مقالة منهجية

تحليل البروتينات ملزم كاب في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأوكسجين فسيولوجية

DOI:

10.3791/55112

⸱

ديسمبر 28, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولات زراعة الخلايا البشرية لتحليل عوامل بدء الترجمة التي تربط غطاء 5 'من mRNA أثناء ظروف الأكسجين الفسيولوجية. تستخدم هذه الطريقة نظيرا m7GTP مرتبطا ب Agarose وهي مناسبة للتحقيق في عوامل ربط الغطاء وشركائها المتفاعلين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحكم الانتقالي هو نقطة محورية لتنظيم الجينات ، خاصة خلال فترات الإجهاد الخلوي. تعد الترجمة المعتمدة على الغطاء عبر مركب eIF4F إلى حد بعيد المسار الأكثر شيوعا لبدء تخليق البروتين في الخلايا حقيقية النواة ، ولكن الاختلافات الخاصة بالإجهاد في هذا المركب آخذة في الظهور الآن. يعد تنقية البروتينات المرتبطة بالغطاء براتنج تقارب يتكون من m7GTP المرتبط ب Agarose (نظير غطاء mRNA مقاس 5 بوصات) أداة مفيدة لتحديد العوامل المشاركة في تنظيم بدء الترجمة. نقص الأكسجة (انخفاض الأكسجين) هو إجهاد خلوي يواجه أثناء نمو الجنين وتطور الورم ، ويعتمد بشكل كبير على تنظيم الترجمة. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ مؤخرا عن أن الأعضاء البشرية البالغة تحتوي على نسبة أقل من الأكسجين (الفيزيولوجيا 1-9٪ أكسجين) أقرب إلى نقص الأكسجة من الهواء المحيط حيث يتم زراعة الخلايا بشكل روتيني. مع التوصيف المستمر لمركب eIF4F ناقص التأكسج (eIF4FH) ، هناك اهتمام متزايد بفهم بدء الترجمة المعتمدة على الأكسجين من خلال غطاء mRNA 5 '. لقد طورنا مؤخرا طريقة لزراعة الخلايا البشرية لتحليل البروتينات المرتبطة بالغطاء التي ينظمها توافر الأكسجين. يؤكد هذا البروتوكول على إجراء زراعة الخلايا والتحلل في محطة عمل نقص الأكسجة للقضاء على التعرض للأكسجين. يجب تحضين الخلايا لمدة 24 ساعة على الأقل حتى تتوازن الوسائط السائلة مع الغلاف الجوي داخل محطة العمل. لتجنب هذا القيد ، يمكن إضافة وسائط مكيفة مسبقا (غير مؤكسجة) إلى الخلايا إذا كانت هناك حاجة إلى نقاط زمنية أقصر. تتطلب بعض البروتينات المرتبطة بالغطاء تفاعلات مع قاعدة ثانية أو يمكنها تحلل m7GTP ، لذلك قد يتم تفويت بعض تفاعلات الغطاء في عملية التنقية. يمكن استبدال الأجزاء المقاومة للغطاء المقاوم للإنزيمات المرتبطة بالأغاروز في هذا البروتوكول. تسمح هذه الطريقة للمستخدم بتحديد عوامل الترجمة الجديدة المنظمة بالأكسجين المشاركة في الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السيطرة متعدية يبرز بوصفه خطوة هامة على حد سواء لتنظيم النسخي في التعبير الجيني، وخصوصا خلال فترات الإجهاد الخلوي 1. وهناك نقطة محورية في السيطرة الترجمة في الحد من معدل خطوة من الشروع حيث تتضمن الخطوات الأولى لتخليق البروتين الربط من حقيقيات النوى عامل بدء 4E (eIF4E) إلى methylguanosine 7 (م 7 GTP) 5 'السقف من من mRNAs 2 . eIF4E هو جزء من مجمع مثلوثي اسمه eIF4F يتضمن eIF4A، وهو هيليكاز RNA، وeIF4G، وهو بروتين السقالات اللازمة لتوظيف العوامل الترجمة الأخرى و40S الريبوسوم 3. في ظل الظروف الفسيولوجية العادية، ويتم تحويل الغالبية العظمى من من mRNAs عبر آلية تعتمد على كأب، ولكن في ظل فترات من التوتر الخلوي حوالي 10٪ من من mRNAs الإنسان يحتوي على 5 'UTRs والتي قد تسمح ترجمة مستقلة غطاء intiation 1،4. وكانت الترجمة التي تعتمد على غطاء مرادف تاريخياالأوس مع eIF4F، ومع ذلك، فقد أصبحت الاختلافات الإجهاد محددة من eIF4F موضوع تتجه 5-8.

