أصبح ورم خبيث في الدماغ حاجة غير الملباة الطبية العاجلة نظرا لازدياد حالات الإصابة في حين الخيارات العلاجية ظلت الملطفة. إنشاء النماذج الحيوانية التجريبية من ورم خبيث في الدماغ عن طريق الحقن الشرياني intracarotid الخلايا السرطانية يسهل الدراسات الميكانيكية للبيولوجيا المرض وتقييم نظم تدخل الرواية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Intracarotid حقن الخلية السرطانية لإنتاج نماذج الماوس من الدماغ الانبثاث
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ورم خبيث، وانتشار ونمو الخلايا الخبيثة في المواقع الثانوية داخل جسم المريض، وحسابات ل> 90٪ من الوفيات الناجمة عن السرطان. في الآونة الأخيرة، والتقدم للإعجاب في علاجات جديدة قد تطول بشكل كبير البقاء على قيد الحياة وتحسين نوعية الحياة بالنسبة لكثير من مرضى السرطان. للأسف، الإصابة في الدماغ تكرار المنتشر في ازدياد مضطرد، وجميع العلاجات الحالية هي مجرد الملطفة. وبالتالي، هناك حاجة ماسة النماذج الحيوانية التجريبية جيدة لتسهيل إجراء دراسات متعمقة للبيولوجيا المرض وتقييم نظم علاجية جديدة لتقييم ما قبل السريرية. ومع ذلك، والمعيار في مقايسة الانبثاث الجسم الحي عن طريق الحقن الذيل الوريد من الخلايا السرطانية تنتج في الغالب الآفات النقيلي الرئة. عادة ما تستسلم الحيوانات إلى عبء ورم الرئة قبل أي ثمرة ذات مغزى من ورم خبيث في الدماغ. حقن داخل القلب من الخلايا السرطانية تنتج الآفات النقيلي إلى مواقع الجهاز متعددة بما في ذلك الدماغ. ومع ذلك، فإن variabiعنه lity من نمو الورم المنتجة مع هذا النموذج هو كبير مما يضعف فائدتها في تقييم فعالية العلاج. لتوليد نماذج حيوانية موثوقة ومتسقة للدراسة ورم خبيث في الدماغ، ونحن هنا وصف الإجراء لإنتاج ورم خبيث في الدماغ التجريبي في منزل الفأر (المصحف العضلة) عن طريق الحقن intracarotid من الخلايا السرطانية. هذا النهج يسمح احد لإنتاج عدد كبير من الدماغ الفئران الانبثاث الحاملة مع خصائص النمو وفيات مماثلة، وبالتالي تسهيل الجهود البحثية لدراسة الآليات البيولوجية الأساسية، وتقييم عوامل علاجية جديدة.
المقدمة
من ورم خبيث من سرطان الجهاز العصبي المركزي (CNS) هو مرض مدمر، ويمكن أن تنطوي إما لحمة الدماغ أو السحايا الرقيقة ( "ورم خبيث في الدماغ" يشير إلى كل من في هذه المقالة). ومن الورم الخبيث داخل الجمجمة الغالب، يفوق عدد الاورام الدبقية الأولية التي كتبها> 10: 1 1، 2. سرطان الرئة، وسرطان الثدي، وسرطان الجلد أهم ثلاثة أمراض الأورام الرئيسية التي تنتج حوادث عالية من ورم خبيث في الدماغ 3، 4. في السنوات الأخيرة، والتقدم للإعجاب في علاجات السرطان الجديدة التي طالت بشكل كبير البقاء على قيد الحياة وتحسين نوعية الحياة بالنسبة لكثير من مرضى السرطان. ومع ذلك، عند تكرار، وحدوث ورم خبيث في الدماغ يرتفع بسرعة. على سبيل المثال، أظهرت مكافحة HER2 تراستوزوماب الأجسام المضادة (هيرسيبتين) فعالية سريرية كبيرة في المرضى الذين يعانون من HER2 + سرطان الثدي. ومع ذلك فقد ظهر اتجاه مثير للقلقفي هؤلاء المرضى: ما يصل إلى 1/3 من أولئك الذين استفادوا في البداية من العلاج تراستوزوماب في وقت لاحق تطوير ورم خبيث في الدماغ 5، 6، 7 أمراض جهازية خارج القحف. للأسف، المرضى الذين يعانون من ورم خبيث في الدماغ والحرارية للعلاجات الحالية كلها تقريبا، وعادة ما تعاني من تدهور الصدمة نوعية الحياة، والبقاء على قيد الحياة لمدة عام واحد بعد التشخيص هو فقط ~ 20٪ 8. العلاجات الحالية لورم خبيث في الدماغ (بما في ذلك المنشطات، والعلاج الإشعاعي في الجمجمة، واستئصال الجراحي في المرضى المختارين) هي مجرد الملطفة، وليس العلاجية 9. لذلك، ورم خبيث في الدماغ يبرز بوصفه التحدي فرض المقبل في هذه الحقبة من علاجات السرطان الجديدة. لمواجهة التحدي غير الملباة المرضى يواجهون كل يوم في العيادة، نحن بحاجة ماسة إلى فهم أفضل لآلية الكامنة وراء ورم خبيث في الدماغ واستخدام هذه المعرفة لتطوير علاجات جديدة.
