يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ديكستران يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية

11.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55063

⸱

يناير 15, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Immunology and Immunotherapy, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 2Vector Core Lab, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 3Laboratory of Lymphocyte Biology, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 4Laboratory of Stem Cell Transcriptional Regulation, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 5Department of Microbiology and Immunology, The Medical College of Wisconsin, 6Department of Pediatrics, The Medical College of Wisconsin, 7Department of Medicine, The Medical College of Wisconsin

في هذه المقالة

ملخص

وكان الهدف من هذه الدراسة وضع التكنولوجيات التي تسمح لتوصيل الجينات الناجحة في خلايا أولية الطبيعية (ناغورني كاراباخ) القاتل. ديكستران بوساطة توصيل لينتيفيرال للإنسان أو الماوس ناغورني كاراباخ الخلايا النتائج الأولية في أعلى كفاءات التعبير الجيني. هذا الأسلوب لتوصيل الجينات سيحسن ناغورني كاراباخ خلية التحوير الوراثي.

الملخص

تم توصيل فعالة من جينات محددة داخل الخلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعية تحديا كبيرا. ترانسدوكشنز ناجحة ذات الأهمية الحاسمة لتحديد دور الجينات للمصلحة في التنمية، والتمايز، ووظيفة خلايا ناغورني-كاراباخ. التطورات الأخيرة المتعلقة بمستقبلات مستضد تشيميريك (السيارات) في العلاج المناعي السرطان إبراز الحاجة إلى طريقة فعالة لتوصيل الجينات الخارجية إلى الخلايا الليمفاوية المستجيب. كفاءات ترانسدوكشنز لينتيفيرال بوساطة الجينات في الإنسان الأولية أو الماوس ناغورني كاراباخ الخلايا تبقى منخفضة إلى حد كبير، وهو عاملاً معوقا. إظهار التقدم الذي أحرز مؤخرا باستخدام البوليمرات الموجبة، مثل بوليبريني، كفاءة توصيل جينات محسنة في خلايا تي. ومع ذلك، فشل هذه المنتجات تحسين كفاءة توصيل الخلايا ناغورني-كاراباخ. هذا العمل يبين أن ديكستران، السكاريد غلوكان تشعبت، تحسن كبير في كفاءة توصيل للإنسان والماوس الأساسي ناغورني كاراباخ الخلايا. منهجية توصيل استنساخه بشدة هذا يوفر أداة مختصة للبشرية خلايا ناغورني كاراباخ الأولية، التي يمكن أن تحسن إلى حد كبير تطبيقات توصيل الجينات السريرية ومن ثم ناغورني كاراباخ المستندة إلى خلايا السرطان المناعي. ترانسدوسينج

المقدمة

خلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعية هي السكان اللمفاوية الرئيسية ل نظام المناعة الفطرية1. ناغورني كاراباخ الخلايا تعمل كمدافعين عن السطر الأول من الاستجابة المناعية المضيف ضد الأورام والالتهابات2،،من34. ناغورني كاراباخ الخلايا أيضا دور مركزي في التنمية للتسامح من خلال إفراز السيتوكينات قوية والمستقطبات5. نظراً لقدرتها القوية على الهدف والقضاء على الخلايا السرطانية، تجري تجارب سريرية متعددة لتقييم المستمدة من المانحين ناغورني كاراباخ الخلايا البشرية أدوبتيفي المناعي للسرطان6،7. خلافا لخلايا T، علم الأحياء التنموي للخلايا ناغورني كاراباخ لم يكون جيدا تتسم8. وهذا الافتقار إلى المعرفة جزئيا بسبب عدم وجود تقنيات كفاءة إيصال جينات فائدة للماوس أو الخلايا البشرية الأولية في ناغورني كاراباخ. ولهذه الأسباب، قد أجريت معظم ناغورني كاراباخ-خلية دراسات في خطوط الخلايا بدلاً من الخلايا الأولية. ولذلك، الحاجة إلى بروتوكول موثوقة وفعالة ترانسدوسي الابتدائي ناغورني كاراباخ الخلايا التي تحتوي على الجينات التي تهم أمر حاسم.