الضغوط الخلوية المختلفة تسبب النشاط eIF4E إلى أن قمع عن طريق الهدف الثدييات من rapamycin مجمع 1 (mTORC1). هذا كيناز يصبح ضعف تحت الضغط، مما يؤدي إلى زيادة نشاط واحد من أهدافها، والبروتين 4E ملزم (4E-BP). غير فسفرته 4E-BP يربط eIF4E وكتل قدرتها على التفاعل مع eIF4G مما تسبب في القمع التي تعتمد على غطاء الترجمة 9،10. ومن المثير للاهتمام، وhomolog من eIF4E اسمه eIF4E2 (أو 4EHP) لها قابلية أقل بكثير عن 11 4E-BP، وربما السماح لها للتهرب من القمع بوساطة التوتر. في الواقع، يتميز في البداية باعتباره كاظمة الترجمة نظرا لعدم تفاعلها مع eIF4G 12، eIF4E2 يبدأ ترجمة مئات من mRNAs التي تحتوي على عناصر استجابة نقص الأكسجة الحمض النووي الريبي في بلدانهم UTR 3 أثناء الإجهاد ميتة 6،13. هذا التنشيط طق تحققت من خلال التفاعل مع eIF4G3، RNA ملزم البروتين عزر 4، ونقص الأكسجة عامل محرض (مؤسسة الحرمين) 2α تشكل مجمع eIF4F ميتة، أو eIF4F H 6،13. ونتيجة لكاظمة في ظل ظروف طبيعية، eIF4E2 يربط مع GIGYF2 وZNF598 14. تم، في جزء منه، حددت هذه المجمعات من خلال مرتبطة الاغاروز م 7 راتنجات GTP تقارب. هذا الأسلوب الكلاسيكي 15 هو المعيار في مجال الترجمة وهو المقايسات الأفضل والأكثر استخداما تقنية لعزل المجمعات ملزم الغطاء في المنسدلة وفي المختبر ملزمة 16-19. بوصفها الآلية الترجمة التي تعتمد على الغطاء يبرز بوصفه مرنة وقابلة للتكيف مع أجزاء المتغيرة بين 6-8،13، وهذا الأسلوب هو أداة قوية لتحديد بسرعة البروتينات ملزم غطاء رواية المشاركة في الاستجابة للضغط النفسي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن الاختلافات في eIF4F آثار واسعة كما تظهر عدة نظم نموذج حقيقية النواة لاستخدام homolog eIF4E2 لاستجابات التوتر مثل هذهكما A. thaliana 20، S. Pombe 21، D. البطن 22، وجيم ايليجانس 23.

تشير الدلائل إلى أن الاختلافات في eIF4F قد لا يكون مقتصرا فقط على ظروف عصيبة، ولكن أن تشارك في علم وظائف الأعضاء العادي 24. إمدادات الأوكسجين إلى الأنسجة (على طرفي الشعرية) أو داخل أنسجة (قياس عبر الميكروية) يختلف 2-6٪ في الدماغ 25، 3-12٪ في الرئتين 26، 3،5-6٪ في الأمعاء 27، 4٪ في الكبد 28، 7-12٪ في الكلى 29، 4٪ في العضلات 30، و6-7٪ في نخاع العظام (31). الخلايا والميتوكوندريا تحتوي على أقل من 1.3٪ أكسجين 32. هذه القيم هي أقرب إلى نقص الأكسجين من الهواء المحيط حيث الخلايا مثقف بشكل روتيني. وهذا يشير إلى أن ما كان يعتقد في السابق على أنها قد تكون العمليات الخلوية نقص الأكسجة محددة ذات صلة في إعداد الفسيولوجية. ومن المثير للاهتمام، eIF4F وeIF4F H والمشاركة بنشاط في بدء ترجمة حمامات متميزه او فئات من mRNAs في العديد من مختلف خطوط الخلايا البشرية تتعرض للأوكسجين الفسيولوجية أو "physioxia" 24. يدفع انخفاض الأكسجين أيضا نمو الجنين السليم 33 ولها خلايا عموما أعلى معدلات انتشار الأسلحة النووية، أعمار أطول، وأقل الحمض النووي من التلف وأقل استجابات التوتر العام في physioxia 34. لذلك، من المرجح eIF4F H عاملا أساسيا في التعبير عن جينات محددة في ظل الظروف الفسيولوجية.