الاستعمار النجاح في الدماغ عن طريق الخلايا السرطانية المنتشر يتطلب أداء سلسلة من المهام بوساطة تفاعل معقد من اللاعبين البيولوجي متعددة، مثل تجاوز حاجز الدم في الدماغ (BBB) والهروب من الدماغ جوهري الآليات الدفاعية المناعية 10، أي من الذي لخص في خارج الجسم الحي أو في نظام المختبر. وبالتالي، السليم والمؤمنين في النماذج الحية حاسمة للدراسات من ورم خبيث في الدماغ. والتقليدية في فحص الجسم الحي ورم خبيث يدخل خلايا السرطان عن طريق حقن الوريد الذيل، مما يؤدي غالبية الخلايا لتستقر في الرئة. ونادرا ما يتم إنتاجه في الدماغ الآفات النقيلي في هذه النماذج قبل نفوق الحيوانات التي تسببها عبء الورم في الرئة 11. حقن داخل المخ مباشرة من الخلايا السرطانية تنتج متسقة ثمرة ورم في الجهاز العصبي المركزي، ويستخدم على نطاق واسع في الدراسات الاورام الدبقية الأولية. ومع ذلك، قحقن اوك يؤثر سلبا على BBB ويسبب الإصابات في موقع الحقن، وكلاهما النقاط الرئيسية ذات الاهتمام لأهمية الفسيولوجية لهذا النموذج. آخر كثيرا ما تستخدم الطريق إدخال الخلايا السرطانية، والحقن داخل القلب، من السهل لإدارة وإنتاج لا الانبثاث التجريبية إلى الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، الانبثاث المتزامنة إلى مواقع الهيئة أخرى من الجهاز العصبي المركزي ودائما إنتاجها وقد يسبب نفوق الحيوانات 11؛ وبالتالي فإن درجة عالية من التباين من هذا النموذج يجعل من غير مناسب لتقييم كمي لآليات البيولوجية أو العوامل العلاجية مع عدد محدود من الحيوانات.نحن هنا وصف الإجراءات لإنتاج ورم خبيث في الدماغ التجريبية عن طريق حقن الخلايا السرطانية في الشريان السباتي المشترك. وقد استخدمنا هذا النهج لتشريح المساهمات الجينات الفردية "إلى سلسلة المنتشر من ورم خبيث في الدماغ، وتقييم فعالية التدخل العلاجيالصورة 12 و 13. وتشمل المزايا الرئيسية لهذا النهج هي درجة عالية من استنساخ وانخفاض درجة التباين. العيب الرئيسي هو التطور والبراعة المطلوبة لأداء المجهرية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
بيان الأخلاق: تمت الموافقة على جميع الدراسات على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) من جامعة تكساس مركز اندرسون للسرطان.
1. إعداد الخلايا السرطانية للحقن
- البذور الخلايا السرطانية واحد أو يومين قبل الحقن. استخدام DMEM / وسائل الإعلام F12 تستكمل مع 10٪ FBS، ما لم تتم الإشارة إلى وسيلة تخصص في الأدب للحصول على خط خلية معينة.
- في يوم من عملية جراحية، وخلايا الحصاد عندما تصل إلى 70-80٪ التقاء قبل غسل الأولى مع وسائل الإعلام الحرة المصل مرة واحدة قبل trypsinization (0.25٪) عن 1-2 دقائق عند 37 درجة مئوية. إضافة إلى خلايا 10٪ FBS التي تحتوي على DMEM وسائل الإعلام / F12 لإرواء التربسين 0.25٪.
- الطرد المركزي الخلايا في 80 × ز لمدة 3 دقائق. غسل الخلايا في وسائل الإعلام الحرة المصل مرتين لإزالة المصل المتبقي، عد الخلايا مع عدادة الكريات وإعادة تعليق في هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS) في 1-5 × 10 6 خلية / مل، اعتمادا على خط الخلية. الحفاظ على الجليدحتى وقت الحقن.