وكان الهدف العام لهذه الدراسة صياغة طريقة متسقة وموثوق بها الذي يمكن ترانسدوسيد الخلايا ناغورني كاراباخ البشرية أو مورين الأولية بلينتى-أو الجزيئي.

أجريت الدراسات السابقة التي حاولت معالجة هذه المشكلة، إلى حد كبير استخدام التحويل عابرة من خلايا أولية في ناغورني كاراباخ. وهذا يشمل بلازميد تعداء9،10، فيروس ابشتاين-بار (EBV)/ناقل للفيروس الهجين11، متجهات اللقاحية12،13، و Ad5/F35 موجهات أدينوفيرال تشيميريك14. وعلى الرغم من كفاءة هذه التقنيات المتواضعة، يجعلها طبيعة عابرة لتوصيل غير صالحة للاستخدام طويل الأجل ناغورني كاراباخ الخلايا المحورة وراثيا. عدد قليل من الدراسات الأخيرة استخدمت نواقل فيروسات النسخ العكسي إلى ترانسدوسي الخلايا ناغورني كاراباخ، التي تتطلب دورات متعددة من العدوى تحقيق مستوى مقبول من الجينات التعبير11،15. على عكس نواقل فيروسات النسخ العكسي، يمكن استخدام ناقلات لينتيفيرال خلايا المضيف النووية استيراد الآلات إلى ترانسلوكاتي الفيروسية المجمع قبل الاندماج في النواة. وهذا عاملاً معوقا في النسخ المتماثل الفيروس في عدم تقسيم الخلايا التي تتضمن خلايا أولية في ناغورني كاراباخ.

التفاعلات بين مختلف مستقبلات سطح الخلية والجزيئات الفيروسية تسمح بامتصاص الفيروسي داخل الخلية. التعاقدات الأولية بين البروتينات الفيروسية المغلف وعلى مستقبلات المضيف المشابهة قد تكون محدودة بسبب الاتهامات السلبية المحتملة القائمة بين هذين. والأساس المنطقي وراء العديد من تقنيات توصيل هو أن إضافة البوليمرات الموجبة، مثل بوليبريني (Pb) أو كبريتات البروتامين (PS) ديكستران، يمكن إعطاء شحنة موجبة لمستقبلات سطح الخلية وزيادة ربط المغلف الفيروسي وبالتالي البروتينات. هذا سيزيد كفاءة الانصهار وامتصاص الجزيئات الفيروسية ب الخلايا16. على الرغم من أن أفيد بأن الجريدة الرسمية أو PS يمكن تحسين نقل الجينات في خلايا T17، تطبيقها لم يكن أي تأثير في كفاءة توصيل خلايا أولية في ناغورني كاراباخ. وعلاوة على ذلك، لم يتم إجراء تحليل مقارن بين هذه الكاشفات باستخدام خلايا أولية في ناغورني كاراباخ. في هذه الدراسة، تم مقارنة كفاءة توصيل للبوليمرات الموجبة ثلاثة. وتبين النتائج أن ديكستران فقط بين هذه البوليمرات الموجبة ثلاثة، يعزز إلى حد كبير كفاءة توصيل الفيروسية في الماوس والخلايا البشرية الأولية في ناغورني كاراباخ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع البروتوكولات الحيوان اتباعها معاملة إنسانية وأخلاقية للحيوانات، ووافق على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) داخل مركز البحوث الطبية الحيوية (BRC) كلية ويسكونسن الطبية (صحة الأم والطفل)، ميلووكي، ويسكونسن. وأقر استخدام الدم المحيطي البشري الخلايا وحيدات النوى (ببمكس) بالمؤسسية استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين) معهد بحوث الدم من "مركز الدم من ولاية ويسكونسن"، ميلووكي، ويسكونسن.

