ونحن نقدم وسيلة لعزل وثقافة قناة وولف الماوس (WD). نحن أيضا يبرهن على وجود إجراءات مفصلة لجبل بأكمله المناعية من WDS مثقف / المعزولة حديثا مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently. معا، وتمكن هذه التقنيات دراسة التطور WD، اللف، والتمايز.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التشكل البوق هو شرط أساسي لتنمية معظم أجهزة الثدييات، بما في ذلك الجهاز التناسلي الذكري. البربخ، جزءا لا يتجزأ من الجهاز التناسلي الذكري، هو المسؤول عن تخزين الحيوانات المنوية، والنضج، والنقل. البربخ الكبار هو أنبوب ملفوف جدا أن يتطور من السلائف الجنينية بسيطة ومباشرة والمعروفة باسم قناة وولف (WD). اللف السليم من البربخ هو ضروري لخصوبة الرجال، كما الحيوانات المنوية في الخصية غير قادرين على تخصيب بويضة. ومع ذلك، فإن الآلية المسؤولة عن التنمية بربخي واللف لا تزال غير واضحة، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود طرق الثقافة الجهاز والتصوير كله. في هذه الدراسة، ونحن تصف نظام الثقافة في المختبر، وكله بروتوكول المناعي جبل لتصور أفضل لعملية WD اللف والتنمية، والتي يمكن أيضا أن تطبق على دراسة أجهزة الأنبوبية الأخرى.
المقدمة
الجهاز التناسلي الذكري يتكون أساسا من الخصية، موقع لتطوير الخلايا الجرثومية والتمايز، ونظام الأقنية معقدة ما هو مطلوب للنضوج، والنقل، وتخزين الحيوانات المنوية. البربخ هو الجهاز الأنبوبي الذي يصل الخصية مع الأسهر وتشارك بشكل رئيسي في تطوير ما بعد الخصية ونضوج الخلايا الجرثومية 1. البربخ الماوس الكبار ملفوف غاية تتطور من بسيطة ومباشرة أنبوب السلائف، قناة وولف (WD) 1. بنية معقدة وملفوف من البربخ هو ضروري للحيوانات المنوية لاكتساب القدرة على تخصيب خلايا الإناث الجرثومية 2. كيف هذا الجهاز ضروري لخصوبة الرجال يتطور ويحصل في شكل ليست مفهومة جيدا. وقد ثبت مختلف مسارات الإشارات إلى أن تشارك في تطوير WD م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت رعاية الحيوان والإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الرعاية وأخلاقيات الحيوان من جامعة نيوكاسل، وأكد أن قانون نيو ساوث ويلز الحيوان بحوث، نيو ساوث ويلز الحيوان تنظيم البحوث، ورمز الاسترالي لرعاية و استخدام الحيوانات لأغراض علمية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتخذة على الفئران عن طريق لجنة الرعاية وأخلاقيات الحيوان من جامعة نيوكاسل.
1. الوقت التزاوج
- الزوج 6-8 أسابيع من العمر من الذكور وإناث الفئران فقط قبل نهاية دورة وضح النهار.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
خلال التنمية، وWD يخضع لتغيرات كبيرة حيث يتم تحويل أنبوب بسيط ومستقيم إلى قناة معقدة للغاية وملفوف. استخدام الأساليب المذكورة أعلاه، WDS يخضع لعملية تحول مماثل في ظروف الثقافة. هنا نحن أظهرت النتائج من WDS تربيتها لمدة 3 د (الشكل 3). لتشريح الآليات الجزيئية المشاركة في WD التشكل، مستنبت يمكن أن تستكمل مع مثبطات ومنشطات تستهدف مسارات الإشارات المختلفة. ويبين الشكل 3C محلول WD بعد 3 د للثقافة في وجود إشارات Wnt المانع محددة، IWR1 10. السه.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نظام الثقافة الجهاز لديه العديد من المزايا على خلية نظام الثقافة التقليدية. هذا النظام يحتفظ العلاقات الهيكلية الأصلية والتفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا. أنه يحاكي في أنظمة الجسم الحي ويعطي معلومات أكثر دقة من دراسات ثقافة الخلية حيث العامل المتخصصة غائب. استخدام أنظمة الثقافة الجهاز حتى يكون من المزايا أكثر من استخدام كل الحيوانات. وتشمل هذه التكلفة المرتفعة لاستخدام الحيوان كله، والرعاية سهلة وصيانة نظام الجهاز ثقافة، الخ وعلاوة على ذلك، ومختلف وك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
