يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل السريع لBMPR-IB + الدهنية المشتقة الخلايا اللحمية للاستخدام في قبي عيب شفاء نموذج

6.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55120

⸱

فبراير 24, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

قد تكون الخلايا اللحمية المشتقة من الدهون < p class = 'jove_content'> مفيدة لهندسة أنسجة جديدة من خلايا المريض نفسه. نقدم بروتوكولا لعزل مجموعة سكانية فرعية من الخلايا اللحمية المشتقة من الدهون البشرية (ASCs) مع زيادة إمكانات العظم ، متبوعا بتطبيق الخلايا في اختبار الشفاء الجلدي في الجسم الحي.

الملخص

يمكن أن تسبب السرطانات الغازية والإصابات الكبيرة والعدوى عيوبا في العظام كبيرة جدا بحيث لا يمكن إعادة بنائها بعظم موجود مسبقا من جسم المريض. إن القدرة على نمو العظام من جديد باستخدام خلايا المريض الخاصة ستسمح بملء العيوب العظمية بأنسجة كافية دون مراضة حصاد العظام الأصلية. هناك اهتمام باستخدام الخلايا اللحمية المشتقة من الدهون (ASCs) كمصدر لهندسة الأنسجة لأنه يتم الحصول عليها من مصدر وفير: الأنسجة الدهنية للمريض. ومع ذلك ، فإن ASCs هي مجموعة سكانية غير متجانسة وقد تكون بعض المجموعات السكانية الفرعية أكثر فعالية في هذا التطبيق من غيرها. يمكن أن يؤدي عزل أكثر مجموعات الخلايا العظمية من ASCs إلى تحسين كفاءة وفعالية عملية هندسة العظام. في هذا البروتوكول ، يتم الحصول على ASCs من الأنسجة الدهنية تحت الجلد من متبرع بشري. يتم عزل السكان الفرعيين من ASCs التي تعبر عن علامة BMPR-IB باستخدام FACS. ثم يتم تطبيق هذه الخلايا على اختبار شفاء العيوب الجليزية في الجسم الحي ووجد أن لديها إمكانات تجدد عظمية محسنة مقارنة بالخلايا غير المصنفة.

المقدمة

عيوب العظام الكبيرة الناتجة عن إصابات أو عدوى أو سرطان الغازية لها تأثير كبير على الانتعاش المريض ونوعية الحياة. وتوجد أساليب لملء هذه العيوب مع العظام صحية من أماكن أخرى في جسم المريض نفسه، ولكن هذا التحويل يحمل الاعتلال الخاص وخطر حدوث مضاعفات 1، 2، 3. وعلاوة على ذلك، بعض العيوب كبيرة جدا أو معقدة كافية العظام المانحة غير متوفر لملء العيب. الأجهزة التعويضية هي خيار محتمل لملء العيوب العظمية ولكن هذه ترتبط مع العديد من العيوب بما في ذلك خطر العدوى، وفشل في الأجهزة، ورد فعل جسم غريب (4).

لهذه الأسباب هناك اهتماما كبيرا في إمكانية هندسة بدائل العظام البيولوجية باستخدام خلايا المريض نفسه 5. الخلايا اللحمية الدهنية المشتقة (مخولا لصيانة طائرات)لديها إمكانات لهذا التطبيق لأنها متوفرة بكثرة في الأنسجة الدهنية للمريض والتي أظهرت القدرة على شفاء عيوب العظام عن طريق توليد جديدة العظام نسيج 6، 7. مخولا لصيانة طائرات هي مجموعة متنوعة من السكان من الخلايا والعديد من الدراسات أظهرت أن اختيار لعلامات سطح الخلية محددة يمكن أن تنتج سكان الخلية مع تعزيز النشاط عظمية 8 و 9. ان اختيار مخولا لصيانة طائرات وفقا لأعلى إمكانات عظمية تزيد من احتمال أن سقالة المصنف مع هذه الخلايا يمكن تجديد عيب العظام الكبيرة.

