Method Article

القيطم البويضات: طرق الأمثل ل microinjection، إزالة طبقات الخلية مسامي، والتغييرات الحل السريع في التجارب الكهربية

DOI:

10.3791/55034

⸱

December 31st, 2016

 ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Bern

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصف الإجراءات المحسنة لعزل البصيلات المفردة ، والحقن المجهري للحمض النووي الريبي السيتوبلازمي ، وإزالة طبقات الخلايا المحيطة ، والتعبير البروتيني في بويضات Xenopus. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم طريقة بسيطة لتغييرات المحلول السريع في التجارب الفيزيولوجية الكهربية مع القنوات الأيونية ذات البوابات الترابطية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البويضة القيطم كنظام تعبير مغايرة للبروتينات، وصفت لأول مرة من قبل Gurdon وآخرون. 1، واستخدمت على نطاق واسع منذ اكتشافه (المراجع 2-3، والمراجع فيها). وهناك سمة أن يجعل البويضة جاذبية للتعبير قناة الخارجية هي وفرة الفقيرة من القنوات الأيونية الذاتية 4. وقد أثبت هذا النظام التعبير مفيد لتوصيف العديد من البروتينات، ومن بينها القنوات الأيونية بوابات يجند.

يوصف التعبير عن GABA ومستقبلات في البويضات القيطم وتوصيف وظيفي من هنا، بما في ذلك عزل البويضات، إبر دقيقة جدا مع كرنا، وإزالة طبقات الخلايا الجرابية، والتغيرات حل سريع في التجارب الكهربية. تم تحسين الإجراءات في هذا المختبر 5،6 وتحيد عن تلك التي تستخدم بشكل روتيني 7-9. تقليديا، يتم إعداد البويضات الجرداءمع العلاج لفترات طويلة كولاجيناز من فصوص المبيض في RT، وهذه البويضات الجرداء وmicroinjected مع مرنا. باستخدام الطرق الأمثل، وقد أعرب عن بروتينات الغشاء متنوعة ودرس مع هذا النظام، مثل المؤتلف مستقبلات GABA و10-12، وقنوات كلوريد البشرية المؤتلفة 13، المثقبيات قنوات البوتاسيوم 14، ونقل ميو -inositol 15 و 16.

يمكن تطبيق طرق مفصلة هنا للتعبير عن أي بروتين الاختيار في البويضات القيطم، والتغيير حل سريع يمكن استخدامها لدراسة قنوات الأيونات الأخرى بوابات يجند.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستخدم على نطاق واسع البويضات القيطم كنظام للتعبير (المراجع 2-3، والمراجع فيها). وهم قادرون على تجميع ودمج البروتينات multisubunit نشطة وظيفيا في أغشية البلازما الخاصة بهم بشكل صحيح. باستخدام هذا النظام، فمن الممكن للتحقيق وظيفيا بروتينات الغشاء وحدها أو بالاشتراك مع غيرها من البروتينات، لدراسة خصائص، خيالية، أو البروتينات متصلا تحور، ولفحص المخدرات المحتملة.

وتشمل مزايا استخدام البويضات على الأنظمة التعبير مغاير غيرها من معالجة بسيطة من الخلايا العملاقة، ونسبة عالية من الخلايا معربا عن المعلومات الوراثية الأجنبية، وتحكم بسيطة من بيئة البويضة عن طريق نضح حمام، والسيطرة على غشاء المحتملة .

عيب هذا النظام هو التعبير التفاوت الموسمي لوحظ في العديد من المختبرات 17-20. والسبب في هذا الاختلافأبعد ما يكون عن الوضوح. بالإضافة إلى ذلك، كثيرا ما لوحظ نوعية البويضات تختلف بشدة. وشملت الطرق التقليدية 7-9 عزلة فصوص المبيض، والتعرض للفصوص المبيض إلى كولاجيناز لبعض ساعة، واختيار من البويضات الجرداء، وحقن مكروي بويضة. هنا، وأفاد عدد من وإجراءات سريعة البديلة التي سمحت لنا للعمل مع هذا النظام التعبير لأكثر من 30 عاما مع عدم وجود التفاوت الموسمي واختلاف بسيط في نوعية البويضة.

