مقالة منهجية

البكتيريا المستروحة الخارجي غشاء الحويصلات: عزل وتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات في الضامة

DOI:

10.3791/55146

⸱

فبراير 22, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Lung Research, Universities of Giessen and Marburg Lung Center, Philipps-University Marburg, 2German Center for Lung Research, 3Department of Medicine, Pulmonary and Critical Care Medicine, University Medical Center Giessen and Marburg

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن تصف تنقية البكتيريا المستروحة (L. المستروحة) حويصلات الغشاء الخارجي (OMVS) من الثقافات السائلة. ثم يتم استخدام هذه الحويصلات تنقيته لعلاج الضامة لتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البكتيريا قادرة على إفراز مجموعة متنوعة من الجزيئات عبر أنظمة إفرازية مختلفة. إلى جانب إفراز الجزيئات في الفضاء خارج الخلية أو مباشرة في خلية أخرى ، يمكن للبكتيريا سالبة الجرام أيضا تكوين حويصلات غشاء خارجية (OMVs). يمكن لهذه الحويصلات الغشائية توصيل حمولتها لمسافات طويلة ، ويتم حماية الشحنة من التدهور بواسطة البروتياز والنوكليازات.

الفيلقية الرئوية (L. pneumophila) هو مسببات الأمراض داخل الخلايا سالبة الجرام تسبب شكلا حادا من الالتهاب الرئوي. في البشر ، يصيب الضامة السنخية ، حيث يمنع التحلل الليزوزومي ويشكل فجوة تكاثر متخصصة. علاوة على ذلك ، تنتج L. pneumophila OMVs في ظل ظروف نمو مختلفة. لفهم دور OMVs في عملية عدوى الضامة البشرية ، أنشأنا بروتوكولا لتنقية حويصلات الغشاء البكتيري من الثقافة السائلة. تعتمد الطريقة على الطرد المركزي التفاضلي. تم تحليل OMVs المخصب لاحقا فيما يتعلق بكمية البروتين وعديد السكاريد الدهني (LPS) ثم تم استخدامها لعلاج خط الخلايا الأحادية البشرية أو الضامة المشتقة من نخاع عظم الفئران. تم تحليل الاستجابات المؤيدة للالتهابات لتلك الخلايا عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم. علاوة على ذلك ، تم تحليل التعديلات في العدوى اللاحقة. تحقيقا لهذه الغاية ، تمت دراسة التكاثر البكتيري ل L. pneumophila في البلاعم عن طريق فحوصات وحدة تكوين المستعمرة.

هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لتنقية L. pneumophila OMVs من الاستزراع السائل عن طريق الطرد المركزي الفائق ولتحليل المصب لإمكاناتها المؤيدة للالتهابات على الضامة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البكتيريا يمكن أن تفرز عوامل الفوعة عبر آليات مختلفة 1. إلى جانب أنظمة إفرازية المعروفة، يمكن أن البكتيريا سالبة الجرام تبادل المعلومات وتسليم عوامل الفوعة عبر الحويصلات الخارجية غشاء (OMVS)، التي هي صغيرة، الحويصلات كروي 10-300 نانومتر في القطر ومع هيكل غشاء bilayered. تفرز أنهم في مجموعة متنوعة من بيئات النمو (ثقافة السائل والثقافة الصلبة، والأغشية الحيوية) وفي جميع مراحل النمو 2 و 3. OMVS هي وسيلة هامة من وسائل النقل (على سبيل المثال، للبروتينات، adhesins، والسموم، والإنزيمات، وكذلك لLPS، التي وجدت على سطح OMV) 4. البضائع داخل اللمعة محمي من تدهور بروتين، لذلك هو قادرة على العمل لمسافات طويلة، والحويصلات يمكن العثور عليها في سوائل الجسم وأعضاء بعيدة 5، 6،"XREF"> 7، 8. أنها لا يمكن إلا أن يكون معترف بها وتناولها من قبل الخلايا حقيقية النواة 9، 10، ولكن علاوة على ذلك، فهي قادرة على تسهيل الربط من البكتيريا وغزوهم في الخلايا المضيفة (4). البكتيريا المستروحة (L. المستروحة) هو نوع من البكتيريا سالبة الجرام التي يمكن أن يطلق OMVS. في رئة الإنسان، فإنه يصيب في المقام الأول الضامة السنخية، على الرغم من المضيف الطبيعي والاميبات المياه العذبة 11. عدوى المستروحة L. يمكن أن يسبب مرض المحاربين "، وهو شكل حاد من الالتهاب الرئوي 12. فهو يمنع الانصهار يبلوع-يحلول في الخلية المضيفة. انها تجند أيضا العضيات المضيف، حيث يتم تشكيل مكانة تكرارها، والبكتيريا المحتوية فجوة (LCV) و 13 و 14. تدهور الليزوزومية هو تحول دون ليس فقط من قبل هيئة تنظيم الاتصالات البروتين المستجيبnslocation عن طريق نظام إفراز النوع الرابع، ولكن أيضا من قبل الافراج عن OMVS 15.