واستخدمت MDA-MB-231 خلايا سرطان الثدي وخلايا سرطان الجلد K1735 في هذه الدراسة، واستخدمت كل من خطوط الخلايا في 2 × 10 6 خلية / مل تركيز: ملاحظة. إبقاء مدة trypsinization قصيرة قدر الإمكان overtreatment قد تؤثر على نتائج فحوصات ورم خبيث.
2. إعداد الفئران لورم حقن الخلايا
- تخدير الفئران عن طريق داخل الصفاق (IP) حقن الكيتامين / كوكتيل زيلازين (الكيتامين 100 ملغ / كغ، زيلازين 10 ملغ / كلغ).
- تأكيد التخدير الكامل من جانب معسر القدمين الحيوانية ومراقبة عدم استجابة.
- ضع الماوس على طبق من زجاج (التي تستخدم لصب المواد الهلامية البروتين)، وآمنة مع الأربطة المطاطية.
- إذا لزم الأمر، وإزالة شعر الرقبة عن طريق حلق أو تطبيق كمية صغيرة من المنتج إزالة الشعر ومسح الشعر قبالة مع منشفة ورقية. ملاحظة: إذا كنت تستخدم الفئران عارية، تخطي هذه الخطوة لأنها لم يكن لديك شعر الجسم.
- تنظيف جلد الرقبة عن طريق تطبيقبوفيدون اليود و 70٪ كحول.
- ضع الماوس على مرحلة من مراحل المجهر تشريح
- إجراء شق في الجلد ~ 1 سم مع مشرط جراحي.
- بصراحة تشريح العضلات مع ملقط مسنن لفضح الشريان السباتي تحتها.
- فصل الشريان السباتي من العصب المبهم المجاور مع ملقط الجراحة.
- باستخدام ملقط جراحي، فصل بعض القطن من القطن الكرة، بلل، والأزياء في كرة القطن الصغيرة. وضع هذه الكرة القطن رطب عازلة تحت الشريان السباتي الموقع المقصود من الحقن.
- وضع القاصي خياطة والأقرب إلى الكرة القطن وجعل عقدة فضفاضة. تشديد عقدة القريبة لمنع تدفق الدم في موقع الحقن.
- انتقل إلى حقن الخلايا السرطانية إذا كان الشريان السباتي على كرة من القطن ويبدو الضغط تماما مع الدم الحمراء الطازجة.
3. سرطان حقن الخلايا في الشريان السباتي
- دوامة ورسم 100 ميكرولتر سالخلايا السرطانية و في حقنة.
- تحت المجهر تشريح، تضاف ببطء إبرة G 31 (مع شطبة متابعة) في تجويف الشريان السباتي يجلس على قمة الكرة القطن.
- ببطء حقن الخلايا من الحقنة في الشريان السباتي. نجاح الحقن يمكن ملاحظتها تحت المجهر من قبل تغيير لون الأوعية الدموية القريبة والجهاز العضلي عندما يتم دفع الخلايا السرطانية مخزنة في الدورة الدموية.
- عندما حقن وحدة التخزين بالكامل كاملة، ورفع الشريان السباتي البعيدة بلطف لمنع قلس.
- تشديد بسرعة عقدة البعيدة لإتمام عملية الحقن.
- بعد الانتهاء من الحقن، وتشديد الرقابة على الأربطة وتقليم خياطة الحرير الزائدة مع مقص الصغرى تحت المجهر تشريح. نقل مرة أخرى عضلة تفصل لتغطية الجرح. إغلاق الجلد مع اثنين من الدبابيس.
4. استعادة الجراحي
- نقل الحيوانات تعمل على وسادة التدفئةلتحقيق الانتعاش. قد يستغرق 30-60 دقيقة للحيوانات لاستعادة وعيه. في هذه الأثناء، إدارة البوبرينورفين (0.05 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن تحت الجلد كما التسكين بعد الجراحة. ملاحظة: ينبغي توفير تسكين وفقا لوافق IACUC المحلي البروتوكول.
- مرة واحدة توقظ الحيوانات واستئناف سلوكهم الطبيعي، وعودة الفئران إلى موقع سكنهم. توفير الفئران مع الغذاء هلام لعدة أيام بعد الجراحة. الاحتفاظ بسجل الجراحية والاحتفاظ بها في الغرفة.
5. عدم الغازية في فيفو التصوير
- للخلايا المسمى مع ثوابت مراسل وسيفيراز، وقياس الخلايا السرطانية كفاءة الحقن باستخدام المجراة نظام التصوير 14.