هنا، ونحن نقدم على بروتوكول لخلايا الثقافة في ظروف الأكسجين الفسيولوجية ثابتة أو في نطاق تذبذب الديناميكية التي من المرجح أكثر تمثيلا للmicroenvironments الأنسجة. ومن مزايا هذا الأسلوب هو أن الخلايا هي lysed داخل محطة نقص الأكسجة. انها ليست في كثير من الأحيان من الواضح كيف يتم تنفيذ عملية الانتقال من ثقافة خلية ميتة إلى تحلل الخلايا في البروتوكولات الأخرى. وغالبا ما يتم إزالة الخلايا الأولى من حاضنة نقص الأكسجة الصغيرة يكونالصدارة تحلل، ولكن هذا التعرض للأكسجين قد يؤثر على المسارات البيوكيميائية مثل استجابة الخلايا للأوكسجين سريعا (واحد أو اثنين دقيقة) 35. تتطلب بعض البروتينات ملزم سقف التفاعل مع قاعدة الثانية أو يمكن أن يتحلل من GTP م 7، لذلك قد يكون غاب بعض interactors سقف في عملية التنقية. قد تكون بديلا الاغاروز مرتبطة إلى النظير غطاء مقاومة إنزيمي في هذا البروتوكول. سوف استكشاف النشاط وتكوين eIF4F H والأشكال الأخرى من eIF4F من خلال الطريقة الموصوفة هنا تسليط الضوء على معقدة وآليات التعبير الجيني التي تستخدم الخلايا خلال الظروف الفسيولوجية أو استجابات التوتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التحضير للثقافة خلية

  1. شراء الأسهم المتاحة تجاريا من الخلايا البشرية.
    ملاحظة: هذا البروتوكول يستخدم سرطان القولون والمستقيم HCT116 والخلايا الأولية الإنسان الكلى الداني أنبوبي الظهارية (HRPTEC).
  2. جعل 500 مل المتوسطة للثقافة HCT116: Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) / عالية المتوسطة الجلوكوز تستكمل مع 7.5٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين (P / S).
  3. جعل 500 مل المتوسطة للثقافة HRPTEC: المتوسطة الخلايا الظهارية تستكمل مع 5٪ FBS، 1٪ تكملة نمو الخلايا الظهارية، و 1٪ P / S.
  4. إعداد 500 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS): 140 مم كلوريد الصوديوم، 3 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 15 ملم KH 2 PO 4. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 وتعقيم بواسطة التعقيم لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية.