عظم البروتين المخلق (BMP) إشارات حاسمة لتنظيم التمايز تكوين العظام و10 ونوع BMP مستقبلات IB (BMPR-IB) ومن المعروف أنها مهمة لتكون العظم في مخولا لصيانة طائرات 11. مؤخرا، لقد أظهرنا أنه تعبير عن BMPR-IB يمكن بالبريد تستخدم لتحديد لمخولا لصيانة طائرات مع تعزيز النشاط عظمي المنشأ 12. هنا علينا أن نظهر بروتوكول لعزل BMPR-IB، معربا عن مخولا لصيانة طائرات من الدهون البشرية يليه فحص نشاطهم عظمي المنشأ باستخدام المجراة قبي نموذج عيب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على عينات من المرضى الذين أعطوا الموافقة المسبقة عن: ملاحظة. تم استعراض كافة البروتوكولات والموافقة عليها من قبل جامعة ستانفورد مجلس المراجعة المؤسسية المناسبة. أثناء التعامل مع الأنسجة والخلايا البشرية، تلتزم دائما السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2) الاحتياطات، على النحو المحدد من قبل مؤسستكم.

1. إعداد الكواشف

  1. إعداد FACS العازلة: إضافة 10 مل FBS و 5 مل بولوكسامير 188 و 5 مل القلم بكتيريا الى 500 مل العقيمة مخزنة المالحة الفوسفات (PBS).
  2. إعداد هضم خليط: إضافة 0.375 ز جيم hemolyticum نوع كولاجيناز الثاني مسحوق و 5 مل بولوكسامير 188-500 مل العقيمة 199 / EBSS المتوسطة.
  3. إعداد المتوسطة القياسية: إضافة 50 مل FBS و 5 مل القلم بكتيريا إلى 500 مل Dulbecco لتعديل النسر متوسطة.

2. حصاد وعزل مخولا لصيانة طائرات

ملاحظة: تأكد من الموافقات مؤسسية كافية في مكانها الصحيح لاستخدام الأنسجة البشرية ولعزل حالخلايا الجذعية أومان. الحصول على البطن البشري، الجناح، أو الفخذ الدهون تحت الجلد من متبرع سليم تمر شفط الدهون انتخابي. الحفاظ على الدهون في شفط علبة بلاستيكية.