مطلوب تنقية OMVS من الثقافات البكتيرية لتحليل تأثيرها على خلايا المتلقي. وأظهرت دراسات سابقة ركزت على محتوى البروتين من L. المستروحة OMVS وحول تأثير الحويصلات في الخلايا الظهارية السنخية 16، ولكن دراسات لاحقة مع زرع أنسجة الرئة الإنسان التي تتخذ L. المستروحة OMVS من قبل البلاعم السنخية 17.

كما OMVS الحالية الأنماط المرتبطة الممرض الجزيئية (PAMPs) وغيرها من المضادات البكتيرية، لأنها قد يكون لها تأثير على إصابة الخلايا حقيقية النواة وتعدل المضيف الاستجابة المناعية 18. L. المستروحة OMVS تندمج بسرعة مع أغشية الخلية المضيفة وعلاوة على ذلك، فإنها تفعيل غشائي TLR2 19. كما هو معروف أن L. pneumophرابطة القانون الدولي OMVS تحفيز الضامة والخلايا الظهارية بطريقة الموالية للالتهابات 16، 17، قمنا بتحليل تأثير OMVS على عملية العدوى في الضامة الإنسان والفئران.

هنا، نحن تصف بروتوكول لزراعة L. المستروحة في الثقافة السائلة لعزل OMVS التي يفرزها تنبيذ فائق الفرق وتقييم أثر الحويصلات في الخلايا المضيفة حقيقية النواة، إما مباشرة أو بعد الإصابة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد المتوسطة وأجار لوحات

  1. إعداد 1 لتر من مرق المتوسطة (YEB). حل 10 غرام من ACES و 10 غرام من خلاصة الخميرة في 900 مل من الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة إلى 6.9 مع KOH (5 N). إضافة 10 مل من L-السيستين (0.4 غرام في 10 مل من الماء المقطر) و 10 مل من الحديد (NO 3) 3 x9H 2 O (0.25 غ في 10 مل من الماء المقطر). ملء ما يصل الى 1 لتر بالماء المقطر وتصفية تعقيم (حجم المسام: 0.22 ميكرون) حل. تخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. إعداد الفحم مخزنة خلاصة الخميرة (BCYE) أجار لوحات. حل 10 غرام من ACES و 10 غرام من خلاصة الخميرة في 900 مل من الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة إلى 6.9 مع KOH (5 N). إضافة 15 غراما من أجار و 2.5 غرام من الفحم المنشط. ملء ما يصل الى 1 لتر بالماء المقطر والأوتوكلاف.
    1. إضافة 10 مل من L-السيستين (0.4 غرام في 10 مل من الماء المقطر) و 10 مل من الحديد (NO 3) 3 x9H 2 O (0.25 غ في 10 مل من الماء المقطر، سواء تعقيمها عن طريق الترشيح من خلال 0.22 ميكرونالمسام) لBCYE تبريد (حوالي 50 درجة مئوية). صب لوحات وتخزينها في 4 درجات مئوية.

2. زراعة L. المستروحة

  1. نشر L. المستروحة سلالة كوربي (نوع البرية، WT) على لوحات أجار BCYE واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام. تطعيم 10 مل من YEB في لOD 600 من 0.3 مع L. المستروحة من لوحة preculture. احتضان البكتيريا عند 37 درجة مئوية على شاكر الدورية (150 دورة في الدقيقة) لمدة 6 ساعات.
  2. التحقق من نقاء الثقافة السائل عن طريق نشر 100 ميكرولتر من تعليق على لوحة أجار الدم. احتضان ليلا 37 درجة مئوية.
  3. إضافة ثقافة السائل المتبقي إلى 90 مل من المتوسط YEB الطازجة واحتضان على شاكر الدورية (37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة) للتوصل الى OD 600 من 3،0-3،5، والذي يستغرق حوالي 16-20 ساعة.

3. إعداد وتحديد L. المستروحة OMVS

ملاحظة: إجراء كل خطوة الطرد المركزي التاليةالصورة تحت ظروف معقمة وفي 4 درجات مئوية.