ونود أن نشكر أعضاء المجموعة الأورام أمراض النساء لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. وهذا العمل في جزء يدعمها تمويل من الصحة الوطنية ومجلس البحوث الطبية، والمجلس الأسترالي للأبحاث، ومعهد السرطان في نيو ساوث ويلز (PST). عضو الكنيست هي المستفيدة من جامعة نيوكاسل الدراسات العليا زمالة أبحاث.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| يمكن شراء ألواح 24 بئرا | Corning ، USA | 3524 | من بائعين آخرين |
| Hank ' يمكن شراء محلول الملح المتوازن (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences ، الولايات المتحدة الأمريكية | SH30031.02 | من بائعين آخرين |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: خليط المغذيات F-12 (DMEM / F12) | Sigma ، الولايات المتحدة الأمريكية | D8437 | دافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) Interpath | , أستراليا | SH30034.02 | 10٪ FBS المستخدمة في وسط الاستزراع |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences ، الولايات المتحدة الأمريكية | SH30034.01 | تركيز 1٪ يستخدم |
| البنسلين / الستربتومايسين | جيبكو ، الولايات المتحدة الأمريكية | 15070-063 | تركيز 1٪ مستخدم |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch ؛ | Whatman ، الولايات المتحدة الأمريكية | 110409 | غشاء (0.8 & micro; م) |
| IWR1 | سيجما ، الولايات المتحدة الأمريكية | 10161-5 ملغ | 100 وميكرو ؛ يستخدم تركيز |
| M بارافورمالدهيد (PFA) علوم | المجهر الإلكتروني ، الولايات المتحدة الأمريكية | 15710 | 16٪ مخزون ، 4٪ في PBS للاستخدام. سامة - ارتد قفازات ولا التخلص منها في الحوض |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher ، الولايات المتحدة الأمريكية | 214-20L PL | Absolute ، اصنع 25 و 50 و 75٪ بماء milliQ. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher ، الولايات المتحدة الأمريكية | 2509-500 مل | لزج جدا ، حذر أثناء الاستغناء |
| عن Triton X-100 | Sigma ، الولايات المتحدة الأمريكية | T8787-50ml | لزج جدا ، حذر أثناء الاستغناء عن |
| الصوديوم فوسفات الهيدروجين | الحراري Scientific Fisher ، الولايات المتحدة الأمريكية | 621-500 مجم | يمكن شراؤها من بائعين آخرين |
| الصوديوم ثنائي فوسفات الهيدروجين | Ajax Finechem ، الولايات المتحدة الأمريكية | 4745-500 جم | يمكن شراؤها من بائعين آخرين |
| كلوريد الصوديوم | الحراري Scientific Fisher ، الولايات المتحدة الأمريكية | 465-500 جرام | يمكن شراؤها من بائعين آخرين |
| Cytokeratin8 / Troma I | Studies Developmental Hybrid Bank ، الولايات المتحدة الأمريكية (DHSB) | TROMA-I | 1: 250 في منع العازلة |
| النشطة وبيتا ؛ Catenin | تكنولوجيا إشارات الخلية, الولايات المتحدة الأمريكية | D13A1 | 1: 200 في منع المخزن المؤقت |
| phospho-Histone 3 | Millipore ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | 06-570 | 1: 200 في منع العازلة |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs ، ؛ الولايات المتحدة الأمريكية | 111-545-047 | 1:250 في منع العازلة |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, الولايات المتحدة الأمريكية | 112-585-072 | 1: 250 في حجب العازلة |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية | 242-500 مل | يمكن شراؤها من بائعين آخرين |
| n-Propyl galate | Sigma ، الولايات المتحدة الأمريكية | 2370-2 | |
| - (4-amidinophenyl) -1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma ، الولايات المتحدة الأمريكية | D9564-10mg | استخدم لتلطيخ الأحماض النووية (DNA) ثنائي |
| ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | ثيرمو فيشر علمي ، الولايات المتحدة الأمريكية | 2225-500 مل | المذيبات |
| زلات (24 × 50 مم) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
المراجع
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal develop....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
