Method Article

بروتين طريقة التحضير لتحديد إنتاجية عالية من البروتينات التفاعل مع العامل المساعد النووية عن طريق LC-MS / MS تحليل

DOI:

10.3791/55077

⸱

January 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 2Department of Biotechnology and Genetic Engineering, Jahangirnagar University, 3Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University, 4Institute of Genetics and Animal Breeding of the Polish Academy of Sciences, 5Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد وضعنا طريقة لتنقية البروتينات التفاعل coregulatory باستخدام نظام LC-MS / MS.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر منظمات النسخ الشريكة حيوية لتنظيم النسخ الفعال لبنية الكروماتين النووي. يلعب المنظمون المشاركون مجموعة متنوعة من الأدوار في تنظيم النسخ. وتشمل هذه التفاعل المباشر مع عوامل النسخ ، والتعديل التساهمي للهيستونات والبروتينات الأخرى ، وتغيير تشكل الكروماتين العرضي. وفقا لذلك ، فإن إنشاء طرق سريعة نسبيا لتحديد البروتينات التي تتفاعل داخل هذه الشبكة أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا للآليات التنظيمية الأساسية. تحديد شريك ربط البروتين بوساطة LC-MS / MS هو تقنية تم التحقق من صحتها تستخدم لتحليل تفاعلات البروتين والبروتين. من خلال ترسيب عضو تم تحديده مسبقا في مركب بروتيني بجسم مضاد (أحيانا بجسم مضاد لبروتين مميز) ، من الممكن تحديد تفاعلات البروتين غير المعروفة عن طريق تحليل قياس الطيف الكتلي. هنا ، نقدم طريقة لتحضير البروتين لتحديد الإنتاجية العالية بوساطة LC-MS / MS لتفاعلات البروتين التي تنطوي على العوامل المساعدة النووية وشركائها الملزمين. تسمح هذه الطريقة بفهم أفضل للآليات التنظيمية النسخية للعوامل النووية المستهدفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفاعلات البروتين البروتين تلعب دورا هاما في العديد من الوظائف البيولوجية. على هذا النحو، قد تورطت هذه التفاعلات في نقل الإشارة. نقل البروتين عبر أغشية الخلايا. استقلاب الخلية. والعديد من العمليات النووية، بما في ذلك تكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي من التلف والتوحد، والنسخ 1، 2، 3، 4. تحديد البروتينات المشاركة في هذه التفاعلات لذا فمن الأهمية بمكان تعزيز فهمنا لهذه العمليات الخلوية.

مناعي (IP) هو أسلوب التحقق من صحة استخدامها لتحليل التفاعلات البروتين البروتين. من أجل تسهيل التعرف على البروتينات immunoprecipitated المشترك، وغالبا ما يستخدم قياس الطيف الكتلي 5، 6، 7، 8،9. من خلال استهداف عضوا معروفا في مجمع البروتين مع الأجسام المضادة، فمن الممكن لعزل بروتين معقد وتحديد وقت لاحق مكوناته غير معروفة عن طريق تحليل الطيف الكتلي. ARIP4 (الاندروجين-التفاعل مستقبلات البروتين 4)، وcoregulator النسخي، يتفاعل مع البروتينات المستقبلة النووية من أجل تنشيط أو قمع المروجين هدفه بطريقة تعتمد على السياق 9 و 10. من أجل فهم أفضل الآليات التنظيمية النسخي التي تحكم هذه العوامل النووية، وصفنا أسلوبا شاملا لتنقية وتحديد ARIP4 البروتينات التفاعل باستخدام نظام LC-MS / MS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ترنسفكأيشن

  1. البذور خلايا HEK293 في لوحات ثقافة 100 ملم (2 × 10 6 خلية / طبق). ثقافة الخلايا في المتوسط ​​Dulbecco لتعديل النسر تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 100 وحدة / مل البنسلين. احتضان الخلايا في حاضنة ترطيب عند 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية.
  2. في اليوم التالي، transfect الخلايا مع 10 ميكروغرام من الموسومة FLAG ARIP4 البلازميد باستخدام 40 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن وفقا لتوجيهات المصنع 11.

2. البروتين استخراج

  1. ما يقرب من 36 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وغسل الخلايا مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني وحصاد الخلايا باستخدام مكشطة. نقل الخلايا إلى mltube 1.5 وأجهزة الطرد المركزي أنه في 8000 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. نضح في وطاف و resuspend بيليه خلية في 5X حجم بيليه من 0.4 عازلة M بوكل (عالية عازلة الملح: 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0) و 0.4 M بوكلو 5 ملي MgCl 2، 10٪ الجلسرين، 0.1٪ NP-40، و 10 ملي ب-mercaptethanol، 1X مثبط البروتياز كوكتيل). تدوير الخليط لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  2. أنبوب الطرد المركزي في 17700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  3. نقل طاف (استخراج خلية كاملة) لأنبوب جديد 2 مل وإضافة 3X حجم الأولي من 0 عازلة M بوكل (التخفيف المخزن المؤقت: 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 5 ملي MgCl 2، 10٪ الجلسرين، 0.1٪ NP-40، و 10 ملي β-المركابتويثانول، 1X مثبط البروتياز كوكتيل).
  4. أداء الطرد المركزي أخرى (17700 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية)، ونقل طاف (كله استخراج الخلايا) إلى أنبوب 2 مل الجديد.