2. بدء التثقيف خلية

  1. بعناية نضح المتوسطة من صحن متكدسة 80-90٪ من دون إزعاج رانه الخلايا.
  2. قسامة 3-5 مل من برنامج تلفزيوني 1X في صحن الثقافة، صخرة بلطف كل قارورة لمعطف منطقة سطح الطبق، وبعناية نضح في برنامج تلفزيوني 1X. أكرر للمرة الثانية غسل برنامج تلفزيوني 1X.
  3. قسامة 3 مل من 0.05٪ حمض التربسين ethylenediaminetetraacetic (EDTA) في كل طبق والثقافة، وبلطف تهز إلى بالتساوي معطف الخلايا مع التربسين-EDTA. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقيقة.
  4. نقل خلايا منفصلة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 90 ثانية.
  5. بيليه الخلية resuspend في 1 مل من DMEM كاملة.
  6. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا الدم. حساب عدد غير مولد للحمى والبوليسترين 100 ملم خلية ثقافة الأطباق المطلوبة لتحقيق كثافة البذر الأولية لحوالي 2،500-5،000 الخلايا لكل سم 2.
  7. قبل دافئ الكامل مستنبت الخلية المحرز في خطوات 1.2 أو 1.3 في 37 ° C حمام الماء لمدة 30-45 دقيقة.
  8. تطهير زجاجة المتوسطة وقارورة زنزانة مع 70٪ من الإيثانول. من هذه النقطة كليجب أن يتم تنفيذ عمليات جو معقم و مطهر.
  9. قسامة 6 مل من DMEM الكامل إلى العديد من الأطباق ثقافة الخلية 100 ملم المطلوبة لاستخدام كامل حجم الخلايا المجمدة داخل كثافة البذر المذكورة في الخطوة 2.6.
  10. نقل حجم التعليق الخلية المحسوبة في الخطوة 2.6 إلى كل من أطباق ثقافة 100 ملم. صخرة كل لوحة يدويا لتوزيعها بالتساوي على خلايا على سطح اللوحة.
  11. وضع المصنف 100 ملم صحن زراعة الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي. تسمح للخلايا لاحتضان لا يقل عن 24 ساعة قبل الخطوات المقبلة.

3. Subculturing

  1. عرض كل طبق زراعة الخلايا تحت المجهر لتحديد نسبة confluency الخلية (٪ الخلايا التي تغطي مساحة الطبق). عودة الخلايا الحاضنة والمتوسطة كاملة قبل الدافئ وبرنامج تلفزيوني 1X. انتقل إلى الخطوة التالية إذا كانت الخلايا 80-100٪ متموجة.
  2. بعناية نضح المتوسط ​​أمضى من دون إزعاجالخلايا في كل طبق الثقافة.
  3. قسامة 3-5 مل من برنامج تلفزيوني 1X في صحن الثقافة، صخرة بلطف كل قارورة لمعطف منطقة سطح الطبق، وبعناية نضح في برنامج تلفزيوني 1X. أكرر للمرة الثانية غسل برنامج تلفزيوني 1X.
  4. قسامة 3 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA في كل طبق والثقافة، وبلطف تهز إلى بالتساوي معطف الخلايا مع التربسين-EDTA. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقيقة.
  5. خلال هذه الحضانة، قسامة مطلوبة 10 مل من المتوسط الشامل في العديد من أطباق الثقافة للحصول على كثافة خلية من خلايا 2،500-5،000 لكل سم 2.
  6. عندما الخلايا قد فصل من لوحة، وبسرعة إضافة 3 مل من مثبطات التربسين 1X محددة ودوامة بلطف الطبق لمدة 1 دقيقة لضمان أن جميع التربسين- EDTA تم تحييدها.
  7. نقل خلايا منفصلة في العقيمة 15 مل أنبوب الطرد المركزي وتوضع جانبا. إضافة 3 مل برنامج تلفزيوني 1X إلى الطبق لجمع أي الخلايا المتبقية، ونقل ذلك إلى نفسه 15 مل أنبوب الطرد المركزي.
  8. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي 150 x جلمدة 5 دقائق.
  9. نضح في وطاف resuspend الكرية خلية في 3 مل من المتوسط ​​الشامل.
  10. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا الدم والبذور أطباق ثقافة 150 ملم تحتوي على 15 مل من المتوسط كاملة للحصول على كثافة خلية من خلايا 2،500-5،000 لكل سم 2. استخدام اثنين من 150 ملم لكل فحص ملزم الغطاء.
    ملاحظة: الأوكسجين إلى خلايا نشر عبر وسائل الإعلام السائلة يعتمد على حجم 36. فمن المستحسن للحفاظ على حجم وسائل الإعلام متسقة بين التجارب ما إذا كان يتم استخدام خلايا ملتصقة أو الخلايا في تعليق. وسائل الإعلام يمكن أن تكون مشروطة مسبقا (المحتضنة في محطة العمل لمدة 24 ساعة كما هو مبين في المناقشة) لتجنب هذه المتغيرات في نشرها.
  11. ضع الأطباق المصنفة الثقافة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي. تسمح للخلايا لاحتضان لا يقل عن 24 ساعة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