لم يتم تنفيذ التصوير في يوم من الحقن لتجنب الضغط المفرط على حيوانات التجارب: ملاحظة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هناك نوعان من النقاط التي نوعية الحقن يمكن تقييمها. الفرصة الأولى عن طريق الملاحظة المشغل من تغيير الألوان الأوعية الدموية أثناء الحقن. تسرب من الحقن الفقيرة يمكن ملاحظتها بسهولة تحت المجهر تشريح. وضع ثابت وآمن للجسم الفأر (الشكل 1A) والشريان السباتي في (الشكل 1B) في التعامل مع الكرة القطن دعم من العوامل الهامة للحقن سلسة وناجحة في الشريان السباتي. النقطة الثانية لتقييم نوعية الحقن هي مرحلة ما بعد الجراحة التصوير غ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوات الأكثر أهمية لنجاح حقن الشريان السباتي الشرايين من الخلايا السرطانية هي: 1) التخدير العميق من الماوس في التحضير لعملية جراحية. 2) وضع ثابت من الشريان السباتي على رأس دعم القطن. 3) ربط ضيق الشريان السباتي بعد نجاح الحقن.
التخدير العميق ~ 30 دقيقة عادة ما يكون ضروريا لأداء العمليات الجراحية ثابت تحت المجهر تشريح. نحن نستخدم جاهزة للاستخدام تجاريا كوكتيل الكيتامين / زيلازين للتخدير الماوس. لتجنب الجرعات الزا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
المؤلفون ليس لديهم أي اعترافات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| محلول هيدروكلوريد الكيتامين / زيلازين هيدروكلوريد | Sigma-Aldrich | K113 | |
| المجهر المجسم الروتيني Leica M50 | Leica | M50 | المجهر معياري وقابل للتكوين بدرجة كبيرة ليناسب متطلبات مساحة معينة. |
| سكيبيل جراحي يمكن التخلص | منه Integra Miltex | 4-410 | لعمل شقوق جلدية |
| ملقط الأنسجة - 1 × 2 أدوات | العلوم الدقيقة | 11021-12 | لتشريح الصمغ بصراحة |
| Dumont # 5 - ملقط إنهاء المرآة | أدوات العلوم الدقيقة | 11252-23 | لفصل وإعداد الشريان السباتي للحقن |
| مقص الربيع | أدوات العلوم الدقيقة | 15025-10 | لقطع الغرز |
| EZ Clip Kit | Stoelting | 59020 | لحقنة الأنسولين BD للجرح |
| Becton Dickinson | 328438 | لحقن الخلايا | |
| IVIS Spectrum In Vivo< / em> نظام التصوير | PerkinElmer | 124262 |
المراجع
- Gavrilovic, I. T., Posner, J. B. Brain metastases: epidemiology and pathophysiology. J Neurooncol. 75 (1), 5-14 (2005).
- Patchell, R. A. The management of brain metastases. Cancer Treat Rev. 29 (6), 533-540 (2003).
- Barnholtz-Sloan, J. S., et al. Incidence proportions of brain metastases in patients diagnosed (1973 to 2001) in the Metropolitan Detroit Cancer Surveillance System. J Clin Oncol. 22 (14), 2865-2872 (2004).
- Schouten, L. J., Rutten, J., Huveneers, H. A., Twijnstra, A. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94 (10), 2698-2705 (2002).
- Bendell, J. C., et al. Central nervous system metastases in women who receive trastuzumab-based therapy for metastatic breast carcinoma. Cancer. 97 (12), 2972-2977 (2003).
- Clayton, A. J., et al. Incidence of cerebral metastases in patients treated with trastuzumab for metastatic breast cancer. Br J Cancer. 91 (4), 639-643 (2004).
- Romond, E. H., et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med. 353 (16), 1673-1684 (2005).
- Mayer, M. A patient perspective on brain metastases in breast cancer. Clin Cancer Res. 13 (6), 1623-1624 (2007).
- Lin, N. U., Bellon, J. R., Winer, E. P. CNS metastases in breast cancer. J Clin Oncol. 22 (17), 3608-3617 (2004).
- Zhang, C., Yu, D. Microenvironment determinants of brain metastasis of brain metastasis. Cell Biosci. 1 (1), 8(2011).
- Fidler, I. J., Nicolson, G. L. Organ selectivity for implantation survival and growth of B16 melanoma variant tumor lines. J Natl Cancer Inst. 57 (5), 1199-1202 (1976).
- Zhang, L., et al. Microenvironment-induced PTEN loss by exosomal microRNA primes brain metastasis outgrowth. Nature. 527 (7576), 100-104 (2015).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Cancer Res. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Zhang, C., Zhang, F., Tsan, R., Fidler, I. J. Transforming growth factor-beta2 is a molecular determinant for site-specific melanoma metastasis in the brain. Cancer Res. 69 (3), 828-835 (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