  1. أجهزة الطرد المركزي في الثقافة السائلة في 4000 x ج لمدة 20 دقيقة لتكوير البكتيريا. طاف لنقل أنابيب الطرد المركزي الجديدة، تجاهل بيليه البكتيرية، وكرر الطرد المركزي (4000 x ج لمدة 20 دقيقة). كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  2. معقمة تصفية ما تبقى من طاف مرتين (حجم المسام: 0.22 ميكرون). نقل طاف خالية من البكتيريا لأنابيب نابذة ونابذة على 100000 x ج لمدة 3 ساعات.
  3. صب طاف وتخلص منه. resuspend الكرية OMV في العقيمة مخزنة المالحة الفوسفات (PBS) ونابذة (100000 x ج لمدة 3 ساعات) لإزالة تلوث البروتينات وLPS.
  4. تجاهل طاف و resuspend بيليه OMV في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني العقيمة. خط 20 ميكرولتر على لوحة أجار الدم وعلى لوحة أجار BCYE لاستبعاد التلوث الجرثومي من الحويصلات المعدة. احتضان لوحة أجار الدم بين عشية وضحاها ولوحة BCYE أجار لمدة 3 أيام (في كل من 376؛ C).
  5. قياس كمية البروتين التي تم الحصول عليها من إعداد OMV باستخدام فحص الحمض bicinchoninic وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: تركيز 100 مل من L. ثقافة المستروحة عادة 1 ميكروغرام / ميكرولتر. تخزين OMVS إعداد وكميا في -20 درجة مئوية.

الضامة 4. قبل في علاج

  1. إعداد THP-1 الخلايا.
    ملاحظة: THP-1 هو خط خلية الوحيدات المستمدة من مريض سرطان الدم.
    1. إضافة 2x10 5 THP-1 خلايا في 24 بئرا وتمييزها عن طريق إضافة 20 نانومتر phorbol 12 ميريستيت 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) إلى خلايا تشبه البلاعم. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. استبدال المتوسطة مع 500 ميكرولتر من متوسطة جديدة واحتضان لمدة 24 ساعة أخرى. يتكون المتوسطة الأمثل لTHP-1 خلايا RPMI 1640 ارتفاع نسبة الجلوكوز تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين.
  2. عزل الضامة المشتقة من نخاع عظام الفئران (mBMDM)، كما هو موضح في الرجوعسينعقد 20.
  3. علاج الضامة مشتقة THP-1 أو mBMDM مع OMVS.
    1. ذوبان الجليد في OMVS أعدت في الخطوة 3 وإضافتها وفقا لكمية من البروتين (0.1، 1، و 10 ميكروغرام / مل) إلى الضامة الفئران البشرية أو. احتضان الضامة مع OMVS عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة على الأقل. استخدام طاف للELISA أو المضي قدما في الخطوة 5.

5. تصيب الضامة وتقييم النسخ المتماثل البكتيرية مع (كفو) الفحص وحدة-تشكيل مستعمرة

  1. استخدام L. المستروحة من الخطوة 2.1، قبل تعامل THP-1 الخلايا أو mBMDM من الخطوة 4.3، وليس الضامة قبل المعاملة والضوابط (2x10 24/05 الآبار). لا تبادل المتوسط.
  2. تصيب THP-1 الخلايا مع L. المستروحة كوربي WT وmBMDM مع متحولة-تفتقر فلاجيلين من L. المستروحة كوربي (على حد سواء مع وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 0.5، 1X10 5 L. المستروحة / 24 بئرا)، واحتضان لمدة 24 و48 ساعة، على التوالي. إعداد بوال L. المستروحة كوربي (WT أو فلاجيلين تفتقر متحولة) كما هو موضح في الخطوة 2.1.
  3. ليز الخلايا في المتوسط ​​عن طريق إضافة سابونين (تركيز النهائي: 0.1٪)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. Resuspend والبكتيريا من قبل pipetting ونقل تعليق إلى وعاء التفاعل. إعداد التخفيفات التسلسلي للالمستروحة L. المحتوية على وسائل الاعلام في برنامج تلفزيوني العقيمة.
  5. خط 50 ميكرولتر من التخفيفات المطلوب على لوحات أجار BCYE واحتضان لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية.
  6. بصريا عد المستعمرات تشكيلها. حساب كفو figure-protocol-1 تطبيع نتيجة العد كفو ليست ما قبل المعالجة، ولكن المصابين الضامة، والتي تم تعيينها إلى 100٪.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعداد التجريبية لإعداد L. المستروحة OMVS وتحليل تأثيرها على استجابة الموالية للالتهابات الضامة بعد الإصابة هو مبين في الشكل 1. ويمكن تحليل إمكانات الموالية للالتهابات من OMVS مستعدة على التمييز بين سلطة النقد الفلسطينية-THP-1 الخلايا، والذي يظهر في الشكل 2. THP-1 خلايا تستجيب مع زيادة زمنية والتي تعتمد على جرعة من IL-8 و IL-6 إفراز. بالإضافة إلى ذلك، فإن تأثير TLRs مختلفة على الاعتراف L. المستروحة OMV يمكن تحليلها باستخدام mBMDM من خلفيات وراثية مختلفة، كما قدمها CXCL1 إليسا في الشكل (3). mBMDM من الفئران WT يفرز CXCL1 بعد التحفيز OMV، في حين mBMDM TLR2 / 4 - / - يفرز أقل بكثير. لدراسة تأثير L. المستروحة OMVS على النسخ المتماثل البكتيرية في THP-1 الضامة، والخلايا ما قبل المحتضنة مع OMVS ثم يصاب بالإضافة إلى ذلكمع L. المستروحة (الشكل 4). والتحفيز قبل الضامة مشتقة THP-1 يقلل أولا تكرار البكتيريا بعد 24 ساعة من الإصابة، ولكنه يؤدي إلى تضاعف كفو العد في نقطة زمنية لاحقة (48 ح بي). ويمكن تقييم تأثير مستقبلات تول مثل (TLR) مما يدل على الاعتراف OMV بعد إصابة الضامة التي كتبها mBMDM، كما هو مبين في الشكل (4) (ب). زيادات البكتيرية النسخ المتماثل عشرة أضعاف في mBMDM من الحيوانات WT بعد OMV مرحلة ما قبل الحضانة، في حين TLR2 - / - وTRIF / MyD88 - / - الخلايا لا تظهر هذه الزيادة في النسخ المتماثل المستروحة L..