طرق تعديل وتحسين وصفها هنا لعزل البويضات، حقن مكروي مع كرنا، وإزالة طبقات الخلايا الجرابية يمكن أن تستخدم للتعبير عن أي بروتين من خيار في البويضة القيطم. ويمكن تطبيق طريقة بسيطة جدا لتغيرات حل سريع للوسط حول البويضة لدراسة أي القناة الايونية بوابات يجند وناقلات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المحلية لكانتون برن Kantonstierarzt، Kantonaler Veterinärdienst برن (BE85 / 15).

1. إعداد القيطم البويضات

  1. الحفاظ على الضفادع (القيطم المورق) على 12 ساعة / 12 ساعة ضوء / دورة الظلام في المياه التي يتم الاحتفاظ بدقة عند 20 درجة مئوية.
  2. إزالة فصوص من المبيض من الضفادع الإناث 9.
    ملاحظة: إزالة الفصوص هي حافز للتجديد، وغالبا ما تكون نوعية البويضات يحسن مع الجراحة. وتغطي البويضة بواسطة طبقة المحي، وطبقة من خلايا بصيلات، والنسيج الضام التي تحتوي على الأوعية الدموية 21. ويطلق على هيكل كامل من "جراب".
  3. وضع فصوص من المبايض التي تعج المسام التي تحتوي على البويضات في العقيمة بارت المالحة 7 (MBS) تستكمل مع البنسلين والستربتومايسين (88 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم بوكل، 2.4 ملم NaHCO 3، 0.82 ملي MgSO 4، 0.41 ملي CaCl 2، 0.33 ملي كا (NO 3) 2، 10 ملم 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic. HEPES (7.5 درجة الحموضة، هيدروكسيد الصوديوم)، و 100 ميكروغرام / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين).
  4. واحد من مرحلة V-VI 21 بصيلات. عقد الفص المبيض مع ملقط. خفض حلقة البلاتين (الشكل 1) على بصيلات وسحب بلطف حلقة لعرقلة النسيج الضام التي تحتوي على بصيلات من أنسجة المبيض.
    ملاحظة: تتميز المرحلة V-VI 21 بصيلات عن حجمها (1،0-1،2 مم في القطر) وعلى النقيض جيدة بين نصف الكرة الحيوان مصطبغة داكنة ونصف الكرة نباتية صفراء.
  5. نقل فقط بصيلات أبحث صحية (أي كروية تماما ومع تصبغ سليمة) إلى 35 مم طبق بيتري بواسطة ماصة باستير البلاستيك (قطع مرة أخرى إلى قطر افتتاح 1.5 ملم).

"jove_title"> 2. Microinjection من مرنا في السيتوبلازم

ملاحظة: يتم اشتقاق نظام حقن مكروي الموصوفة هنا من ذلك الذي ذكرته Kressmann وBirnstiel 22.