1-الفئران، وخطوط الخلية، وناقلات

  1. الحصول على فئران C57BL/6 من الموردين التجاريين. الحفاظ على المستعمرات الماوس في ظروف خالية من مسببات الأمراض واستخدام الفئران الذكور والإناث تتراوح أعمارهم ما بين 6 و 12 أسبوعا. الحصول على إزالة الألغام التي تم تحديدها ببمكس البشرية من المصادر التي وافق عليها مجلس الهجرة واللاجئين.
  2. تخدير الحيوانات مع خليط من 20-30% v/v isoflurane في البروبيلين غليكول (1، 2-بروبانيديول، جامعة جنوب المحيط الهادئ الصف) تخدير الفئران. تطبيق مرهم البيطرية للعين لمنع جفاف بينما الفئران تحت التخدير.
  3. ل euthanize الحيوانات، نفذ التفكك عنق الرحم بعد إدخال التخدير.
    1. كبح جماح الفئران التي تتشبث بشدة قاعدة الذيل مع يد واحدة. ضع قلم قوي من نوع عصا أو الإبهام والإصبع الأول من ناحية أخرى ضد الجزء الخلفي الرقبة، عند قاعدة الجمجمة.
    2. لإنتاج التفكك، دفع الزجرية ناحية رأس الحيوان إلى الأمام، ودفع إلى الأسفل حين سحب إلى الخلف باليد عقد الذيل قاعدة. التحقق من فعالية التفكك بالشعور لفصال أنسجة عنق الرحم.
  4. الحفاظ الحيوانات في القفص/الدائرة لمدة 5 دقائق على الأقل وإزالتها فقط عند غياب نشاط الجهاز التنفسي أو عندما يكون هناك نقص في ضربات القلب يمكن اكتشافها.
  5. الحصول على خلايا K562 والأعمال-1 من البائعين التجاريين والمحافظة عليها في RPMI1640 الحرارة المتوسطة التي تحتوي على 10%-إبطال FBS. اختبار هذه خطوط الخلايا بشكل دوري لاستبعاد إمكانية تلوث مفطورة.

2-إعداد ومعايرة ناقلات لينتيفيرال

  1. الثقافة 5 × 106 293T الخلايا بين عشية وضحاها في قارورة2 سم T75 تتضمن حلاً 20 مل من المتوسطة RPMI1640 مع 10% FBS، 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، بيروفات صوديوم 1 مم، 5% من محلول بيكربونات الصوديوم 7.5%، و 0.001 في المائة Β-ميركابتوثانول. وضع في قارورة في حاضنة 37 درجة مئوية يملؤه 5.2% CO2.
  2. حصاد الخلايا 293T باستخدام التربسين (0.025%)/EDTA (1 مم) في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS). إضافة 5 مل التربسين/يدتا في برنامج تلفزيوني واحتضان قوارير لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية حاضنة للسماح لمفرزة الخلايا 293T من قوارير2 سم T75.
    1. جمع الخلايا المنفصلة وغسلها مرتين في برنامج تلفزيوني لإزالة أي آثار التربسين ويدتا. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير وضبط عدد الخلايا إلى خلايا 1 مليون كل مل.
  3. ترانسفيكت الخلايا 293T18 مع 3.95 ميكروغرام من psPAX2 و 1.32 ميكروغرام من pMD2G و 5.26 ميكروغرام من الوالدية-التجارة والنقل-بورو (تولدها داخليا في BRI استنساخ المروج EF1alpha من بوبي بدلاً من مروج CMV في بلينتي CMV-التجارة والنقل-بورو)19.
    1. إعداد 1 مل من 150 مم كلوريد الصوديوم بالإضافة إلى 63 ميليلتر من 0.6 مغ/مل بولييثيلينيميني (بي؛ 25,000 دينار كويتي، الخطي). يخلط جيدا ثم إضافة البلازميدات ومزيج. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وقم بإضافتها إلى الخلايا.
    2. تعداء بعد ح 16، واستبدال المتوسطة تعداء مع متوسطة جديدة بالإضافة إلى 4.5 ملم الصوديوم بوتيرات. المادة طافية تحتوي على فيروس ح 48 تعداء ما بعد الحصاد، والتركيز بالطرد المركزي بين عشية وضحاها في 5,000 × ز. انظر الجدول المواد.
  4. تحديد التتر الفيروسية باستخدام خلايا 293T عن طريق إجراء تخفيف المسلسل والاعتداء بالتدفق الخلوي ح 72 توصيل بعد20. استخدام التعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) كمقياس لقياس التتر الفيروسية.