figure-results-1
الشكل 1: الإجراء التجريبي. (A) L. المستروحة كوربي WT من 10 سم، وتستخدم BCYE أجار لوحات لتطعيم ثقافة سائلة صغيرة (10 مل)، والتي يتم نقلها إلى 90 مل من YEB جديدةمتوسطة بعد 6 ساعات. ومطلي وحدة تخزين صغيرة أيضا على لوحة أجار الدم للتأكد من نقاء. يتم تحضين البكتيريا عند 37 درجة مئوية حتى مرحلة ثابتة في وقت مبكر (OD 600 = 3،0-3،5). (ب) يتم طرد ثقافة السائل ومعقمة تصفية لإزالة البكتيريا. ثم يتم ultracentrifuged طاف خالية من البكتيريا للحصول على بيليه OMV، الذي هو معلق في برنامج تلفزيوني وultracentrifuged مرة أخرى. معلق الحويصلات المعزولة، للتأكد من نقاء، وكميا لكمية البروتين. يمثل شريط النطاق 2.5 سم. يتم تحفيز (C) الضامة الإنسان أو الفئران مع OMVS كميا. طاف ثقافة الخلية يمكن استخدامها لELISA، أو الضامة ويمكن أن يصاب L. المستروحة لتحديد تكرار البكتيرية التي كتبها كفو فحص على 10 سم BCYE أجار لوحات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. و>