  1. إضافة برنامج تلفزيوني العقيمة في نسبة 1: 1 للدهون في علبة من البلاستيك الأصلي. (إذا كان هناك 500 مل الدهون، إضافة 500 مل PBS). مزيج من قبل الإثارة لطيف لمدة 30 ثانية. السماح للطبقة المائية لتستقر في القاع (الشكل 1)، ثم نضح وتجاهل الطبقة المائية مع ماصة 10 مل من البلاستيك تعلق على الشفط.
  2. صب الدهن في وعاء بلاستيكي كبير وإضافة هضم الخليط في نسبة 1: 1. إغلاق الحاويات وتنظيف خارج مع 70٪ من الإيثانول. ختم غطاء مع فيلم البارافين.
  3. تستنهض الهمم هذه الحاوية في شاكر المداري في 180 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. تحييد الهضم عن طريق إضافة المتوسطة القياسية في نسبة 1: 1. (إذا كان هناك 1000 مل الدهون الخليط، إضافة 1000 مل المتوسطة قياسي).
  5. توزيع الخليط بالتساوي إلى عدد زوجي من 250 مل البلاستيك أنابيب الطرد المركزي مخروطي الشكل والطرد المركزي الخليط في 300 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  6. نضح طاف ونكون حذرين للمغادرة بيليه سليمة. الكريات resuspend في 5 مل المتوسطة القياسية لكل أنبوب مخروطي الشكل.
  7. تصفية تعليق من خلال مرشح 100 ميكرون في واحدة من 50 مل أنبوب مخروطي أجهزة الطرد المركزي. ثم، الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  8. نضح طاف و resuspend بيليه في 5 مل درجة حرارة الغرفة العازلة تحلل كريات الدم الحمراء. يسمح هذا المزيج على الجلوس لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  9. نضح طاف و resuspend بيليه في 15 مل المتوسطة القياسية. تصفية مرة أخرى من خلال تصفية 100 ميكرون إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي مخروطي.
  10. في جديد 50 مل المخروطية، إضافة 15 مل من محلول polysucrose مصممة للفصل على أساس الكثافة (انظر قائمة الكواشف). ثم، وعقد أنبوب في زاوية 45 درجة، ماصة بعناية الخلايا على جانبالأنبوب بحيث تعليق خلية بلطف طبقات فوق الحل polysucrose (الشكل 2).
    ملاحظة: من المهم أن خلايا ماصة على سطح الحل. لا تقم بإضافة حل polysucrose الى تعليق الخلايا حيث سيؤدي ذلك إلى خلق خليط لا رجعة فيه. وبالمثل، لا ماصة الخلايا في وسط الحل polysucrose.
  11. أجهزة الطرد المركزي لهذا الخليط في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. استخدام تسارع منخفض (2-3 من أصل 10)، وضبط وظيفة الفرامل من أجهزة الطرد المركزي إلى الصفر لهذه الخطوة.
    ملاحظة: سوف ثلاث طبقات تكون واضحة: واضح على الجزء السفلي، غائم في الوسط، وعلى رأس بلون السلمون. وطبقة وسطى تحتوي على خلايا الفائدة.
  12. باستخدام ماصة 10 مل إزالة بعناية وطبقة وسطى ونقل إلى 50 أنبوب جديد مل المخروطية.
    ملاحظة: من هو أفضل لنقل تماما وطبقة وسطى وفي عملية اتخاذ بعض الطبقات العليا والسفلى من أن تترك وراءها بعض من الطبقة الوسطى.
    13. <لى> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وتحديد إجمالي عدد الخلايا الحية.
    وأضاف نحن نستخدم عادة الأزرق التريبان إلى خليط الخلية إلى تركيز النهائي من 0.8٪ للمساعدة في عد الخلايا: ملاحظة. والخلايا الحية قابلة للحياة لا يستغرق أكثر من صبغة زرقاء وسوف تظهر بيضاء.

3. نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز لBMPR-IB خلايا إيجابية وإعداد السقالات التي تحتوي على خلية

