يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قوة البساطة: قنفذ البحر الأجنة كما

7.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55113

⸱

فبراير 16, 2017

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Mississippi State University

في هذه المقالة

ملخص

تفاصيل هذه المقالة الفيديو مباشرة في منهجية الجسم الحي والتي يمكن استخدامها لمنهجية وكفاءة تميز مكونات مسارات الإشارات المعقدة وشبكات تنظيمية في العديد من الأجنة اللافقاريات.

الملخص

بشكل ملحوظ ، هناك عدد قليل من مسارات نقل الإشارات من خلية إلى خلية ضرورية أثناء التطور الجنيني لتوليد مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع الخلايا والأنسجة في شكل الجسم البالغ. ومع ذلك ، يتم اكتشاف المزيد من مكونات مسارات الإشارات الفردية كل عام ، وتشير الدراسات إلى أنه اعتمادا على السياق ، هناك حديث متبادل كبير بين معظم هذه المسارات. هذا التعقيد يجعل دراسة الإشارات من خلية إلى خلية في أي نظام نموذجي تنموي في الجسم الحي مهمة صعبة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى تحليلات وظيفية فعالة لتوصيف الجزيئات المرتبطة بمسارات الإشارات المحددة من مجموعات البيانات الكبيرة التي تم إنشاؤها بواسطة الشاشات التفاضلية من الجيل التالي. هنا ، نوضح طريقة مباشرة لتحديد مكونات مسارات نقل الإشارة التي تحكم مصير الخلية ومواصفات المحور في أجنة قنفذ البحر. إن البساطة الجينومية والمورفولوجية للأجنة المشابهة لتلك الموجودة في قنفذ البحر تجعلها نماذج تنموية قوية في الجسم الحي لفهم تفاعلات الإشارات المعقدة. يمكن استخدام المنهجية الموضحة هنا كقالب لتحديد جزيئات نقل الإشارات الجديدة في المسارات الفردية بالإضافة إلى التفاعلات بين الجزيئات في المسارات المختلفة في العديد من الكائنات الحية الأخرى.

المقدمة

شبكات الجينات التنظيمية (GRNs) وإشارة مسارات نقل تنشئ التعبير المكاني والزماني للجينات خلال التطور الجنيني التي تستخدم لبناء خطة الكبار جسم الحيوان. خلية الى خلية مسارات نقل الإشارة هي المكونات الأساسية لهذه الشبكات التنظيمية، وتوفير الوسائل التي تتواصل الخلايا. هذه التفاعلات الخلوية إنشاء وصقل التعبير عن الجينات التنظيمية والتمايز في ومن بين المناطق المختلفة خلال مرحلة التطور الجنيني 1 و 2. التفاعلات بين جهري يفرز خارج الخلية (بروابط، الخصوم)، المستقبلات، وشارك في مستقبلات السيطرة على أنشطة مسارات نقل الإشارة. مجموعة متنوعة من الجزيئات داخل الخلايا transduces هذه المدخلات مما أدى إلى التعبير المعدلة وراثيا، وتقسيم، و / أو شكل الخلية. في حين أن العديد من الجزيئات الأساسية المستخدمة على الصعيدين خارج الخلية والخلايا في مسارات رئيسية هيالمعروف، وهو المعرفة غير مكتملة بسبب في جزء كبير منه إلى تعقيد مسارات الإشارات الفردية. وبالإضافة إلى ذلك، مسارات الإشارات المختلفة غالبا ما تتفاعل مع بعضها البعض إما سلبا أو إيجابا في الخلية، داخل الخلايا، ومستويات النسخي 3، 4، 5، 6. الأهم من ذلك أن المكونات الأساسية لمسارات نقل الإشارة والحفظ جدا في جميع الأنواع metazoan، وبشكل ملحوظ، فإن معظم مسارات الإشارات الرئيسية غالبا ما تؤدي وظائف تنموية مماثلة في العديد من الأنواع عند المقارنة بين الكائنات الحية من من الكائنات الحية ذات صلة وثيقة على وجه الخصوص 7، 8، 9، 10، 11.