3-تنقية والتوسع في مورين الخلايا الأولية في ناغورني كاراباخ

  1. تنقية مورين الابتدائي ناغورني كاراباخ الخلايا21. بإيجاز، تمرير تعليق خلية واحدة الطحال من خلال أعمدة الصوف النايلون إلى استنزاف السكان ملتصقة تتكون من خلايا ب والضامة.
  2. ثقافة السكان غير ملتصقة التيد من النايلون الصوف العمود الذي يحتوي على خلايا ناغورني كاراباخ مورين مع 1,000 يو/مليلتر انترلوكين (إيل)-2 في المتوسط RPMI1640 مع 10% FBS، 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، بيروفات صوديوم 1 مم، 5% من 7.5% بيكربونات الصوديوم الحل، و 0.001 في المائة β-mercaptoethanol (RPMI1640 المتوسطة كاملة).
  3. تغيير المتوسطة من قوارير في يوم 4 من هذه الثقافة لإزالة غير ملتصقة T وخلايا NKT؛ الخلايا التي تظل يلتزم قوارير هي إلى حد كبير ناغورني كاراباخ الخلايا. إضافة 20 مل من 1,000 يو/مليلتر إيل-2 لسد النقص في قوارير والطازجة المتوسطة كاملة RPMI1640.
  4. فحص نقاء الثقافات الخلية ناغورني كاراباخ موريني في يوم 7 من التدفق الخلوي مع ناغورني كاراباخ علامات خاصة بالخلية20 استخدام الإعداد مع أكثر من 95 في المائة CD3–NK1.1+ السكان.

4-تنقية وتوسيع نطاق من الخلايا البشرية الأولية في ناغورني كاراباخ

  1. عزل ببمكس بكثافة متدرجة من المعاطف بافي المتطوعين بشرية صحية. باختصار، بعناية الطبقة 35 مل خلايا التي تضعف النصف (مع حبس) ما يزيد على 15 مل من الكثافة المتدرجة في أنبوب 50 مل المتعارف عليه. الطرد المركزي في ز × 400 لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية في دوار دلو يتأرجح دون الفرامل.
  2. استخدام مجموعات تجارية الانتقاء السلبي القائم على جسم لتنقية الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي البشرية وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  3. بعد العزلة، تحديد نقاء الاستعدادات خلية ناغورني كاراباخ بتحليلات الفلورة. وصمة عار ناغورني كاراباخ خلية التحضيرات مع 2 ميكروغرام/مل المضادة-CD3 و 2 الأجسام المضادة-CD56 ميكروغرام/مل عند 4 درجة مئوية 20 دقيقة أغسل الخلايا مرتين مع السكان خلية برنامج تلفزيوني ناغورني كاراباخ تحددها غياب CD3 ووجود CD56 على سطح الخلية.
  4. احتضان الأعمال التحضيرية الخلية مع الأجسام المضادة لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية وتغسل ببرنامج تلفزيوني وتحليلها في سيتوميتير تدفق. استخدام التحضيرات خلية ناغورني كاراباخ فحوصات النقاء لتوصيل الجينات مع أكثر من 85%20.