  1. الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. resuspend الخلايا في المخزن FACS بتركيز من 1 مليون خلية لكل 100 ميكرولتر (استنادا إلى عدد خلايا فعلت في الخطوة 2.13).
  2. تحويل 10 مليون شخص على الأقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي البلاستيك المسمى "BMPR-IB". بشكل منفصل، نقل مليون الخلايا في 100 العازلة ميكرولتر FACS إلى أنبوب الطرد المركزي بلاستيكية منفصلة المسمى "غير ملوثين". إضافة 1 مل العازلة FACS إلى أنبوب "غير ملوثين". الحفاظ على ما تبقى من الخلايا في المخزن FACS على الجليد في حين أن نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز جزء من EXPERويجري iment. تسمية هذه الخلايا "لم يتم فرزها." استخدام هذه عناصر تحكم في وقت لاحق في التجربة.
  3. إضافة كمية مناسبة من مكافحة الإنسان الأجسام المضادة BMPR-IB الفلورسنت لأنبوب "BMPR-IB" وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ماصة الخليط صعودا وهبوطا بلطف لتوزيع الأجسام المضادة.
    ملاحظة: نحن نستخدم الإنسان BMPR-IB / ALK-6 الأجسام المضادة APC مترافق في التخفيف 01:10 (انظر قائمة الكواشف لمزيد من التفاصيل). ومع ذلك، فإن الأجسام المضادة من مختلف الصانعين وتركيزات الموصى مختلفة.
  4. تغطية دلو الجليد بطريقة تحافظ من الضوء. السماح للخليط الخلية / الأجسام المضادة للجلوس لمدة 30 دقيقة (أو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة الأجسام المضادة).
    ملاحظة: إذا كان يأتي الأجسام المضادة لمكافحة BMPR-IB كما الأجسام المضادة اللامقترن الأساسي الذي يتطلب الضد الثانوية، نفذ خطوة تلطيخ منفصلة على الجليد مع الأجسام المضادة الثانوية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  5. أجهزة الطرد المركزي لكلا أنابيب في300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح طاف، والحرص على عدم نضح بيليه. resuspend الخلايا مكعبات في 1 مل العازلة FACS. مرة أخرى أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. نضح بعناية وطاف resuspend الخلايا في المخزن FACS إلى تركيز من 1 مليون خلية لكل 1 مل.
  6. تصفية "BMPR-IB"، "غير ملوثين"، و "خلايا غير المصنفة" من خلال 40 ميكرون مصافى الخلية في أنابيب زجاجية FACS جديدة المسمى. شطف المرشحات مع 500 العازلة ميكرولتر FACS للتأكد من أن الخلايا لا تترك وراءها في التصفية. أيضا إضافة 2 مل المتوسطة القياسية لاثنين من أنابيب الطرد المركزي البلاستيك منفصلة المسمى "BMPR-IB-ايجابية" و "BMPR-IB-سلبي". استخدام هذين لجمع الخلايا مرتبة في الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية.
  7. على الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية، استخدام الخلايا غير ملوثين لتحديد بوابة السلبية للعلامة فلوري.
  8. باستخدام فوهة 100 ميكرون، نوع BMPR-IB خلايا الإيجابية والسلبية في أنابيب منهما يخدعtaining المتوسطة القياسية. إبقاء هذه الأنابيب المبردة عند 4 درجات مئوية خلال هذا النوع إذا كان الجهاز FACS ديها هذه القدرة.
    ملاحظة: يرجى الرجوع إلى المادة JOVE 13 من شارون وآخرون. لبروتوكول ممتازة لنظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز.
  9. باستخدام عدادة الكريات، عد الخلايا في كل أنبوب. الطرد المركزي "BMPR-IB إيجابية"، "BMPR-IB سلبية"، و "أنابيب غير المصنفة" في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح طاف، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية. ثم resuspend الخلايا في المتوسط ​​القياسي لتركيز 1 مليون خلية لكل 250 ميليلتر.
  10. الحصول على قطع قبل 4 مم PLGA السقالات المغلفة مع هيدروكسيباتيت (بولي [حامض اللبنيك الذي اشترك في الجليكوليك]). وضع كل سقالة في بئر من 24 لوحة جيدا. تغطية كل سقالة مع 50 ميكرولتر من تعليق خلية من واحدة من المجموعات الثلاث (ط حدده.د-، 200،000 الخلايا.): لم يتم فرزها،-IB إيجابية BMPR، وBMPR-IB-السالب (الشكل 3).
    ملاحظة: الرجاءالرجوع إلى مقالة JOVE 14 من لو وآخرون. لمزيد من التفاصيل حول بناء السقالات PLGA.
  11. ملء جزئيا الآبار الفارغة المحيطة المتوسطة القياسية (لمنع جفاف السقالات)، وتغطية لوحة مع غطاء لها، واحتضان في حاضنة الثقافة خلية عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

4. إنشاء العيوب قبي وتطبيق ACS التي تحتوي على سقالة

ملاحظة: تأكد من أن الموافقات مؤسسية كافية في مكانها الصحيح لإنشاء عيوب قبي في الفئران الحية. تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة ستانفورد.