دراسة يشير خلال التنمية هي مهمة شاقة في أي كائن حي، وهناكهي عدة تحديات كبيرة لدراسة مسارات إشارات في معظم النماذج ثنائي الفم (الفقاريات، حبليات اللافقارية، نصف حبليات، وشوكيات الجلد): 1) في الفقاريات هناك أعداد كبيرة من الممكن يجند والتفاعلات مستقبلات / المشارك المغير، جزيئات تنبيغ الخلايا، وكذلك التفاعلات المحتملة بين مسارات الإشارات المختلفة نظرا لتعقيد للجينوم 12، 13، 14؛ 2) مورفولوجيا معقدة والحركات التخلق في الفقاريات غالبا ما تجعل الأمر أكثر صعوبة لتفسير التفاعلات الوظيفية في وبين مسارات نقل الإشارة. 3) تحليل في معظم الأنواع اللافقارية نموذج ثنائي الفم غير شوكي-تقتصر من قبل ويندوز قصيرة من الحمول باستثناء بعض الأنواع الغلالة 15 و 16.

القنفذ البحر الجنين لديها عدد قليل من القيود المذكورة أعلاه ويقدم العديد من المزايا الفريدة لإجراء تحليل مفصل لمسارات نقل الإشارة في الجسم الحي. وتتضمن ما يلي: 1) البساطة النسبية للجينوم قنفذ البحر يقلل بشكل ملحوظ من عدد ممكن يجند، مستقبلات / مستقبل مساعد والخلايا جزيء التنبيغ التفاعلات 17؛ 2) GRNs السيطرة على مواصفات والزخرفة من طبقات جرثومية ومحاور الجنينية الرئيسية هي راسخة في الأجنة قنفذ البحر، والمساعدة في فهم السياق التنظيمي للخلية / إقليم تلقي الإشارات 18، 19؛ 3) العديد من مسارات نقل إشارة يمكن دراستها بين مراحل الانقسام والمعيدة في وقت مبكر عندما تتكون الأجنة من ظهارة الطبقات واحدة التي التشكل هو أسهل لتحليل. 4) جزيئات تنطويد في مسارات إشارات في والتلاعب بها بسهولة قنافذ البحر. 5) وحامل العديد من قنافذ البحر لمدة 10 إلى 11 شهرا في السنة (على سبيل المثال Strongylocentrotus purpuratus وLytechinus variegatus).

هنا، فإننا نقدم وسيلة لتمييز منهجي وكفاءة مكونات مسارات الإشارات التي تحدد والأقاليم نمط في الأجنة قنفذ البحر لتوضيح المزايا التي توفرها العديد من الأنظمة نموذج اللافقارية في دراسة الآليات الجزيئية المعقدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. استراتيجية تصميم Morpholino إنتاجية عالية

  1. تحديد الجين (ق) من الفائدة (على سبيل المثال نهج الجين مرشح، تحليل رابطة الدول المستقلة التنظيمية، RNAseq و / أو شاشات التفاضلية البروتين).
  2. استخدام الجيني، transcriptomic، وبيانات التعبير الجيني متاح في المواقع التي يتم تحديثها باستمرار (على سبيل المثال SpBase http://www.echinobase.org 20 و S. purpuratus الجينوم البحث المتشعب: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index هتمل) لتحديد أن ملامح التعبير الزمانية المكانية يتداخل مع آلية تنموية في السؤال. إذا لم يكن هناك بيانات التعبير متاح، ثم تولد التمهيدي QPCR و / أو العقاقير في التحقيق الموقع لتقييم نمط التعبير الجيني.
  3. بعد تحديد نمط التعبير المكاني والزماني، يجب الحصول على تسلسل الحمض النووي من المواقع على شبكة الإنترنت الجينوم.
    1. لتوليد أليغنوكليوتيد] morpholino حجب الترجمة، والحصول على تسلسل سو في "المنطقة تترجم الامم المتحدة (5 '5 UTR) المنبع مباشرة من كودون بدء من أعرب تسلسل العلامة (EST) قواعد البيانات المتاحة على SpBase أو S. purpuratus الجينوم مواقع البحث. إذا كانت هذه المعلومات غير متاحة لهذا الجين من الفائدة، ثم نفذ 5 "سباق.
    2. لتصميم morpholino حجب لصق، ابحث عن تسلسل الجيني بما في ذلك الإكسونات وإنترونات باستخدام أداة سقالة blastn في SpBase أو S. purpuratus الجينوم أداة البحث.
  4. استخدام الموقع النوكليوتيد تصميم http://oligodesign.gene-tools.com من أجل تصميم المطلوب 25 قاعدة تسلسل الزوج morpholino.
    1. لmorpholino حجب متعدية، استخدم تسلسل مرنا من 5 'إلى 3' كمصدر للتسلسل الهدف متعدية. تشمل تسلسل 5 'UTR (ما يقرب من 70 النيوكليوتيدات المنبع للموقع بداية النسخ)، بالإضافة إلى 25 قواعد الترميز المنطقة (المصب من موقع بداية) مع بداية كودون واي ملحوظقوسين ال (ATG).
    2. لmorpholino حجب لصق، حدد إنترون-إكسون أو تسلسل الحدود اكسون-إنترون وتشمل 50 قاعدة (25 قواعد تسلسل اكسون و 25 قواعد تسلسل إنترون) حول المناطق الحدودية. مسح الجينوم مع تسلسل morpholino للتحقق من أن تسلسل فريد من نوعه.

