحة ، 293T في الخلايا 6 3 - 5x10 / 6 cultureplate الأنسجة سم.
ملاحظة : نحن نستخدم 293T الخلايا الخاصة بهم من أجل سهولة ترنسفكأيشن وخلايا الفيروس efficacyas المنتجة. هذه الخلايا هي نقص في التعبئة والتغليف للفيروس ما لم يتم إدخال المساعد البلازميد.
- في صباح اليوم الأول ، وإزالة بلطف المتوسطة واستبدالها مع 4 293T الخلية التي تحتوي على 25 مل بفندق الكلوروكين ملم. وضعت في الحاضنة لمدة 1 ساعة.
ملاحظة : لوحة يجب أن حوالي 80 ٪ متموجة.
- وفي الوقت نفسه ، يعد فيروس صنع الخليط لمدة 2 لوحات في كل مرة ، في أنابيب 5 مل :
- 2 × 10 ملغ بناء البلازميد فيروسات
- 2 × 5 ملغ التعبئة والتغليف بناء (EcoPak)
- 2 × 62 مل CaCl
- كاملة إلى 1 مل العقيمة مع O 2 DDH
ملاحظة : على الرغم من أن فيروسات البلازميد بترميز الجين الورمي المصالح وعلامة أ ، EcoPak بترميز هفوة بول - ENV. جنبا إلى جنب مع خلايا 293T ، فإنها تنتج الارتجاعي ecotropic (RV) محددة للخلايا فأر ، ولكن ليس معديا للخلايا البشرية. وقد تبين أن كلا الكلوروكين و 2 CaCl لزيادة الكفاءة ترنسفكأيشن.
- إضافة 1ml من sterileHBS 2X إلى مزيج من الحكمة انخفاض ، بينما vortexing بلطف الأنبوب.
- إضافة إلى هذا الحل فورا لوحات 2 ، 1 مل لكل منهما ، بلطف ، قطرة قطرة.
- وضع في حاضنة لل7-11 ساعات.
- في المساء (7-11 ساعات. في وقت لاحق) ، وإزالة بلطف المتوسط ، وبلطف جدا استبدال مع 5 مل المتوسطة 293T الطازجة. وضعت في الحاضنة حتى الظهر ، في اليوم التالي.
ملاحظة : هذه الخطوة الهامة ، كما تحتاج إلى خلع الكلوروكين من الخلايا. إذا كان يحتفظ بها لفترات طويلة من الزمن ، الكلوروكين هي سامة. الحل في لوحات تبدو غامضة ، وذلك بسبب هطول الأمطار ناعم جدا مثل الغبار ، من خليط ترنسفكأيشن.
ملاحظة : من المهم القيام بكل التغييرات وسائل الاعلام مع الرفق المدقع ، كما تم توعية الخلايا التي الكلوروكين ، ويمكن فصل بسهولة من لوحة.
- في اليوم التالي ، 18 إلى 24 ساعة. قبل استرداد فيروس (حوالي الظهر) ، وإزالة بلطف المتوسط ، وبلطف جدا استبدال مع 3 مل المتوسطة 293T الطازجة. استبدال في حاضنة O / N.
- في صباح اليوم الثالث (18-24 ساعة. احقا) ، وتمتص برفق على شكل لوحات متوسطة مع حقنة 10 مل مزودة بإبرة G 18. هذا طاف يحتوي على الفيروس الارتجاعي.
- تغيير الإبرة إلى حقنة تصفية 45 ملم ، وعكس عدة مرات حقنة لخلط الحل أيضا ، من خلال تمرير طاف التصفية ، وقسامة في cryotubes
ملاحظة : بدلا من ذلك ، إذا كنت ترغب بجعل + 3 لوحات من الفيروس ، وتجمع كل supernatants من الفيروس نفسه في أنبوب 5 مل 0 المخروطية. المزيج جيدا ، ثم supernatants قسامة التي تحتوي على الفيروس الارتجاعي في cryotubes بواسطة التصفية.
- يتم الاحتفاظ الأنابيب التي تحتوي على الفيروسات supernatants الكاملة في -80 درجة مئوية حتى استخدامها.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وأربع نقاط حاسمة ضمان نجاح الأسهم الجيدة فيروسية :
- الخلايا المنتجة 293T أن يكونوا أصحاء للغاية ، وهذا يعني أنهم قد انقسم على جدول منتظم للغاية ، لم تكن متضخمة ، ومطلية في كثافة الأمثل من 3،5-5٬000٬000 في 6 سم نسيج لوحة الثقافة ، بحيث تصل الكثافة 80 ٪ من لوحة في صباح يوم من ترنسفكأيشن.
- إضافة الكلوروكين يحسن كفاءة ترنسفكأيشن واللاحقة عيار الفيروس ، وح...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
يجب على جميع الكواشف المستخدمة في ترنسفكأيشن تكون عقيمة مفلتر (CaCl 2 ، 2X HBS ، miliQ H 2 O) وأبقى العقيمة.
المراجع
- DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
- Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes. Blood. 83, 43-50 (1994).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70, 5701-5705 (1996).
- Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
- Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).
- Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).
- Van Etten, R. A. Models of chronic myeloid leukemia. Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).
- Van Etten, R. A. Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice. Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
