Method Article

طريقة لقياس التمثيل الغذائي في التصنيف القطعان المجتمعات خلية مجمع عن طريق مستقر النظائر للبحث عن المفقودين

DOI:

10.3791/55011

⸱

February 4th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Unit of Computational Medicine, Karolinska Institutet, 2Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Division of Physiological Chemistry 2, Karolinska Institutet, 4Department of Medicine, University of California San Diego

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المقالة طريقة لدراسة التمثيل الغذائي الخلوي في المجتمعات المعقدة لأنواع الخلايا المتعددة ، باستخدام مزيج من تتبع النظائر المستقرة ، وفرز الخلايا لعزل أنواع معينة من الخلايا ، وقياس الطيف الكتلي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر أنواع خلايا الثدييات عملية التمثيل الغذائي المتخصصة ، وهناك أدلة كثيرة على أن أنواع الخلايا المختلفة المتعايشة تشارك في التعاون الأيضي. علاوة على ذلك ، حتى الثقافات من نوع خلية واحدة قد تحتوي على خلايا في حالات استقلابية مميزة ، مثل الخلايا المريحة أو ركوب الدراجات. تعد طرق قياس الأنشطة الأيضية لمثل هذه المجموعات الفرعية أدوات قيمة لفهم التمثيل الغذائي الخلوي. يتم فصل مجموعات الخلايا المعقدة بشكل شائع باستخدام فارز الخلايا ، ويمكن تحليل المجموعات السكانية الفرعية المعزولة بهذه الطريقة بطرق التمثيل الغذائي. ومع ذلك ، فإن مشكلة هذا النهج هي أن إجراء فرز الخلايا يعرض الخلايا لضغوط قد تشوه عملية التمثيل الغذائي لديها.

للتغلب على هذه المشكلات ، استنتجنا أن توزيعات النظائر الكتلية (MIDs) للمستقلبات من الخلايا المزروعة بعناصر غذائية مستقرة تحمل علامات النظائر من المرجح أن تكون أكثر استقرارا من تركيزات المستقلب المطلقة ، لأن MIDs تتشكل على نطاقات زمنية أطول ويجب أن تكون أقل تأثرا بالتعرض قصير المدى لظروف فرز الخلايا. هنا ، نصف طريقة تستند إلى هذا المبدأ ، تجمع بين فرز الخلايا وقياس الطيف الكتلي عالي الدقة للكروماتوغرافيا السائلة (LC-HRMS). يتضمن الإجراء تحليل ثلاثة أنواع من العينات: (1) مستخلصات المستقلب التي تم الحصول عليها مباشرة من السكان المعقدين. (2) مقتطفات من الخلايا "المصنفة الوهمية" التي مرت عبر أداة فرز الخلايا دون بوابات أي مجموعة محددة ؛ و (3) مقتطفات من المجموعات السكانية الفعلية التي تم فرزها. تتم مقارنة الخلايا المصنفة الوهمية بالاستخراج المباشر للتحقق من أن MIDs لم يتم تغييرها بالفعل من خلال إجراء فرز الخلايا نفسه ، قبل تحليل المجموعات السكانية الفعلية التي تم فرزها. نعرض أمثلة على النتائج من خلايا HeLa التي تم فرزها وفقا لمرحلة دورة الخلية ، مما يكشف عن التغيرات في استقلاب النيوكليوتيدات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكائنات العليا تحتوي على مجتمعات معقدة من أنواع الخلايا المتميزة التي تتعاون لتحقيق المزيد من الوظائف المعقدة. على سبيل المثال، وأورام تحتوي ليس فقط الخلايا السرطانية، ولكن أيضا الخلايا الليفية، الخلايا التي تشكل الأوعية الدموية، والخلايا في كثير من الأحيان المناعة تتسرب 1؛ يحتوي الدم على خليط معقد من عشرات الأنواع الفرعية الخلايا المناعية 2. ويمكن أن تتألف حتى خطوط خلايا مستنبتة من القطعان متعددة، مثل اللمعية وفرعية القاعدية من خلايا سرطان الثدي 3. وعلاوة على ذلك، أنواع الخلايا المتميزة التي تتعايش يمكن أن تظهر الأيض "التعاون". على سبيل المثال، في الدماغ،....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. المستقلب استخراج