2. Microinjection من Morpholino أليغنوكليوتيد]

  1. إعداد 3 الحلول الأسهم ملم من أليغنوكليوتيد] morpholino بإضافة 100 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه في morpholino قارورة 300 نانومول.
    ملاحظة: لا تستخدم DEPC المياه المعالجة لإعادة تعليق لاثيل pyrocarbonate يمكن أن تلحق الضرر morpholino.
  2. لأول تدور إعادة أسفل القارورة التي تحتوي على محلول المخزون النوكليوتيد لمدة 30 ثانية بأقصى سرعة (14000 - 16000 x ج)، دوامة لفترة وجيزة، الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 دقائق، دوامة لفترة وجيزة، والحفاظ على المخزون morpholino في الغرفة درجة الحرارة لمدة 1 ساعة على الأقل. Morpholino حل الأوراق المالية يتم تخزين الصورة من -20 درجة مئوية إلى +4 درجة مئوية.
  3. يعد حل الحقن التي تحتوي على أليغنوكليوتيد] morpholino في التركيز المطلوب. يحتوي هذا الحل عادة 20٪ الجلسرين أو 125 ملي بوكل باعتبارها الناقل و 15٪ FITC-ديكستران (فلوريسئين ثيوسيانات ديكستران 10000 ميغاواط 2.5 ملغ / ميكرولتر حل الأسهم). تستخدم FITC-ديكستران وغيرها تقارن ديكستران الفلورسنت بشكل روتيني لتحديد الأجنة حقن المجهري epifluorescence. حلول حقن مخزن في -20 درجة مئوية.
  4. الحرارة الحل morpholino عند 65 درجة مئوية في كتلة الحرارة أو حمام مائي لمدة لا تقل عن 2 - 5 دقائق.
  5. تدور لفترة وجيزة الحل morpholino لمدة 30 ثانية بأقصى سرعة (14000 - 16000 x ج)، دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي بسرعة كاملة (14،000 - 16،000 x ج) لمدة 10 دقيقة على الأقل.
  6. تحميل إبر الحقن بمحلول morpholino. لبروتوكول حقن مكروي مفصل يرجى الاطلاع Stepicheva وكلمات 2014 21 وهتاف وEttensohn، 2004"> 22.

3. التثبيت وفي بروتوكول الموضعي في 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF) في س purpuratus الأجنة

ملاحظة: يتم تعديل هذا البروتوكول من اريناس-مينا وآخرون. 2000 23 و سيتي وآخرون. 2014 (24).