  1. إعداد cRNAs من cDNAs منها الترميز لمفارز α β 4 2 δ GABA ومستقبلات بواسطة النسخ في المختبر، إضافة بولي (A +) الذيل، وتقدير الحمض النووي الريبي الكهربائي للهلام 23.
  2. إعداد الماصات حقن مكروي من الشعيرات الدموية البورسليكات الزجاج (1.0 ملم القطر الخارجي (OD)، 0.58 مم القطر الداخلي (ID)، و 100 ملم طول) باستخدام مجتذب micropipette. قطع نصائح من الزجاج الشعيرات الدموية تحت المجهر باستخدام micromanipulator وخييط لخلق قطرها غيض من 12-15 ميكرون مع طرف مشطوف.
  3. ردم ماصات حقن مكروي مع زيت البارافين باستخدام الحقنة 10 مل، ومن ثم تحميل ماصة حقن مكروي الصعود إلى ميكر homebuiltجهاز oinjection (الشكل 2).
    ملاحظة: يتكون جهاز حقن زيت هيدروليكي homebuilt من محرك شواء التي تسيطر عليها التبديل دواسة القدم. تبديل إضافي يتغير الوضع تحول من المحرك. هذا المحرك يقود المسمار ميكرومتر (0.5 ملم / بدوره) أن تتقدم أو تتراجع المكبس من حقنة زجاجية 10 ميكرولتر. والحقن بسرعة حوالي 3 دورة في الدقيقة و 0.5 بدوره يتوافق مع حقن NL 50 في المسام. يتم توصيل غيض من حقنة لأنابيب تترافلوروإيثيلين سميكة الجدران التي هي في حد ذاتها متصلة إبرة الحقن بواسطة قطعة قصيرة جدا من أنابيب Tygon. يقام الشعرية حقن بواسطة تشاك الحفر التي يسيطر عليها من قبل micromanipulator. شغل في النظام بأكمله مع زيت البارافين. وينبغي تجنب أي فقاعات الهواء، لأنها سوف تنال من نظام الحقن. يضيء الإعداد مع مصدر الضوء البارد. مطلوب مجهر تشريحي للسيطرة البصرية. وتصور بصيلات تحت الضوء البارد مع stereomicroscope (40X التكبير). يتم اختبار أداء الإعداد حقن عن طريق حقن التتبع المشعة في البويضات القيطم. وينبغي تسليم 55 NL في الحقن - وحدة تخزين من 45.
  4. باستخدام ماصة مع طرف بلاستيكية معقمة، اختبار الإعداد عن طريق وضع قطرات من الماء المعقم على الداخل نظيفة من بالحرارة مقاومة للرطوبة (2 × 2 سم). تزج غيض من ماصة الحقن في هذه القطيرات، ثم قم بتشغيل المحرك لسحب المكبس (الضغط السلبي داخل ماصة الحقن).
    ملاحظة: يجب أن المياه تدخل ماصة وتشكيل واجهة مرئية مع النفط.
  5. التراجع غيض من ماصة من الحبرية وتطبيق الضغط الايجابي إلى داخل ماصة الحقن. ينبغي أن تشكل قطرة ماء في غيض من ماصة الحقن.
  6. التحضير للحقن المسام من بطانة لهم حتى مع القطبين النباتية مشيرا صعودا في الفجوات من شبكة من النايلون (G: 0.8 مم) لصقها على الجزء السفلي من بيطبق الثلاثية (60 ملم) مغطاة MBS.
  7. الاستغناء 2 ميكرولتر من مرنا باستخدام ماصة مع طرف بلاستيكية معقمة على الداخل نظيفة من بالحرارة. خذ مرنا حتى في ماصة حقن عن طريق الضغط السلبي إلى داخل ماصة الحقن.
  8. ضع ماصة حقن أكثر من جراب الفردية باستخدام micromanipulator.
  9. إدراج إبرة حقن في مركز القطب النباتي وحقن 50 NL مرنا بمعدل تدفق 0.6 ميكرولتر / دقيقة عن طريق الضغط الإيجابي إلى داخل ماصة. انتظر 5-10 الصورة قبل إزالة معلومات سرية حقن ماصة من جراب لتجنب مرنا الهروب.
    ملاحظة: يجب حقن مرنا في (مصفر) القطب النباتية لتجنب الحقن في النواة، والذي يقع في نصف الكرة الحيوان.
  10. نقل بصيلات حقن إلى طبق بيتري جديد (35 ملم) مليئة 2 مل من MBS. وضع الطبق في برودة النبيذ وضعت في 18 درجة مئوية. احتضان بصيلات حقن 1 -7 أيام قبل التسجيل، اعتمادا على هوية البروتين المعبر عنه حديثا.

3. تجريد من المسام (الشكل 3)

ملاحظة: كما هو مذكور أعلاه، البويضة بواسطة طبقة المحي، خلايا بصيلات، والنسيج الضام، والتي تحتوي على الأوعية الدموية 24 تغطيتها، كما هو معروف "جراب". كل الطبقات باستثناء الطبقة المحي، الذي يوفر الاستقرار الميكانيكي دون منع وصول الحلول إلى سطح الخلية، ويجب إزالتها قبل التجارب الكهربية. وقد سبق أن وصفه المسام دون طبقات الخلايا المحيطة "المعري" البويضة 25. وعادة ما يتم تنفيذ هذه الخطوة على نفس يوم التجارب الكهربية.