4. Physioxic التعرض

  1. عرض الخلايا تحت المجهر. لبيزالنتائج ر، وضمان أن الخلايا هي 70-80٪ متكدسة لتعرض 24 ساعة، 50-60٪ متموجة لتعرض 48 ساعة، و40-50٪ متموجة لتعرض 72 ساعة.
  2. وضع الخلايا في محطة نقص الأكسجين عن الوقت المطلوب (24، 48، أو 72 ساعة اعتمادا على التجربة).
  3. تعيين محطة العمل إلى physioxia مناسبا.
    ملاحظة: على سبيل المثال، سيرافق إعداد O 2 3٪ بنسبة 5٪ CO 2 و 92٪ N 2.
    ملاحظة: إذا رغبت تقلبات الأكسجين داخل النطاق الديناميكي على جدول زمني محدد، برنامج الجدول الزمني في الصك أو يدويا ضبط إعدادات الأكسجين في فترات المطلوب.
  4. تعيين الرطوبة إلى 60٪. الجو محطة جاف للغاية على الرغم من ذلك، وسوف سائل الإعلام تتبخر بشكل ملحوظ خلال تجارب طويلة (> 48 ساعة). الحفاظ على الاحتياطي وسائل الإعلام في قارورة الثقافة خلية داخل محطة العمل (بحيث يتم معايرتها وسائل الإعلام مع جو محطة عمل) لتجديد وسائل الإعلام في ديس ثقافة الخلية[هس].
    ملاحظة: أي حل من شأنه أن تتفاعل مع الخلايا السابقة للتحلل (مثل برنامج تلفزيوني والتربسين-EDTA) يجب أن تكون مشروطة مسبقا لمدة 24 ساعة قبل استخدامها داخل محطة نقص الأكسجين بحيث equilibrates الأكسجين الذائب مع الأكسجين في الغلاف الجوي 36.
  5. إبقاء الخلايا داخل محطة العمل حتى تحلل.

5. المخازن التحضير لفحص ملزم كاب

  1. إعداد مخزنة تريس 1X المالحة (TBS).
    1. في 800 مل من O 2 درهم، ويحل 8.76 جم كلوريد الصوديوم و6.05 ز تريس قاعدة.
    2. تقديم حل لدرجة الحموضة النهائية 7.4 باستخدام 1 M حمض الهيدروكلوريك.
    3. جلب الحجم النهائي إلى 1 لتر باستخدام درهم 2 O.
  2. إعداد العازلة تحلل عدم تغيير طبيعة. إعداد تحلل العازلة اليوم للمقايسة ملزم الغطاء. جعل العازلة تحلل اضافية لتغسل حبات الاغاروز فارغة وγ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز حبات المرتبطة C10 (الخطوات 7.9 و 7.13).
    1. في 7 مل من O 2 درهم، إضافة 160 ميكرولتر 5 M بريدالتر، 160 ميكرولتر 1 م تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة، 40 ميكرولتر 200 ملم ناف، 40 ميكرولتر 1 م MgCl 2، و 40 ميكرولتر 1 ملم orthovanadate الصوديوم.
    2. إضافة 40 ميكرولتر من Igepal إلى حل 7 مل. قطع رأس ماصة للمساعدة في استرداد Igepal كما هو لزج جدا.
    3. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا، أو دوامة، الحل 7 مل حتى يتم حل جميع Igepal.
    4. رفع الحجم النهائي من الحل إلى 8 مل والحفاظ على الجليد.
  3. إعداد 4X الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) -PAGE عينة العازلة.
    1. في كوب، والجمع بين 16 مل 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 12.64 مل الجلسرين، و 8 مل dithiothreitol (DTT).
    2. إضافة 3.2 غرام من SDS و 0.16 غرام من برموفينول الأزرق. السماح مسحوق بحل بالكامل عن طريق خلط مع شريط مغناطيسي.
    3. قسامة إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge ومخزن في -20 درجة مئوية.