  1. تثبيت
    1. إضافة عدة قطرات من تثبيتي (انظر أدناه) إلى الآبار التي تحتوي على أجنة، مزيج بلطف قبل pipetting، والسماح لهم لتسوية. إزالة الحل تثبيتي، ثم خلط الأجنة مع اثنين من يغسل 180 ميكرولتر إضافية من تثبيتي.
      ملاحظة: من المهم أن تخلط جيدا الأجنة خلال يغسل طيف من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. يمكن عدم القيام بذلك تقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
    2. ترك الأجنة لإصلاح في غسل تثبيتي الثاني لمدة 50 دقيقة إلى 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) في 4٪ المجهر الإلكتروني الصف امتصاص العرق تتكون من 10 ملي اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 0.1٪ توين-20، والاصطناعية seawateص (مضادة للغواصات). جعل هذا الحل جديدة في كل مرة حصول على أفضل النتائج. وبالإضافة إلى ذلك، لسهولة والتطبيق العملي الأجنة يتم إصلاحها في لوحات 96-جيدا.
      1. لمدة 20 مل استخدام مثبت 5 مل 16٪ امتصاص العرق، 15 مل مضادة للغواصات، و 200 ميكرولتر 1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، و 20 ميكرولتر توين-20.
    3. يغسل 5 مرات في RT مع 180 ميكرولتر من اجتماعات الأطراف غسل عازلة مكونة من 0.1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 0.5 M كلوريد الصوديوم و 0.1٪ توين-20 لمدة 5 دقائق على الأقل أو حتى الأجنة ينخفض ​​إلى أسفل البئر. مرة أخرى، ومن المهم أن تخلط جيدا الأجنة في غسل العازلة التي pipetting بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات. غسل العازلة اجتماعات الأطراف يمكن أن تستخدم لمدة 2 أيام إذا تخزينها في 4 ° C.
      1. 40 مل اجتماعات الأطراف غسل استخدام عازلة 4 مل 1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 4 مل 5 M كلوريد الصوديوم، و 32 مل درهم 2 O، و 40 ميكرولتر توين-20.
      2. ويمكن تخزين الأجنة ثابتة عند 4 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
        ملاحظة: إذا تخزين الأجنة ثابتة لفترة أطول، ثم يضاف 0.2٪ أزيد الصوديوم في اجتماعات الأطراف غسل العازلة لمنع نمو البكتيريا.
  2. قبل التهجين
    1. نضح في اجتماعات الأطراف غسل العازلة وإضافة 180 ميكرولتر من نسبة 2: 1 من اجتماعات الأطراف غسل العازلة إلى عازلة التهجين، مزيج الأجنة في حل من قبل pipetting لطيف عدة مرات، واحتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT. يتكون عازلة تهجين من 70٪ الفورماميد، 0.1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 0.5 M كلوريد الصوديوم، 1 ملغ / مل BSA و 0.1٪ توين-20.
      1. 40 مل استخدام عازلة تهجين 4 مل 1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 4 مل 5 M كلوريد الصوديوم، 4 مل O 2 درهم، 0.04 ز BSA، و 40 ميكرولتر توين-20. مزيج جيد من قبل vortexing، إضافة 28 مل الفورماميد، ودوامة مرة أخرى.
    2. إزالة نسبة 2: 1 من اجتماعات الأطراف غسل ومخازن التهجين وإضافة 180 ميكرولتر من نسبة 1: 2 من اجتماعات الأطراف غسل العازلة إلى عازلة التهجين، مزيج الأجنة في الحل، واحتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT.
    3. قبل التحقيق التهجين المزيج بلطف الأجنة في 100-150 ميكرولتر من العازلة التهجين. احتضان الأجنة عند 50 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1ح.
      ملاحظة: احتضان الأجنة بين عشية وضحاها غير مقبول. قبل تفرخ، وختم الآبار مع ورقة لاصقة من أجل منع التبخر.
  3. تهجين
    1. في أنبوب منفصل إضافة 0،1-0،3 نانوغرام / ميكرولتر من التحقيق و 500 ميكروغرام / مل الخميرة الحمض الريبي النووي النقال إلى عازلة تهجين، ثم دوامة بلطف لخلق حل التحقيق. يضاف الحمض الريبي النووي النقال الخميرة إلى حل التحقيق لخفض غير محددة ملزمة لجنة التحقيق لمكافحة الشعور. سخن هذا الحل إلى 50 درجة مئوية، والعازلة نضح التهجين.
    2. خلط الأجنة المهجنة مسبقا إلى 100 ميكرولتر من محلول التحقيق، وختم مع ورقة لاصقة، وهجن عند 50 درجة مئوية لمدة 2-7 أيام اعتمادا على التحقيق (التحقيق foxq2 يمكن المحتضنة لمدة 2 أيام).