  1. تخدير قرص 1 الماوس عارية باستخدام الغاز الأيزوفلورين استنشاقه أو حقنه طويل المفعول كوكتيل مخدر.
    1. لاستخدام الغاز وحده، ضع الماوس إلى غرفة التخدير وبدء تدفق الأكسجين في 2-3 لتر / دقيقة مع تركيز 2٪ من الأيزوفلورين. وبمجرد أن الفأر هو واللاوعي ully، وضعه عرضة على الحارة بطانية إعادة تدوير المياه مع وسادة absorbant ووضع خطم لها في مخروط الأنف التخدير مع نفس تركيز الأكسجين والأيزوفلورين. رصد دقيق لمعدل التنفس وضبط تركيز الأيزوفلورين حسب الحاجة.
    2. لاستخدام حقن طويلة المفعول كوكتيل مخدر، تخدير الماوس في غرفة التخدير كما هو موضح أعلاه ثم حقن مخدر كوكتيل. إزالة الماوس من غرفة التخدير ومراقبة سلوكها.
      ملاحظة: الماوس قد يظهر لفترة وجيزة من التخدير ولكن في غضون عدة دقائق وينبغي مرة أخرى تخدير تماما تحت تأثير مخدر حقن. نقل الماوس إلى الحارة بطانية إعادة تدوير المياه مغطاة وسادة absorbant.
      ملاحظة: للحصول على كوكتيل مخدر، ونحن نوصي مزيج يحتوي على الكيتامين 10 ملغ / مل وزيلازين 1 ملغ / مل في محلول ملحي، وسلمت البريتونى. الجرعة المعيارية من هذا الخليط هو300 ميكرولتر لمدة 30 ز الفأر، وهو ما يعادل الكيتامين 100 ملغ / كغ وزيلازين 10 ملغ / كغ. راجع قسم مناقشة لمزيد من التفاصيل بشأن حقن مخدر.
    3. استخدام مناورة قرصة أخمص قدميه لتحديد عمق التخدير. سوف الماوس تخدير كاف لا تتراجع مخلب لها عندما يتم مقروص أنها خفيفة من قبل الجراح.
    4. تطبيق مرهم العين لمنع جفاف القرنية.
    5. إدارة 1 ملغم / كغم البوبرينورفين ريال تحت الجلد.
      ملاحظة: توفير تسكين السابقة الى نتائج عملية جراحية في تخفيف الآلام متفوقة.
    6. خلال الإجراء بأكمله، ومراقبة معدل التنفس من الفأرة.
      ملاحظة: فأر تخدير بشكل صحيح تحت الأيزوفلورين ينبغي أن يكون معدل التنفس من 50-100 الأنفاس / دقيقة. يدل على وجود زيادة في معدل التنفس الذي تخدير خفيف جدا، في حين أن معدل التنفس انخفضت قد تشير إلى أن التخدير عميق جدا.
  2. الإعدادية الجلد من الجانب الظهري للجمجمة مع بوفيدون IODالمعهد الوطني للإحصاء حل تليها الايثانول 70٪ ثلاث مرات. ثنى مع الستائر العقيمة، وترك موقع الجراحة المكشوفة.
    ملاحظة: ارتداء القفازات الجراحية المعقمة والحفاظ على تقنية معقمة أثناء العملية. لمس الأسطح فقط معقمة وأشياء مثل ثنى العقيمة والصكوك تعقيمها. هل لديك مساعد ضبط الإضاءة، والحزم خياطة مفتوحة، الخ
  3. باستخدام مشرط 15 شفرة، وجعل شق خط الوسط سهمي الذي يمتد على معظم الجمجمة ظهري. باستخدام ملقط مسنن غرامة، التراجع عن الجلد في الجانب الأيمن من شق لفضح الصحيح العظم الجداري.
  4. باستخدام الحفر مع تعقيمها 4 مم المغلفة الماس منقب مثقاب، حفر الخلل من خلال العظم الجداري. لا تمديد عيب الماضي العظام في طبقة الأم الجافية. (الشكل 4)
  5. ضع سقالة في عيب، ومن ثم إغلاق شق الجلد مع تشغيل خياطة النايلون.
  6. مراقبة الماوس وتوفير معيار الرعاية بعد العملية الجراحية لccording لمبادئ التوجيهية المؤسسية.
    1. الحفاظ على الماوس على منشفة ورقية نظيفة داخل قفص نظيفة في الوقت الذي يتعافى. ينبغي أن توضع نصف من القفص أكثر من الحارة بطانية إعادة تدوير المياه، وينبغي في البداية أن وضع الماوس في هذا الشوط.
    2. لا تترك الماوس غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية لambulate. لا إرجاع الفأر الذي خضع لعملية جراحية لقفص مع فئران أخرى حتى يتم الشفاء منها تماما.
  7. كرر الخطوات المذكورة أعلاه مع ماوس جديد لكل السقالة التي سيتم اختبارها. تعقيم الأدوات الجراحية في بين العمليات الجراحية باستخدام معقم حبة ساخنة أو طريقة أخرى مناسبة.
  8. بعد وقت قصير من إجراء، ثم في 2 و 4 و 6 و 8 أسابيع، استخدم الصغير مسح CT لتحليل معدل إغلاق عيب قبة القحف.
    ملاحظة: انظر مقال ليفي وآخرون. 6 للحصول على وصف الاشعة المقطعية الصغير من العيوب قبي.
  9. عندما التجربة COMPLEالشركة المصرية للاتصالات، الموت ببطء الفئران عن طريق وضعها في غرفة القتل الرحيم نظيفة وبدء تدفق غاز ثاني أكسيد الكربون في غرفة بمعدل 2 لتر / دقيقة. بعد التنفس قد توقف تماما (بعد ما يقرب من 10 دقيقة) أداء خلع عنق الرحم لتأكيد القتل الرحيم.
  10. اختياريا، بعد اكتمال التجربة، واستخدام باجتزاء وتلطيخ النسيجي لتقييم تكوين العظام داخل عيب.
    ملاحظة: انظر مقال مكاردل وآخرون. 12 لمزيد من التفاصيل من إعداد العظام العينات لالأنسجة. لمراجعة التقنيات النسيجية وتلطيخ، انظر دليل النسيجي مثل دليل لعلم الأمراض الجراحية 15.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