  1. نقل عشرة حقن بصيلات إلى أنبوب البورسليكات الزجاج التي تحتوي على 0.5 مل من MBS، 1 ملغ / مل كولاجيناز، و 0.1 ملغ / مل مثبط التربسين. تزج الأنبوب في حمام مائي الحفاظ على 36 درجة مئوية. احتضانجراب لمدة 20 دقيقة ويهز الأنابيب في بعض الأحيان.
  2. شطف بصيلات بنقلهم إلى أنبوب الثاني يحتوي على 1 مل من MBS في RT. تركها في الأنبوب لمدة حوالي 10 ثانية.
  3. نقل بصيلات إلى أنبوب ثالث يحتوي على 0.5 مل من MBS المركزة مضاعفة تحتوي على 4 ملي الإثيلين غليكول مكرر (2-aminoethylether) - N، N، N '، N'- حمض tetraacetic (EGTA)، واحتضان لهم لمدة 4 دقائق في RT. هز أنبوب في بعض الأحيان.
    ملاحظة: حل مفرط التوتر (MBS تتركز بشكل مضاعف) يستخدم للحث على انكماش البويضات داخل طبقات الخلايا المسام، وبالتالي فصل طبقات الخلايا الجرابية من البويضة. وأضاف EGTA لكبح النشاط كولاجيناز.
  4. شطف بصيلات بنقلهم إلى أنبوب الثاني يحتوي على 1 مل من MBS في RT. تركها في الأنبوب لمدة حوالي 10 ثانية.
  5. نقل البويضات إلى طبق بتري (35 مم) التي تحتوي على 2 مل من MBS. تحت مجهر تشريحي، فصل المظاريف الخارجية من بصيلات بواسطةببساطة دفع البويضة المجردة بعيدا باستخدام حلقة البلاتين.
    ملاحظة: المغلفات الخارجية للالبويضات عصا بحزم إلى الطبق والثقافة، ويمكن فصلها بسهولة من البويضات. وبعض البويضات تفقد عفويا المظاريف الخاصة الخارجية وسيتم استردادها كما البويضات الجرداء. وقد أدى هذا الإجراء في إعداد مستقر نسبيا التي تحافظ على مظهر كروية من البويضات.