      ملاحظة: سوف تختلف الأوقات الحضانة القائم قبالة التحقيق. بعض الجينات التي أعرب عنها في مستويات منخفضة تتطلب تصل إلى الحضانة لمدة 7 أيام. لوحات 96-جيدا يمكن وضعها في صندوق الرطوبة بمثابة تأمين ضد التبخر إذا كان ADHESفشلت ورقة إيف لختم صحيح.
    3. يغسل 5 مرات في 50 درجة مئوية مع 180 ميكرولتر من اجتماعات الأطراف تقدم طازجة غسل عازلة ليصبح المجموع 3 ساعات. ثم، ويغسل 3 مرات (15 دقيقة) مع 180 ميكرولتر من اجتماعات الأطراف غسل عازلة على RT. تذكر أن مزيج الأجنة في غسل العازلة في كل مرة من قبل pipetting بلطف عدة مرات.
  4. الأجسام المضادة الحضانة
    1. نضح في اجتماعات الأطراف غسل العازلة وخلط الأجنة في 180 ميكرولتر من عرقلة العازلة التي تتكون من 10٪ مصل الأغنام عادي و 5 ملغ / مل BSA في اجتماعات الأطراف غسل العازلة واحتضان لمدة 45 دقيقة على الأقل في RT أو 4 درجات مئوية خلال الليل.
    2. إزالة عازلة تمنع وثم خلط الأجنة في عرقلة العازلة التي تحتوي على التخفيف 1: 1500 من القلوية الأجسام المضادة الفوسفاتيز مترافق مكافحة digoxigenin المخفف في عرقلة العازلة. احتضان بين عشية وضحاها في RT في لوحة مغلقة لتجنب التبخر. ملاحظة: لا تترك الأجسام المضادة لفترة أطول من ليلة وضحاها.
    3. غسل الأجنة 6 مرات (5 دقائق أو حتى إسقاط الأجنة) في اجتماعات الأطراف غسل عازلة على RT. يمكن الأجنةخزنها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  5. وفي تطور الموقعي
    1. غسل الأجنة 3 مرات (10 دقيقة) في RT مع تقدم طازجة عازلة درجة الحموضة 9.5 تتألف من 0.1 M تريس الرقم الهيدروجيني 9.5، 100 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي MgCl 2، 1 ملم الليفاميزول، و 0.1٪ توين-20.
      1. لمدة 20 مل درجة الحموضة استخدام 9.5 العازلة 2 مل 1 M تريس الرقم الهيدروجيني 9.5، 400 ميكرولتر 5M كلوريد الصوديوم، 1 مل 1 M MgCl 2 و 20 ميكرولتر توين-20، 16.6 مل درهم 2 O، و0.0048 ز الليفاميزول.
    2. احتضان الأجنة عند 37 درجة مئوية في المخزن تلطيخ محمية من الضوء. يتكون عازلة تلطيخ من 10٪ ثنائي ميثيل الفورماميد، 4.5 ميكرولتر / مل 4-نيترو نتروبلو الأزرق كلوريد (NBT)، و 3.5 ميكرولتر / مل 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl فوسفات (BCIP) في تقدم طازجة عازلة درجة الحموضة 9.5 .
      1. ل1 مل من العازلة تلطيخ استخدام 100 ميكرولتر ثنائي ميثيل الفورماميد، 4.5 ميكرولتر NBT، و 3.5 ميكرولتر BCIP.
    3. وقف رد فعل الفوسفاتيز القلوية عن طريق غسل 3-5 مرات في اجتماعات الأطراف غسل العازلة. واي رد فعلعشر التحقيق foxq2 وعادة ما يستغرق 30 دقيقة إلى 1 ساعة. قد يحتاج بعض تحقيقات الحضانة بين عشية وضحاها في أي RT أو 4 درجات مئوية.
    4. خلط الأجنة في حل 70٪ غسل المماسح و30٪ الجلسرين. يوفر الجلسرين معامل الانكسار اللازمة للفحص المجهري. الأجنة يمكن تخزينها في هذا الحل لعدة أسابيع. ختم لوحات مع البارافين البلاستيك لمنع التبخر.
  6. إعداد الشرائح والتقاط صورة
    1. إعداد الشرائح عن طريق ترتيب ثلاث شرائح صغيرة من الشريط على الوجهين في مثلث مع فجوات صغيرة بين الشرائط على شريحة.
    2. نقل الأجنة في غسل المماسح 70٪ و 30٪ الحل الجلسرين إلى مركز المثلث، وتغطي مع ساترة.
    3. ختم ساترة عن طريق تطبيق طبقة من طلاء الأظافر حول حواف ساترة.
    4. التقاط الصور باستخدام مجهر الضوء مركب مع هدف 20X وكاميرا مثبتة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في جنين قنفذ البحر أظهرنا أن 3 إشارات Wnt مختلف فروع (WNT / β-كاتينين، WNT / JNK، وWNT / بي كي سي) 4، 25 تفاعل لتشكيل شبكة الإشارات WNT الذي يحكم الأمامي الخلفي (ا ف ب) الزخرفة. إحدى النتائج الأكثر أهمية في هذه الأحداث يشير هو أن أعرب على نطاق واسع الأمامي الأديم الظاهر العصبي (م ن أ) GRN الأولي يصبح مقصورا على منطقة صغيرة حول القطب الأمامي مع بداية تكون المعيدة (24 HPF في S. purpuratus...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