5-توصيل مورين والبشرية الأولية ناغورني كاراباخ الخلايا التي تحتوي على لينتيفيروس

  1. تعليق الماوس أو البشرية خلايا أولية ناغورني كاراباخ في صفيحة 24-جيدا في 0.5 × 105/mL المتوسطة حضور lentivirus بروتينات فلورية خضراء طافية في تعدد 5، 10 و 20 من العدوى (وزارة الداخلية) وحضور Pb (8 ميكروغرام/مل)، PS (8 ميكروغرام/مل) أو ديكستران (8 ميكروغرام/مل).
  2. الطرد المركزي اللوحات في ز × 1,000 لمدة 60 دقيقة.
  3. دون الصب المادة طافية، ثقافة الخلايا بين عشية وضحاها (ح 16-18) في حاضنة 37 درجة مئوية يملؤه 5.2 في المائة شركة2-
  4. يغسل مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وريسوسبيند في 2 مل من RPMI1640 كاملة الثقافة المتوسطة حضور إيل-2 (300 U/mL).
  5. اختبار الإنسان والفأر سيتوتوكسيسيتي الخلية بوساطة ناغورني كاراباخ الأولية ضد K562 والأعمال-1، على التوالي قبل تنفيذ 51الكروم (Cr)-فحوصات الإفراج في تفاوت نسب المستجيب للخلية الهدف22.
    1. بإيجاز، تعطي الخلايا الهدف 1 مليون و µCi 50 من كرومات الصوديوم راديولابيليد 51Cr. خلال فترة الحضانة 4-h، الإقبال 51Cr في البروتينات الخلوية. في نهاية الحضانة، غسل الخلايا لإزالة أي تسمية غير مسجلة.
    2. حساب تحلل الخلية ورم محدد بمقدار إطلاق 51Cr المطلق والعفوية والتجريبية من الخلايا المستهدفة.
      ملاحظة: تم حساب النسبة المئوية لتحلل محددة من تجارب بينتابليكاتي باستخدام المعادلة التالية: تحلل محددة % = ((51Cr يعني إصدار تجريبي- 51Cr يعني الإفراج عفوية)/(51Cr يعني الإصدار القصوى- 51Cr يعني الإفراج عفوية)) х 100، حيث "51Cr الإفراج عفوية يعني" هو 51Cr أطلق سراحهم من الخلايا المستهدفة في غياب الخلايا ناغورني-كاراباخ و "51Cr الإفراج القصوى يعني" 51Cr صادر من الخلايا المستهدفة عند تحلل N 2 حمض الهيدروكلوريك (HCl).
  6. حصاد الخلايا ناغورني كاراباخ ترانسدوسيد في يوم 7 بالتنصت بلطف قوارير.
    1. تنشيط الخلايا المقطوع مع معاير تركيزات ماب ربط لوحة مكافحة--NKG2D (A10) بطلاء ألواح البوليسترين 96-جيدا، وعالية البروتين-ماصة مع تركيزات 2.5 ميكروغرام/مل ماب NKG2D المضادة بين عشية وضحاها.
    2. تغسل كل جيدا مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ثلاث مرات قبل إضافة خلايا أولية في ناغورني كاراباخ.
  7. جمع supernatants ثقافة استخدام ماصة متعدد القنوات من بين 16 و 18 ح التنشيط بعد لقياس السيتوكينات مثل IFN-γ. إنشاء المنحنيات القياسية باستخدام السيتوكينات المؤتلف المقدمة مع مجموعات مرتبطة بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA).
  8. اختبار صلاحية خلية ناغورني كاراباخ باستخدام أنيكسين-ت/7-الأمينية-والاكيتنوميسين د (7-عاد) المصبوغة23 وتحديد نسبة نخرية الخلايا بين الخلايا ناغورني كاراباخ تحول باستخدام سيتوميتير تدفق.
    1. لإجراء هذا الفحص، الحصاد ناغورني كاراباخ مورين والبشرية خلايا أربعة أيام بعد توصيل، يغسل مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة في ز × 500 لمدة 5 دقائق، واحتضان مع أنيكسين-V (PE)/7-عاد كيت.
  9. استخدام البرمجيات المناسبة التدفق الخلوي لتحليل البيانات. حدد الخلية ويعيش السكان وتحليل التعبير عن التجارة والنقل (قناة فيتك) كمقياس لتوصيل الفيروسية24.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ديكستران يدفع نقل الجينات كفاءة ناقل لينتيفيرال في الخلايا الأولية من ناغورني كاراباخ البشرية ومورين