4. حل سريع التغيير في جميع أنحاء سيت

  1. إجراء المشبك التجربة الجهد، كما هو موضح 9،26.
  2. تغيير في حل نظام الارواء التي تغذيها الجاذبية من خلال تحويل مفاتيح نضح على النحو المطلوب من قبل التجربة.
    1. تطبيق حل نضح في 6 مل / دقيقة من خلال الزجاج الشعرية مع قطرها الداخلي 1.35 مم، والفم والتي يتم وضعها عن 0.4 مم من سطح البويضة، للسماح التغيرات السريعة في تركيز ناهض حول البويضة.
      وكان معدل التغير في السابق تقدير ملاحظة:د الى 70٪ في أقل من 0.5 ق 27.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد خص البويضات القيطم ميكانيكيا خارج باستخدام حلقة البلاتين (الشكل 1). تم microinjected البويضات مع مرنا الترميز لGABA ومفارز مستقبلات ألفا 4 بيتا 2، δ، 0.5: 0.5: 2.5 fmol / البويضة (الشكل 2). بعد 4 د، وإزالة طبقات الخلايا الجرابية (الشكل 3). والبويضات الجهد فرضت في -80 بالسيارات ومعرضة للزيادة تركيزات حمض الغاما γ (GABA) في وجود من 1 ميكرومتر 3α، 21 dihyd...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطرق الموضحة في هذه المقالة تحيد عن تلك المستخدمة تقليديا 7-9. ذلك هو المعيار لفضح فصوص من المبيض إلى 1-2 ح العلاج كولاجيناز 8؛ عزل التالفة، البويضات الجرداء. وضخها مع مرنا باستخدام أجهزة حقن التجارية. هذا الإجراء الكلاسيكي لديه عيوب التالية: 1) من المرجح أن تتضرر بسبب التعرض الطويل لتركيزات عالية من كولاجيناز البويضات. يجب 2) أن يتم تخزين البويضات الجرداء غير مستقرة حتى التجربة. 3) هي أكثر عرضة للمعاناة من خلال حقن مكروي من بصيلات البويضات الجرداء. أجهزة حق...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم 315230_156929/1. MCM حاصلة على زمالة (Beca Chile Postdoctorado من CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
كلوريد الصوديومسيجما71380
KClسيجماP-9541
NaHCO3SigmaS6014
MgSO4 سيجماM-1880
CaCl2 سيجما223560
Ca (NO3< / sub>) 2 سيجماC1396
هيبسسيجماH3375
البنيسيلين / الستربتومايسينجيبكو15140-148100 & جم البنسلين / مل و 100 مو ؛ ز الستربتومايسين / مل
حلقة الأسلاك البلاتينيةمحلية الصنع
مجتذب الماصةالدقيقة Zeitz-Instruments GmBHDMZ
حقنة هاميلتون   ؛هاميلتون8030010 & L ، النوع 701N
أنابيب بولي تترافلورو إيثيلين سميكة الجدرانLabmarket GmBH1.0 مم OD & nbsp ؛
زيت البارافينسيجما18512
نايلون صافي ، G: 0.8 مم  ZBF Zü أغنى Beuteltuchfabrik AG
أنبوب زجاجي البورسليكات  Corning99445-12PYREX
Collagenase NB Standard GradeSERVA17454
مثبط التربسين من النوع I-SSigmaT-9003
EGTASigmaE3389
زجاج شعريJencons (علمي) LTD.H15 / 101.35 معرف مم (للتروية) ، شركة بديلة: Harvard Apparatus Limited
البورسليكات الزجاجية الشعريةHarvard Apparatus Limited30-00191.0 OD x & nbsp ؛ 0.58 معرف × 100 طول مم (للحقن المجهري)   ؛
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات هارفارد للأجهزة المحدودة30-00441.2 OD × 0.69 معرف × 100 طول مم (لمشبك الجهد ثنائي القطبين)
& جاما ؛ حمض أمينوبوتيريك (GABA)سيجماA2129
3 &alpha ؛ 21-Dihydroxy-5 & alpha ؛ -pregnan-20-one (THDOC)SigmaP2016
محرك شواءFaulhaber  ؛محرك صغير DC نوع 2230 مع برغي ميكرومتر من نوع التروس
Kiener-Wittlin10400TESA ، AR 02.11201
ماصات نقل بلاستيكية معقمةSaint-Amand  Mfg.222-20 ثانية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).
  2. Soreq, H. The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes. CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).
  3. Sigel, E. Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins. J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).
  4. Dascal, N. The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).
  5. Sigel, E. Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid. J Physiol. 386, 73-90 (1987).
  6. Sigel, E., Minier, F. The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins. Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).
  7. Colman, A. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. Transcription and Translation'A Practical Approach. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. Oxford. 49-69 (1984).
  8. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Defolliculation of Xenopus oocytes. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).
  9. Smart, T. G., Krishek, B. J. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker,, Wolfgang, W. alz , Humana Press. New Jersey. 259-305 (1995).
  10. Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital. Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).
  11. Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity. Sci Rep. 6, 25943(2016).
  12. Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).
  13. Burgunder, J. M., et al. Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese. Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).
  14. Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes. FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).
  15. Gonzalez-Salgado, A., et al. myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).
  16. Gonzalez-Salgado, A., et al. Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth. Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).
  17. Wu, M., Gerhart, J. Raising Xenopus in the laboratory. Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).
  18. Gurdon, J. B. American clawed frogs. Methods in developmental biology. Wilt, F. H., Wessels, N. K. , Thomas Y. Crowell Co. New York. 75-84 (1967).
  19. Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation. Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).
  20. Green, S. L. Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis). Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).
  21. Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).
  22. Kressmann, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. , Plenum Press. 388-407 (1980).
  23. Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site. Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).
  24. Dumont, J. N., Brummett, A. R. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues. J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).
  25. Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate. J Physiol. 352, 551-574 (1984).
  26. Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides. Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).
  27. Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron. 5, 703-711 (1990).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Xenopus OocytesMicroinjection TechniqueFollicular Cell RemovalElectrophysiological ExperimentsGABA A ReceptorscRNA InjectionCollagenase TreatmentSolution Change MethodOocyte IsolationVoltage Clamp Recording

Related Articles