منهجية المعروضة هنا هي مثال يوضح قوة باستخدام الأجنة مع أقل التعقيد الجيني والصرفي من الفقاريات لفهم مسارات الإشارات تنبيغ وGRNs التي تحكم آليات التنموية الأساسية .. العديد من المعامل تستخدم المقايسات مماثلة خلال تطوير قنفذ البحر في وقت مبكر لتشريح مسارات الإشارات المشاركة في الأحداث مواصفات مصير الخلايا الأخرى (مثل الشق، القنفذ، TGF- β، وجمعية جيل المستقبل مما يشير الى) 27، 28، 2...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نود أن نشكر الدكتور روبرت أنجرر على قراءته الدقيقة وتحريره للمخطوطة. قدمت المعاهد الوطنية للصحة R15HD088272-01 بالإضافة إلى مكتب البحث والتطوير وقسم العلوم البيولوجية في جامعة ولاية ميسيسيبي الدعم لهذا المشروع إلى RCR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مورفولينو التحول المانع و / أو أدوات الجينات مورفولينو التي تحجبLLCمخصصةمزيد من المعلومات في www.gene-tools.com
GlycerolInvitrogen15514-011
FITC (ديكستران فلوريسين إيزوثيوسيانات)Invitrogen ، Life TechnologiesD1821اصنع محلول مخزون 25 مجم / مل
محلول بارافورمالديهايد 16٪ محلول EM الصفالإلكترون علوم الفحصالمجهري 15710
MOPSSigma AldrichM1254-250G
Tween-20Sigma Aldrich23336-0010
FormamideSigma Aldrich47671-1L-F
خميرة tRNAInvitrogen15401-029
مصل الماعز العاديSigma AldrichG9023-10mL
الأجسام المضادة للديجوكسيجينين المترافقة بالفوسفاتيز القلويةروش11 093 274 910
تتراميسول هيدروكلوريد (ليفاميزول)سيجما ألدريتشL9756-5G
تريس بيس UltraPureResearch Products Internationall Corp56-40-6
كلوريد الصوديومفيشر ScientificBP358-10
كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتش7786-30-3
BCIP (5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل فوسفاتروش11 383 221 001
4 كلوريد نيترو بلو تيترازوليوم (NBT)روش11 383 213 001
ثنائي ميثيل فورماميدسيجما ألدريتشD4551-500 مل
كلوريد البوتاسيومسيجما ألدريتشP9541-5KG
بيكربونات الصوديومسيجما ألدريتشS5761-500G
كبريتات المغنيسيومسيجما ألدريتشM7506-2KG
كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتشC1016-500G
لصق

المراجع

  1. Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
  2. Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
  3. Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
  4. Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467(2013).
  5. Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
  6. Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
  7. Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
  8. Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
  9. Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
  10. Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
  11. Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434(2015).
  12. Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
  13. Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
  14. Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
  15. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  16. Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
  17. Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
  19. Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259(2010).
  20. Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
  21. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841(2014).
  22. Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
  23. Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
  24. Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
  25. Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343(1998).
  26. Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
  27. Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
  28. Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
  29. Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
  30. Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
  31. Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
  32. Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
  33. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
  34. Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001(2016).
  35. Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
  36. Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
  37. Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
  38. Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

قوة البساطة: قنفذ البحر الأجنة كما
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.