6. تحلل الخلايا

  1. إعداد عدم تغيير طبيعة العازلة تحلل والحفاظ على الجليد يوم الخامسه فحص ملزمة للحد الأقصى.
  2. قبل دافئة برنامج تلفزيوني 1X والتربسين في 37 ° C حمام الماء لمدة 30 دقيقة.
  3. قسامة 980 ميكرولتر من تحلل العازلة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لكل فحص ملزم غطاء يتم تنفيذها.
  4. إضافة 10 ميكرولتر من 4- (2-aminoethyl) benzenesulfonyl فلوريد هيدروكلوريد و 10 ميكرولتر من 100X الكوكتيل مثبط البروتياز إلى 980 ميكرولتر من تحلل العازلة. الحفاظ على الجليد.
  5. تجاهل وسائل الإعلام من كل طبق 150 ملم في حاوية النفايات داخل محطة نقص الأكسجة.
  6. غسل الخلايا مع 3-4 مل من الحارة برنامج تلفزيوني 1X وتجاهل كل من السائل.
  7. إضافة 1 مل من الحارة 0.05٪ التربسين-EDTA إلى كل طبق واتركيه لمدة 2 دقيقة أو حتى لم يعد يتم الالتزام الخلايا إلى لوحة.
  8. باستخدام ماصة، ونقل الخلايا من لوحة واحدة لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل. كرر حسب الحاجة بحيث يتم نقل كل لوحة من الخلايا إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge منفصلة.
  9. الطرد المركزي 1.5 مل أنابيب microcentrifuge في 6000 x ج لمدة 90 ثانية رس بيليه الخلايا.
  10. نضح التربسين باستخدام ماصة دون الإخلال بيليه. إذا تشعر بالانزعاج بيليه، وإعادة الطرد المركزي في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل في 6000 x ج لمدة 90 ثانية.
  11. غسل الخلايا مع دافئ برنامج تلفزيوني 1X قبل pipetting بلطف 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب فقط فوق بيليه. إعادة الطرد المركزي إذا حدث اضطراب بيليه.
  12. نضح في برنامج تلفزيوني من دون إزعاج بيليه.
  13. أعدت ماصة 500 ميكرولتر من 1 مل من محلول تحلل العازلة على أول بيليه الخلوية. resuspend الكرية بالكامل من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
  14. الجمع بين الخلايا معلق مع بيليه الخلية الثانية و resuspend بيليه الثاني قبل pipetting صعودا وهبوطا. كرر هذه العملية حتى يتم الجمع بين كل الكريات ومعلق لكل عينة.
  15. الجمع بين المحللة مع 500 ميكرولتر المتبقية من تحلل العازلة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  16. إزالة عينات من محطة العمل نقص الأكسجة.
    ملاحظة: بعد إضافة العازلة تحلل، لهي التي يتعين القيام بها في الهواء المحيط كما تم تعيين محطة نقص الأكسجين إلى 37 درجة مئوية، والخطوات التالية التي يتعين القيام بها الباردة (4 درجات مئوية أو على الجليد) الخطوات اللاحقة ليرة لبنانية.
  17. ليز الخلايا باستخدام الإثارة لطيف عن طريق تناوب العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 1.5-2 ساعة.
  18. الطرد المركزي الخلايا هي lysed في 12000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي.
  19. نقل المحللة إلى أنبوب جديد microcentrifuge ل1.5 مل وتجاهل بيليه.
  20. حجز جزء (5-10٪) من طاف لاستخدامها كعنصر تحكم إدخال خلية المحللة كاملة للتحليل لطخة غربية في المستقبل.