مايكرو الاشعة المقطعية القيام به في يوم من الجراحة سوف تظهر بوضوح الخلل الجمجمة. في هذا الوقت لن يكون هناك نشوب إلى الخلل 4 مم. ويتم الحصول على مسح لاحقة مع مرور الوقت لقياس حجم الخلل مع مرور الوقت بالمقارنة مع خط الأساس. يجب أن العيوب المصنف مع BMPR-IB + الخلايا إظهار المزيد من الإغلاق السريع لعيب بالمقارنة مع BMPR-IB- والخلايا غير المصنفة (الشكل 5). بالإضافة إلى ذلك، جزء من الجمجمة التي تحتوي على خلل يمكن decalcified ومعالجتها لل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

خلال موسم الحصاد من مخولا لصيانة طائرات، فإن الخطوة الحاسمة هي الهضم كافية من الدهون مع كولاجيناز. سوف الهضم وعدم كفاية يؤدي إلى العائد المنخفض من مخولا لصيانة طائرات. خلال FACS الفرز من خلايا + BMPR-IB، فمن المهم أن تحدد بعناية البوابة بالفيروس. تحديد بوابات فضفاضة جدا قد يؤدي الى السكان فرزها ليست نقية. خلال إنشاء عيب قبة القحف، فمن الأهمية بمكان لحفر الخلل من خلال عظم الجمجمة ولكن لعد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات ليقدموها.