ناغورني كاراباخ الخلايا البشرية كانت معزولة وتنقيته من ببمك (بدرجة نقاء أكثر من 85 ٪) والمحتضنة بين عشية وضحاها مع rIL-2 300 يو/مليلتر. ثم تم ترانسدوسيد هذه الخلايا الأولية في ناغورني كاراباخ مع لينتيفيروس التجارة والنقل على التعدديات متنوعة من العدوى (موي؛ 3 و 10 و 20 وحدة دولية كل خلية) في لوحات 24-كذلك حضور 8 ميكروغرام/مل Pb أو P...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وتوضح هذه الدراسة أن استخدام ديكستران كعامل بوليمر الموجبة يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية على السواء. بالإضافة إلى ذلك، قد العوامل الموجبة الأخرى، مثل الجريدة الرسمية أو PS، أي تأثير ملحوظ على إيصال النواقل الفيروسية في الخلايا البشرية الأولية في ناغورني كاراباخ. سابقا، وقد ثبت أن الجريدة الرسمية يمكن زيادة توصيل الجينات في خلايا تي البشرية17. بيد أن هذه النتائج تشير إلى أن الجريدة الرسمية لا PS لها كفاءة مماثلة على الخلايا البشرية الأولية في ناغورني ك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويدعي مقدما البلاغ لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

ونحن نشكر ساماركو لوسيا ولولو لها عصير الليمون الوقوف للإلهام والحافز والدعم. هذا العمل كان تدعمها جزئيا AI102893 R01 المعاهد الوطنية للصحة ولجنة التحقيق الوطنية R01 CA179363 (س. م.)؛ نهلبي-HL087951 (ر. س)؛ المعاهد الوطنية للصحة-CA151893-K08 (M.J.R.)؛ NCI 1R01CA164225 (L.W)؛ مؤسسة الوقوف عصير الليمون أليكس (س. م.)؛ البرنامج هرهم الصندوق MACC (س. م.؛ س. ر.؛ M.S.T)؛ مؤسسة عائلة نيكولاس (س. م.)؛ الأسرة جارديتو (س. م.)؛ برنامج علماء هيونداي (M.S.T.)؛ أمل هيونداي موتورز (س)؛ الصندوق MACC (M.S.T.) و (س. م.؛ معهد البحوث للأطفال، صحة الأم والطفل (س)؛ وجائزة Fogerty دوفي كاثي (M.J.R.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ديكسترانسيجما ألدريتش90-64-91-9
بوليبرين (Pb)سيجما ألدريتشTR-1003
كبريتات البروتامين (PS)سيجما ألدريتشp3369
تريبسينكورنينج25-052-CI
RPMI1640كورنينج10-040-CV
مصل الأبقار الجنينيATALANTAS11150
البنسلينكورنينج30-001-CI
B-mercaptoethanolSIGMAM3148
بيروفات الصوديومكورنينجMT25000CI
إنترفيرون جاما (IFN-& gamma; )eBioscience14-7311-85
محلول تلطيخ البروبيديومBD51-66211E
ليبوفاكتامين 3000ثيرمو فيشرL3000015
إيزوفلورانفينيكسNDC 57319-559-05
مجموعة الاختيار السلبية للخلايا NKالخلايا الجذعية19855
Yac-1ATCCTIB-160
K562ATCCCCL-243
الفئرانجاكسون664
خلايا 293TATCCCRL-3216
T75 قواريرCornnig430641U
الاختيار السلبية القائمة على الأجسام المضادةالخلايا الجذعية19055
51< / sup> فحوصات إطلاق الكروم (Cr)بيركين إلمرNEZ030
مجموعات ELISAEbioscience00-4201-56
زبدات الصوديومSigma5887-5G
علوم بولي إيثيلين لينيمينيالخطية23966-2
FicollGE علوم الحياة17-1440-03
HBSSCorning21-022-CV
مجموعات

المراجع

  1. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
  2. Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
  3. Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
  4. Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
  5. Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
  6. Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95(2014).
  7. Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94(2016).
  8. Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
  9. Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
  10. Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
  11. Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
  12. Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
  13. Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
  14. Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
  15. Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
  16. Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
  17. Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
  18. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529(2009).
  19. Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
  20. Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
  21. Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
  22. Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
  23. Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
  24. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
  25. Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
  26. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
  27. Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
  28. Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ديكستران يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.