7. الفحص ملزم كاب

  1. لكل عينة، ونقل 50 ميكرولتر من فارغة الاغاروز الطين السيطرة حبة و 50 ميكرولتر من الطين حبة المرتبطة C10 γ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز لفصل 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. استخدام المقص لإزالة غيض من ماصة لتسهيل جمع من الطين حبة.
  2. بيليه حبات بذ الطرد المركزي الطين في 500 x ج لمدة 30 ثانية.
  3. إزالة طاف بعناية و resuspend الخرز في 500 ميكرولتر من TBS.
  4. كرر الخطوات من 7.2 و 7.3. بيليه الخرز في 500 x ج لمدة 30 ثانية، وإزالة طاف.
  5. نقل طاف تحتوي على المحللة من الخطوة 6.19 إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل يحتوي على حبات الاغاروز فارغة.
    ملاحظة: الخرز agarose فارغة بمثابة خطوة قبل إزالة لإزالة البروتينات من المحللة التي تتفاعل غير تحديدا مع حبة.
  6. احتضان لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف.
  7. بيليه حبات الاغاروز فارغة بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 30 ثانية.
  8. نقل المحللة إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على γ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز حبات المرتبطة C10.
  9. تغسل حبات الاغاروز فارغة عن طريق إعادة التعليق الخرز في 500 ميكرولتر من تحلل العازلة، التكوير حبات بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 30 ثانية، والتخلص من supernaتانت. تكرار ذلك أربع مرات ليصبح المجموع خمسة يغسل.
  10. resuspend والخرز agarose فارغة في عينة العازلة 1X SDS-PAGE، وتغلى حبات لمدة 90 ثانية في 95 درجة مئوية. مخزن في -20 درجة مئوية لمدة تحليل لطخة الغربي في المستقبل لمراقبة ما إذا كان البروتين ذات الاهتمام بربط غير خصيصا لحبة.
  11. احتضان المحللة مع حبات المرتبطة C10 γ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز مع الإثارة لطيف لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية لالتقاط البروتينات ملزم الغطاء.
  12. بيليه γ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز حبات المرتبطة C10 بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 30 ثانية. تجاهل طاف.
  13. غسل γ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز حبات المرتبطة C10 بتكرار الخطوة 7.9.
  14. resuspend والخرز في 600 ميكرولتر من تحلل العازلة.
  15. إضافة GTP إلى تركيز النهائي من 1 ملم.
  16. احتضان γ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز المرتبطة C10 حبات + 1 ملي GTP مع الإثارة لطيف لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. ملاحظة: هذاسوف تنأى البروتينات التي تتفاعل غير تحديدا مع م 7 GTP (أي التفاعل أيضا مع GTP غير الميثيلي).
  17. بيليه γ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز حبات المرتبطة C10 بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 30 ثانية.
  18. طاف لنقل أنبوب microcentrifuge 1.5 مل جديد وإضافة 200 ميكرولتر من 4X عينة العازلة SDS-PAGE (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 100 ملي DTT و 2٪ SDS، 0.1٪ برموفينول الأزرق، و 10٪ الجلسرين). تخزين العينة الضابطة GTP في -20 درجة مئوية لمدة المستقبل تحليل لطخة غربية 37. تغسل حبات بتكرار الخطوة 7.9.
  19. resuspend والخرز في 1X العازلة عينة SDS-PAGE (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 100 ملي DTT و 2٪ SDS، 0.1٪ برموفينول الأزرق، و 10٪ الجلسرين)، ويغلي عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. تخزين م جزء متجهة الى GTP 7 في -20 درجة مئوية لمدة المستقبل تحليل لطخة غربية 37.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل القدرة ملزم كاب ردا على الأكسجين من eIF4E وeIF4E2 في م 7 GTP الانجذاب العمود