figure-results-2
الشكل 2: تفعيل الموالية للالتهابات من THP-1 الخلايا عن طريق L. المستروحة OMVS. (A) وهنا يتم استخدام الوحيدات خط الخلية THP-1 كنموذج لالضامة السنخية. وعولج متباينة PMA-THP-1 الخلايا مع زيادة جرعة من L. المستروحة OMVS (0،01 حتي 25 ميكروغرام / مل) لمدة 24 و 48 ساعة، على التوالي. واستخدمت طاف خالية من الخلايا لIL-8 ELISA. وتظهر القيم المتوسطة لثلاث تجارب مستقلة ± ووزارة شؤون المرأة. وردت THP-1 الخلايا إلى أقل من 0.01 ميكروغرام / مل L. المستروحة OMVS مع كبير IL-8 إفراز، الذي كان زمنيا وتعتمد على الجرعة. استخدمت (ب) L. المستروحة OMVS (0،1 حتي 10 ميكروغرام / مل) لتحفيز متباينة PMA-THP-1 الخلايا. تم جمع طاف بعد 24 و 48 ساعة من الحضانة، وتم قياس صدر IL-6 في طاف عبر ELISA. وتظهر القيم المتوسطة لثلاث تجارب مستقلة ± ووزارة شؤون المرأة. THP-1 خلايا تفرز كميات كبيرة من IL-6، حتى مع أقل جرعة من OMVS (0.1 ميكروغرام / مل). زيادة إفراز IL-6 مع زيادة جرعات OMV ومع أوقات حضانة لفترات طويلة. إحصاءات: اختبار مان ويتني. * ف <0.05 و** ف <0.01 بالمقارنة مع المقابلة 0 ميكروغرام / مل OMV. أعيد طبعها بإذن من المرجع 20. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
ويعتمد تفعيل الموالية للالتهابات الضامة على TLR2 / 4: الشكل (3). mBMDM من WT وTLR2 / 4 - / - حضنت الفئران مع L. المستروحة OMVS (0.1 أو 1 ميكروغرام / مل). تم تحليل CXCL1 إفراز بواسطة ELISA بعد 24 و 48 ساعة، على التوالي. الوتظهر القيم يعني ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة. mBMDM من WT الفئران رد مع إفراز CXCL1 تعتمد على الجرعة بعد L. المستروحة OMV الحضانة. TLR2 / 4 - / - mBMDM يفرز أقل بكثير CXCL1 مقارنة WT mBMDM، وأن هذا إفراز لا تزيد الجرعة بشكل تابع. إحصاءات: اختبار مان ويتني. * ف <0.05 بالمقارنة مع المقابلة 0 ميكروغرام / مل OMV. #P <0.05 مقارنة مع عينة WT تعامل على قدم المساواة. أعيد طبعها بإذن من المرجع 20. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تكرار L. المستروحة OMV زيادة ما قبل الحضانة البكتيري في الضامة. (A) متباينة THP-1 خلايا وقبل المحتضنة مع OMVS (0.1، 1، أو 10 μ؛ ز / مل) أو LPS / IFN-γ (200 نانوغرام / مل تركت لكل منهما) أو علاج للسيطرة. بعد مرحلة ما قبل الحضانة (20 ساعة)، أصيب THP-1 الخلايا مع L. المستروحة كوربي WT (وزارة الداخلية 0.5) لمدة 2 و 24 و 48 ساعة، على التوالي. كانت هي lysed THP-1 الخلايا عن طريق إضافة سابونين، وكانت مطلية البكتيريا على لوحات BCYE أجار. حسبت CFUs النسبي ل0 ميكروغرام / مل OMV بعد كل نقطة زمنية. تمثل القضبان القيم يعني ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة، أجريت في مكررة الفنية لكل منهما. لا توجد فروق في امتصاص البكتيريا (2 ساعة بعد العدوى (بي)) بالمقارنة مع الخلايا المعالجة قبل لا. تم تحديد التعديلات في النسخ المتماثل البكتيرية بعد 24 و 48 ساعة، على التوالي. وأظهرت LPS / معاملة ما قبل THP-1 الخلايا الإنترفيرون جاما انخفاض في البكتيري تحميل 24 ساعة بي لوحظ هذا أيضا جرعة بشكل تابع للخلايا المعالجة قبل L. المستروحة OMV. في نقطة زمنية لاحقة (48 ح بي)، وأظهرت المعالجة قبل OMV خلايا THP-1 مضاعفة في L. المستروحة إعادةالثني، في حين LPS / أظهرت الإنترفيرون جاما الضامة معاملة ما قبل خفض مزيد من الحمولة الجرثومية. إحصاءات: اختبار مان ويتني. * ف <0.05 و** ف <0.01 بالمقارنة مع المقابلة 0 ميكروغرام / مل OMV. (ب) mBMDM من الفئران مع خلفيات وراثية مختلفة (WT، TLR2 - / -، وTRIF / MyD88 - / -) وقبل المحتضنة مع 0.1 ميكروغرام / مل L. المستروحة OMVS لمدة 20 ساعة ثم تم مصابا flagellin- متحولة نقص من L. المستروحة كوربي (وزارة الداخلية 0.5) لمدة 48 ساعة. كانت هي lysed mBMDM بإضافة سابونين، وكانت مطلية من البكتيريا على لوحات BCYE أجار. تم حساب كفو النسبي ل0 ميكروغرام / مل OMV، التي أشار إليها خط الصلبة. تمثل القضبان القيم المتوسطة ±± SEM من ثلاث تجارب مستقلة، أجريت في مكررة لكل منهما. أظهرت mBMDM من WT الفئران زيادة في النسخ المتماثل المستروحة L. بعد OMV ما قبل المعالجة. TLR2 - / - الضامة أظهرت انخفاضا كبيرا - / - mBMDM. إحصاءات: اختبار مان ويتني. ف <0.05 مقارنة مع عينة WT. أعيد طبعها بإذن من المرجع 20. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويجري حاليا دراسة مكثفة لOMVS من مسببات الأمراض البكتيرية وتأثير هذه الحويصلات الغشاء على الخلايا المستهدفة. على سبيل المثال، -derived المطثية الحاطمة OMVS تحفز إفراز خلوى في الضامة، الخلايا الليمفاوية B يمكن تفعيلها من خلال OMVS من بوريليا burgdorferi، وهيليكوباكتر بيلوري -released يمكن الحويصلات الغشاء يعمل على الخلايا الظهارية المعدة 21 و 22 و 23. L. المستروحة، وهو ممرض داخل الخلايا التي يمكن أن تحفز على شكل حاد من الالتهاب الرئوي اللانمطي، كما يطلق OMVS التي تكون قادرة على تنشيط الرئة الخلايا الظهارية والضامة 16 و 19. هنا، نقدم بروتوكول مفصلة للعزلة على نطاق صغير من L. المستروحة OMVS من ثقافة السائل لدراسة الدور المحتمل للOMVS في الالتهاب الرئوي. ومن الأهمية بمكان أن يعمل تحت كونديت معقمةالأيونات واستبعاد احتمال حدوث تلوث من البكتيريا الأخرى من أجل الحصول على L. المستروحة النقي -derived إعداد OMV. وتشمل عزلة OMVS خطوة الترشيح من خلال المسام 0.22 ميكرون من أجل منع التلوث من بيليه OMV تم الحصول عليها مع L. المستروحة، على الرغم من أن هذا يقلل من العائد OMV، منذ يتم فقدان أكبر OMVS بهذه الخطوة الترشيح.