3. مناعي

  1. أثناء الطرد المركزي (2.4)، وغسل 50 ميكرولتر من الخرز مكافحة FLAG مع برنامج تلفزيوني، 0.1 M الجلايسين-هيدروكلوريد، ثم 1 M تريس، هيدروكلوريد، تليها غسل مرتين مع 0.1M العازلة بوكل (منخفض عازلة الملح: 20 ملي Tris- حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 0.1 م بوكل، 5 ملي MgCl2، 10٪ الجلسرين، 0.1٪ NP-40، 10 مM ب المركابتويثانول، 1X مثبط البروتياز كوكتيل). يتم تنفيذ الطرد المركزي لعملية غسل هذا في 2000 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  2. مزيج 50 ميكرولتر من الخرز FLAG مع مقتطفات خلية كاملة وتناوب بلطف الخليط لمدة 4 ساعات في 2-4 درجة مئوية (وينبغي أيضا أن تبقى 1٪ من استخراج خلية كاملة من الخطوة 2.4 في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل كمدخل).
  3. نقل العينة إلى عمود الدوران الصغير (انخفاض الجاذبية). الحفاظ على التدفق من خلال في أنبوب 1.5 مل، وتجميد باستخدام النيتروجين السائل، وتخزينه في -80 درجة مئوية (فحص مستويات البروتين من كل من المدخلات والتدفق من خلال استخدام تحليل لطخة غربية).
  4. إضافة 1 مل من 0.1 العازلة M بوكل (منخفض عازلة الملح) لتغسل حبات FLAG (انخفاض الجاذبية).
  5. كرر الخطوة 3.4 على الأقل أربع مرات أكثر (أي ما مجموعه خمسة يغسل).

4. شطف

  1. وضع عمود في أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي أنه في 2000 x ج لمدة 1 دقيقة. والخرز يجف.
  2. سقف أسفل العمود.
  3. إضافة 50 ميكرولتر (مساو لحجم حبات FLAG) من 0.1 M جليكاين، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 2.5).
  4. يهز بلطف الخليط لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. وضع عمود في أنبوب 1.5 مل جديد وأجهزة الطرد المركزي أنه في 2000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  6. هو تحييد الحل مزال مع 10 ميكرولتر من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)؛ تخلط جيدا من قبل pipetting أو باستخدام آلة دوامة.

5. الألكلة وTrypsinization

  1. إضافة 50 ميكرولتر من 100 ملي NH 4 HCO 3 و 10 ميكرولتر من CH 3 CN، و 2 ميكرولتر من dithiothreitol إلى الخليط (112 ميكرولتر اجمالى حجم).
  2. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية.
  3. وضع العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  4. إضافة 10 ميكرولتر من 333 ملي iodoacetamide إلى العينة واحتضان في الظلام لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. إضافة 10 ميكرولتر من التربسين (33 نانوغرام / ميكرولتر) إلى الخليط، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

معشوقة = "jove_title"> 6. LC-MS / MS تحليل

  1. وبعد trypsinization بين عشية وضحاها، نقل المنتج النهائي إلى MS-LC مرفق / MS أو لطرف ثالث مختبر قياس الطيف الكتلي لتحليل 12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حددنا إشارة قوية ARIP4، حوالي 160 كيلو دالتون، فضلا عن تلك التي تحكم عينة وهمية وعدة بروتينات أخرى غير معروفة (الشكل 1). التحليل الذي LC-MS / MS كل من الببتيدات المعقدة ARIP4 والعوامل المساعدة الببتيد المحتملة داخل جزء من الخرز FLAG (الجدول 1). P62 (Sequestosome1)، اكتشف وجود العامل المساعد ARIP4 يعرف 11 في التحليل (الجدول 1)، مما يؤكد كفاءة هذا النظام 11.<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ترنسفكأيشن كفاءة ضروري للحصول على نتيجة ناجحة مع هذا البروتوكول. وفقا لذلك، فإننا نوصي باستخدام تحليل لطخة غربية لتحديد مستويات البروتين FLAG الموسومة immunoprecipitated. هذه الخطوة تمكن المستخدمين من التحقق من أن البروتين اهتمامهم هى overexpressed بشكل صحيح، وعلاوة على ذلك، أن الملكية الفكرية أجريت بنجاح. وينبغي أيضا فحص مستويات البروتين الموسومة FLAG مسبق لتحليل الطيف الكتلي.

وينبغي استخدام عينة همية كعنصر تحكم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة Astellas لأبحاث اضطرابات التمثيل الغذائي (HT) ، ومؤسسة تاكيدا للعلوم (HT) ، ومن قبل الجمعية اليابانية لتعزيز منح العلوم لمساعدة العلماء الشباب (B) إلى HT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ليبوفيكتامين 2000 كاشف التعافيالترموثير فيشر 11668019
كوكتيل مثبط البروتياز العلمي (خالي من EDTA) (100x)nacalai tesque03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220
Micro Bio-Spin ColumnsBIO-RAD732-6204

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).
  2. Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
  3. MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
  4. Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
  5. Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
  6. Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
  7. Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
  8. Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430(2013).
  9. ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
  10. Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
  11. Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498(2015).
  12. Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
  13. Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
  14. Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
  15. Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein PreparationNuclear CofactorLC MS MS AnalysisProtein InteractionTranscriptional RegulationImmunoprecipitationMass SpectrometryFlag Tagged ProteinsHEK 293 CellsSilver Staining

Related Articles