  1. استخراج من الطبق
    1. خلايا الثقافة في لوحة 6 جيدا في يثلث في النظائر وصفت وسائل الإعلام ثقافة مستقرة + ملاحق مدال (المصل أو المكملات النمو الأخرى) حتى تصبح الخلايا 75٪ متموجة.
      ملاحظة: هنا ثقافة خلايا هيلا لمدة 48 ساعة في RPMI تحتوي على 40٪ U- 13 C-الجلوكوز و 70٪ U- 13 C، 15 N2-الجلوتامين و 5٪ مدال FBS (مصل بقري جنيني). يستخدم مدال FBS للتخلص من نواتج الأيض الوزن الجزيئي الصغيرة الت....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكمثال على ذلك، ونحن هنا وصف تجربة التحقيق في عملية التمثيل الغذائي للخلايا هيلا مرتبة وفقا لمرحلة دورة الخلية. لتسمية مجموعة واسعة من المركبات المركزية في كل من الكربون ونيتروجين، ونحن مثقف الخلايا لمدة 48 ساعة باستخدام U- 13 C-الجلوكوز وU- 13 C، N-15 الجلوتامين كأثر. للحصول على أجهزة الإنترنت النقالة الغنية للتجربة التحقق من صحة، اخترنا هنا خليط من 40٪ U- 13 C-الجلوكوز و 70٪ U- 13 C، 15<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويستند طريقتنا على مبدأ أن أجهزة الإنترنت النقالة في الأيض الخلوية تعكس "التاريخ" من الأنشطة الأيضية للخلية. هذا يجعل من الممكن للتحقيق في الأنشطة الأيضية في حيوانية من الخلايا، لأنها وقعت في المجتمع المعقدة من الخلايا، قبل الخلية إجراء الفرز. في المقابل، مناطق الذروة الأيض تختلف بشكل ملحوظ بين مقتطفات من خلايا فرزها واستخراج مباشرة من صحن الثقافة 11. في هذا الجزء لأن تكوين كيميائي مختلف يغير استجابة إشارة في مطياف الكتلة، وهو ما يسمى "تأثير .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور أنس كاملة على المساعدة القيمة في تحسين طرق قياس الطيف الكتلي ، وأنيكا فون فولينهوفن للمساعدة في فرز الخلايا. تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة السويدية للبحوث الاستراتيجية (رقم المنحة. FFL12-0220) والبرنامج الاستراتيجي في أبحاث السرطان (IR ، RN) ؛ المؤسسة السويدية للقلب والرئة (CEW ، HG) ؛ ومؤسسة ماري كاي (جي دبليو ، إم جي).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HBSSSigmaH6648
INFLUX (inFlux v7 Sorter)BD Biosciences
U-13< / sup>C-Glucoseنظائر كامبريدج40762-22-9 / GLC-018
U-13< / sup>C ، 15< / sup>N2-GlutamineCambridgeنظائر CNLM-1275-H-0.1
الميثانول (JT Baker) ، درجة HPLCVWR BAKR8402.2500
Ultrafree - MC - VV. Durapore PVDF 0.1 & micro; mMilliporeUFC30VV00
Ultimate 3,000 UHPLCThermo Fisher Scientific
Q-Exactive Orbitrap مطياف الكتلةThermo Fisher العلمي
Merk-Sequant ZIC عمود HILIC (150 مم × 4.6 > nbsp; مم ، 5 وميكرو ؛ م)Merck KGaA1.50444.0001
عمود الحماية Merk-Sequant ZIC HILIC (20 مم × 2.1 مم)Merck KGaA
Acetonitrile Optima LC-MS ، زجاج كهرمانيFisher ScientificA955-212
Milli-Q ماءMilliporeتم إنتاجه بنظام التدرج Milli-Q
Myrsyra 99.5٪ Optima (حمض الفورميك)11423423فيشر العلمي
قارورة لولبية X100 1.5 مل ، 8-425 32x11.6 مم ، كهرماني ، 100 وحدةThermo Fisher Scientific10560053
X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (أغطية لولبية) ThermoFisher Scientific12458636
ProteoMass LTQ / FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal MixSigma-AldrichMSCAL5طقم معايرة
SNAKESKIN 10K MWCO   ؛ثيرمو فيشر العلمي88245
Mathematica v.10 ولفرام للأبحاث
فلاتر الطرد المركزي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
  2. Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
  3. Prat, A., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stable Isotope TracingCell SortingMetabolite ExtractionLC HRMS AnalysisMass Isotopomer DistributionsCell Cycle SortingMock Sorted CellsMetabolic CollaborationNucleotide MetabolismFlow Cytometry

Related Articles