وعلاوة على ذلك، نحن اختبار رد الضامة الإنسان والفئران لتلك الحويصلات معزولة والخلايا المصابة مع L. المستروحة لتقريب أكثر عن كثب الوضع في البكتيريا الالتهاب الرئوي، حيث يتم الافراج OMVS داخل LCV بواسطة البكتيريا خارج الخلية 15. وقد تم تقدير الجرعات OMV يعملون وفقا لكمية OMV الحرة في العدوى في المختبر الضامة الإنسان بعد 24 ساعة من الحضانة (كما هو موضح في مرجع 20). لتحفيز خلايا المستفيدة الأخرى أو في التجارب المجراة،قد تكون جرعات OMV أخرى ضرورية ويجب أن تنشأ. تحليل تأثير L. المستروحة OMVS يمثل التقدم للبروتوكول وصفها جاجر وشتاينرت 24.

هنا، سلطة النقد الفلسطينية المتباينة THP-1 خلايا بمثابة نموذج لالضامة السنخية بسبب قلة توافر المواد البشرية الأساسية. إضافة سلطة النقد الفلسطينية تفرق في الوحيدات THP-1 الخلايا إلى خلايا تشبه البلاعم 25. وعلاوة على ذلك، فهي معروفة خط الخلية نموذج للام المستروحة يدرس 26. وإلى جانب هذا الخط خلية الوحيدات الإنسان، وتستخدم خلايا mBMDM. تحظى بقبول واسع mBMDM لدراسة آثار L. المستروحة 27، 28، 29. إمكانية استخدام بالضربة القاضية الجينية لTLRs مختلفة أو غيرها من البروتينات جعلها أداة قيمة لدراسة آثار OMV. في أوردإيه لخفض كمية من الفئران في التجربة، وتستخدم mBMDM بدلا من البلاعم السنخية بسبب القيود المفروضة على الضامة. قد يتطلب التجارب الرئيسية الضامة السنخية للمصادقة.

وبالإضافة إلى بروتوكول الموصوفة هنا لتنبيذ فائق لتنقية OMVS، فمن الممكن لإجراء الطرد المركزي التدرج الكثافة، والتي يتم تضمينها في البروتوكول من قبل Chutkan وآخرون. 30. هذا يمكن أن تحسن نقاء إعداد OMV التي تم الحصول عليها وتقليل كمية-تنقية شارك المجاميع البروتين، فلاجيلين، وLPS. نقاء إعداد OMV التي تم الحصول عليها يمكن تحليلها بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ أو عن طريق تحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر كخطوة تكميلية في مراقبة الجودة. هذا يمكن أن توفر وسيلة إضافية للالكمي، ما وراء إجراء قياس البروتين المقدمة هنا. اختياريا، وتركيز LPS يمكن تحليلها من خلال اختبار المحللة الليمول خلية أميبية الشكل. إذا كان العائد OMV منخفض، وهوخطوة تركيز إضافية عبر مرشحات الطرد المركزي يمكن أن يؤديها، والذي لم يحدث هنا. إذا كان العائد أقل من المتوقع، وتجاهل OMVS.