شكر وتقدير

CDM مدعوم من منحة الكلية الأمريكية للجراحين (ACS) للأبحاث المقيمة. MSH تم دعمه من قبل منحة التدريب السريرية لمعهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) TG2-01159. تم دعم MSH و H.P.L. و M.T.L. من قبل الجمعية الأمريكية لجراحي الوجه والفكين (ASMS) / مؤسسة جراحي الوجه والفكين (MSF) منحة الأبحاث. H.P.L. تم دعمه من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01 GM087609 وهدية من إنغريد لاي وبيل شو تكريما لأنتوني شو. تم دعم H.P.L. و M.T.L. من قبل مختبر هاجي للطب التجديدي للأطفال ومؤسسة أوك. تم دعم M.T.L. من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة U01 HL099776 و R01 DE021683-01 و RC2 DE020771. تم دعم DCW من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة 1K08DE024269 ، ومختبر هاجي للطب التجديدي للأطفال ، وجائزة الباحث في هيئة التدريس من معهد أبحاث صحة الطفل بجامعة ستانفورد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مصفاة خلية 100 ميكرونFalcon352360
15 شفرة مشرطMiltex4-515
24 لوحة بئرCorning3524
مصفاة خلية 40 ميكرونFalcon352340
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةFalcon352098
6-0 خياطة نايلون Ethilon ، 18 بوصة ، إبرة P-3 ، & nbsp ؛Ethicon1698G
Anti-BMPR-IB الأجسام المضادة الأوليةR & أنظمة DFAB5051A
قفازات جراحية BioGel PIM & ouml. lnlycke الرعاية الصحيةALA42675Z
بوبرينورفين SRZooPharm
كاسترو فيجو سائق إبرةأدوات العلومالدقيقة 12565-14
CD1 ماوس عاريتشارلز ريفر086
مسحوق كولاجيناز من النوع الثانيجيبكو17101-015
DMEM متوسطجيبكو10564-011
الحفر: سكين دائري 4.0 ممXemax SurgicalCK40
المثقاب: Z500 Brushless MicromotorNSKNSKZ500
FBSGicbo10437-077
Fisherbrand Underpads Absorbent ، 20 × 24 بوصةفيشر ساينتيفك14-206-62
وسادة شاش قطنية معقمة من فيشربراند ، 4 × 4 بوصةفيشر ساينتفوليك22-415-469
وسادة التدفئةكينت العلميةDCT-20
Hyclone 199 / EBSS المتوسطةGE & nbsp ؛ علوم الحياةSH30253.01
Isothesia isofluraneHenry Schein 050033
ملقط دقيق مع أسنانRobozRS-5150
ملقط دقيق مع أسنانRobozRS-5150
فيلم البارافين (بارافيلم) BemisPM996
PBSGibco10010-023
Pen-StrepGibco15140-122
PLGA سقالاتتركيبة خاصة
Poloxamer 188 ، 10٪SigmaP5556-100ML
حقل معقم متعدد البطانات ، 18 × 24 بوصةمستهلكان مستشفى Busse696قطع ثقب مستطيل بالحجم المناسب
محلول بولي السكروز: Histopaque 1119Sigma11191
Povidone Iodine Prep SolutionMedlineMDS093944H
مرهم Puralube petrolatum للعيون ، 1/8 أونصة أنبوبDechra المنتجات
RBC تحلل المخزنSigma11814389001
Webcol مسحات الكحول الإعداديةCovidien6818
البيطرية المؤقت

المراجع

  1. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
  2. Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: an update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
  3. Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. Bone graft substitutes. Expert Rev Med Devices. 3 (1), 49-57 (2006).
  4. Walmsley, G. G., et al. Nanotechnology in bone tissue engineering. Nanomedicine. 11 (5), 1253-1263 (2015).
  5. Chapekar, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 53 (6), 617-620 (2000).
  6. Levi, B., et al. Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects. PLoS One. 5 (6), e11177(2010).
  7. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100 (9), 1249-1260 (2007).
  8. Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. J Biol Chem. 286 (45), 39497-39509 (2011).
  9. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng Part A. 19 (7-8), 989-997 (2013).
  10. Wozney, J. M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242 (4885), 1528-1534 (1988).
  11. Wan, D. C., et al. Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).
  12. McArdle, A., et al. Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage. Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).
  13. Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (71), e4425(2013).
  14. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. J Vis Exp. (68), (2012).
  15. Lester, S. C. Manual of surgical pathology. , Saunders/Elsevier. (2010).
  16. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

BMPR IB FACS Micro CT
عزل السريع لBMPR-IB + الدهنية المشتقة الخلايا اللحمية للاستخدام في قبي عيب شفاء نموذج
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.