أرقام 1 و 2 تمثل البقع الغربية النموذجية م 7 GTP تنقية تقارب من اثنين من البروتينات الرئيسية ملزم الغطاء في استجابة لتقلبات الأكسجين في اثنين من خطوط الخلايا البشرية: الكلوية القريبة الخلايا الأولية الإنسان أنبوبي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل البروتينات ملزم الغطاء في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأكسجين الفسيولوجية يمكن أن تسمح لتحديد العوامل الترجمة بدء التنظيم الأكسجين جديدة. تقارب من هذه العوامل لغطاء 5 'من مرنا أو غيرها من البروتينات المرتبطة سقف يمكن قياس قوة ارتباطهم إلى m 7 GTP مرتبطة الخرز الاغاروز. التحذير واحدة من هذه التقنية هو أنه يقيس القدرة ملزم غطاء من البروتينات بعد تحلل، ولكن يتم تنفيذ ذلك في ظل ظروف غير تغيير طبيعة التي تحافظ على تفاعلات البروتين البروتين والتعديلات بعد متعدية (PTM...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مجلس العلوم الطبيعية والهندسة في كندا ووزارة البحث والابتكار في أونتاريو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beadsJena BioscienceAC-1555Agarose-linked m7GTP
طبق استزراع 100 مم طبق استزراعCorning87722210 سم
استزراع 150 ممThermofisher130183 طبق استزراع
AEBSF هيدروكلوريدACROS المواد العضويةA0356829AEBSF
حبات الاغاروزجينا العلوم البيولوجية AC-0015التحكم في حبة الاغاروز
بروموفينول بلوفيشرBP112-25مكون من عازلة تحميل SDS-PAGE
1.5 مل أنابيب الطرد المركزيFroggaBio1210-00Sتستخدم لأجهزة الطرد المركزي بكميات صغيرة
15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةفيشر1495970Cتستخدم في زراعة الخلايا
الأولية مثبط التربسين المحددفيشرR007100DTI
DithiothreitolFisherBP172-25DTT
وسط الخلية الظهارية (مجموعة كاملة)ScienCell4101يتضمن مكملات مصل الدم وعامل النمو)
الجلسرينفيشرBP229-1مكون من SDS-PAGE تحميل المخزن
المؤقت 100 ملي غوانوزين 5'-ثلاثي الفوسفات, 1 ملجينا بيوساينس272076-0251MGTP
HCT116 سرطان القولون والمستقيمATCCCCL-247خط الخلايا السرطانية البشرية
الظهارية الأنبوبية القريبة الكلوية ATCCPCS-400-010HRPTEC
Hyclone DMEM / High GlucoseGE Life SciencesSH30022.01الوسائط القياسية لزراعة الخلايا البشرية
محلول Hyclone Penicillin-StreptomycinGE Life SciencesSV30010مكون المضادات الحيوية ل DMEM
H35 HypOxystationHypoxygenN / Aمحطة عمل نقص الأكسجة
Igepal CA-630MP Biomedicals2198596مكون المنظفات من عازلة التحلل
فوسفات أحادي البوتاسيومفيشرP288-500KH2< / sub>PO4< / sub>
كلوريد البوتاسيومفيشرP217-500KCl
كلوريد المغنيسيومفيشرM33-500MgCl2< / sub>
كلوريد الصوديومفيشرBP358-10كلوريد الصوديوم
فلوريد الصوديومفيشر5299-100NaF (مكون مثبط الفوسفاتيز في مخزن التحلل)
فوسفات ثنائي الصوديومفيشر5369-500Na2< / sub>HPO4< / sub>
الممتاز مصل الأبقار الجنينSeradigm1500-500
كوكتيل مثبط للبروتياز FBS (100x)الخلية58715مكون من عازلة التحلل
كبريتات الصوديوم دوديسيلفيشرBP166-100SDS
أورثوفاناديت الصوديومسيجما56508Na3< / sub>VO4< / sub>
Tris BaseFisherBP152-5مكون المخازن المؤقتة
0.05٪ Trypsin-EDTA (1x)Life Technologies2500-067Trypsin تستخدم لفصل الخلايا الملتصقة
طبق الخلايا الصف إشارات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  3. Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
  4. Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351 (6270), (2016).
  5. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90(2015).
  6. Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).
  7. Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).
  8. Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. , (2016).
  9. Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266 (5185), 653-656 (1994).
  10. Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).
  11. Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).
  12. Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).
  13. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
  14. Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).
  15. Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).
  16. Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).
  17. Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).
  18. Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).
  19. Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).
  20. Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).
  21. Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).
  22. Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121 (3), 411-423 (2005).
  23. Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).
  24. Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. , (2016).
  25. Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).
  26. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).
  27. Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).
  28. Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).
  29. Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).
  30. Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).
  31. Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99 (1), 394(2002).
  32. Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
  33. Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).
  34. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).
  35. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).
  36. Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).
  39. Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).
  40. Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).
  41. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
  42. Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).
  43. Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).
  44. Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cap binding ProteinsOxygen RegulationHypoxia Workstationm7GTP Agarose BeadsAffinity PurificationWestern Blot AnalysisCell Lysis ProtocolPhysiological Oxygen ConditionsTranslation Initiation FactorsGTP Wash Specificity

مقالات ذات صلة