وكجزء من الجهود الجارية لتوضيح الآليات والوظائف البيولوجية وراء OMVS، يمكن اختبار تأثير ظروف الإجهاد المختلفة على إنتاج أو.ام.في. الحرمان من المواد الغذائية، والتغيرات في درجات الحرارة الحضانة، أو التعرض لعوامل ضارة قد يكون لها تأثير على OMV إفراز 31. وتناقش ظروف الإجهاد ممكنة في البروتوكول من قبل Klimentova وStulik 32. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تتولد فرط أو hypovesiculating L. المسوخ المستروحة. ويمكن بعد ذلك بتحليل الاستعدادات OMV مختلفة في التجارب الإصابة الضامة، إإكسبلنتس أنسجة الرئة الإنسان (وصفه في مرجع 17)، أو حتى في النماذج في الجسم الحي. وإلى جانب دور OMVS في إشارات المناعية الفطرية، نفوذهم في الاتصال البكتيرييمكن معالجتها بشكل تجريبي. وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل تأثير مختلف أجهزة الطرد المركزي إشارات المناعية الفطرية عن طريق استخدام خلايا خروج المغلوب الفئران أو توليد كريسبر بالضربة القاضية / Cas9 في خطوط الخلايا البشرية. وهذه البحوث الأساسية في OMVS يساعد في وضع استراتيجيات لقاح الجديدة، والتي توجد بالفعل لالتهاب السحايا B ينتقل عن طريق إلتهاب السحايا النيسيري 33.

بدءا من بروتوكول بشأن العزلة OMV والتوصيف، يمكن للمرء أن تطبيق هذا إلى غيرها من البكتيريا سالبة الجرام والخلايا المضيفة الأخرى؛ فإنه يحتاج فقط إلى تعديل لنمو البكتيريا في الثقافة السائل. ونشرت من قبل Chutkan آخرون البروتوكول. يوفر معلومات مفصلة عن توليد OMVS من الإشريكية القولونية والزائفة الزنجارية 30. يجب الثقافة لا تصل إلى مرحلة ثابتة في وقت متأخر من أجل تجنب الزيادات في البكتيريا هي lysed والبروتينات تلويث وذاكرةالأغشية. بالإضافة إلى ذلك، فإن الجرعة OMV تستخدم لتنشيط الخلايا المضيفة يجب أن يتم تحديدها وفقا لكمية من OMVS حاضرا أثناء الالتهابات في الجسم الحي، في حين لا يزال ضمان انخفاض معدل السمية الخلوية. وبهذه الطريقة، ودور المرضية من OMVS، يمكن دراسة تأثيرها على التواصل بين الأنواع، والتفاعلات المضيف الممرض.

لمزيد من الدراسة دور L. المستروحة OMVS في الالتهاب الرئوي، وهناك حاجة الاستعدادات OMV موحدة مع عوائد كافية وتجارب العدوى قابلة للمقارنة. وهذا البروتوكول يساعد على توحيد إجراءات العزل وتوسيع نطاق الدراسات OMV للبكتيريا سالبة الجرام الأخرى وإلى الخلايا المضيفة الأخرى. وعلاوة على ذلك، سوف تستفيد البحوث من التفصيل في معرفة المختبر، والتي يمكن استخدامها لتوسيع التجارب إلى الإعدادات في الجسم الحي. في المستقبل، يمكن تمديد هذا البروتوكول إلى عزل OMVS من المواد البيولوجية الأساسية، مثل المصل أو LAV الشعبىالسائل العمر، لاكتساب نظرة ثاقبة تكوين OMVS صدر في ظل الظروف الفسيولوجية. وهذا سوف يساعد على تحديد المعايير الأساسية لتكوين OMV وفهم خصائص في المختبر OMVS -generated.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الأستاذ الدكتور ماركوس Schnare لتزويدنا TLR2 - / - وTLR2 / 4 - / - الفئران والأستاذ الدكتور كارستن Kirschning لTRIF / MyD88 - / - الفئران. وقد تم تمويل أجزاء من هذا العمل Bundesministerium FÜR بيلدنج اوند Forschung (ه: miRSys الحيوي - FKZ 0316175B، ه: ميد CAPSYS - FKZ 01X1304E، http://www.bmbf.de/)، الألمانية للبحوث (SFB / TR-84. http://www.sfb-tr84.de/)، وHessisches Ministerium FÜR Wissenschaft اوند كونست (LOEWE RNomics الطبية - FKZ 519/03 / 00.001- (0003)، http://www.proloewe.de/medicalrnomics)، كل لBS.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق بتري 10 سمSarstedt AG & شركة KG (نومبرشت ، ألمانيا)82.1473
70 Ti rotorBeckman Coulter Incorporation (كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)337922
ACESCarl Roth GmbH & amp Co KG (كارلسروه ، ألمانيا)9138.2
الفحم المنشطCarl Roth GmbH & شركة KG (كارلسروه ، ألمانيا)X865.2
أجار أجار ، كوبي الأولCarl Roth GmbH & Co KG (كارلسروه ، ألمانيا)5210.2
كولومبيا أجار مع 5٪ من دم الأغنامBecton Dickinson GmbH (هايدلبرغ ، ألمانيا)254005
كوفيتSarstedt AG & amp Co KG (Nuembrecht ، ألمانيا)67.742
ELISA (الإنسان) BDOptEIA™; Becton Dickinson GmbH (هايدلبرغ ، ألمانيا)IL-8: 555244 IL-6: 550799
ELISA (مورين)DuoSet ، R & D (مينيابوليس ، الولايات المتحدة الأمريكية)CXCL1: DY453-05
Fe (NO3< / sub>) 3< / sub>x9H 2< / sub>OCarl Roth GmbH & amp Co KG (كارلسروه ، ألمانيا)5632.1
مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) LifeTechnologies GmbH (دارمشتات ، ألمانيا)10270-106
Heracell 240i CO2< / sub> حاضنةThermo Fisher Scientific Germany BV & شركة KG (براونشفايغ ، ألمانيا)40830469
Heraeus Multifuge X3RThermo Fisher Scientific Germany BV & amp Co KG (Braunschweig ، ألمانيا)75004515
التلقيح  Sarstedt AG & شركة KG (نومبرخت ، ألمانيا)86.1567.010
KOHCarl Roth GmbH & amp Co KG (كارلسروه ، ألمانيا)6751.1
L. pneumophila< / em> Corby------يرجى تقديم البروفيسور الدكتور Antje Flieger (RKI ، برلين ، ألمانيا)
L. pneumophila< / em> Corby & Delta; flaA------مقدمة من البروفيسور الدكتور كلاوس هونر (RKI ، برلين ، ألمانيا)
L-cysteinCarl Roth GmbH & amp Co KG (كارلسروه ، ألمانيا)
mBMDM------مقدم من البروفيسور الدكتور ماركوس شنار (جامعة فيليبس ماربورغ ، ماربورغ ، ألمانيا) والبروفيسور الدكتور كارستن كيرشنينج (جامعة دويسبورغ إيسن ، إيسن ، ألمانيا) PBS
Biochrom GmbH (برلين ، ألمانيا)L 1825
phorbol 12-myrristate 13-acetateSigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen ، ألمانيا)P8139-1MG
شاكر دوار (MaxQ 6000) ثيرموفيشر ساينتفيك ألمانيا BV & شركة KG (براونشفايغ ، ألمانيا)SHKE6000
RPMI 1640 High GlucoseLife Technologies GmbH (دارمشتات ، ألمانيا)11875-093
سابونينكارل روث GmbH & Co KG (كارلسروه ، ألمانيا)9622.1
Ultrospec 10Biochrom Ltd (كامبريدج ، إنجلترا)80-2116-30
مرشح معقم (حجم المسام: 0.22 & micro ؛ م)Corning Incorporated (نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية)431096
THP-1Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen ، ألمانيا)88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SEThermo Fisher Scientific Germany BV & amp Co KG (براونشفايغ ، ألمانيا)
مستخلص الخميرةCarl Roth GmbH & Co KG (كارلسروه ، ألمانيا)2363.2
مجموعة فحص البروتين بيرس BCAThermo Fisher Scientific Germany BV & شركة KG (براونشفايغ ، ألمانيا)23225
حلقة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Recognition and delivery of effector proteins into eukaryotic cells by bacterial secretion systems. Traffic. 7 (8), 929-939 (2006).">Cambronne, E. D., Roy, C. R. Recognition and delivery of effector proteins into eukaryotic cells by bacterial secretion systems. Traffic. 7 (8), 929-939 (2006).
  2. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (1), 81-94 (2010).">Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (1), 81-94 (2010).
  3. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. J Bacteriol. 181 (16), 4725-4733 (1999).">Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. J Bacteriol. 181 (16), 4725-4733 (1999).
  4. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes Dev. 19 (22), 2645-2655 (2005).">Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes Dev. 19 (22), 2645-2655 (2005).
  5. Role of dentilisin in Treponema denticola epithelial cell layer penetration. Res Microbiol. 154 (9), 637-643 (2003).">Chi, B., Qi, M., Kuramitsu, H. K. Role of dentilisin in Treponema denticola epithelial cell layer penetration. Res Microbiol. 154 (9), 637-643 (2003).
  6. Export of virulence genes and Shiga toxin by membrane vesicles of Escherichia coli O157:H7. Appl Environ Microbiol. 65 (5), 1843-1848 (1999).">Kolling, G. L., Matthews, K. R. Export of virulence genes and Shiga toxin by membrane vesicles of Escherichia coli O157:H7. Appl Environ Microbiol. 65 (5), 1843-1848 (1999).
  7. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. J Biol Chem. 275 (17), 12489-12496 (2000).">Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. J Biol Chem. 275 (17), 12489-12496 (2000).
  8. Immune capture and detection of Borrelia burgdorferi antigens in urine, blood, or tissues from infected ticks, mice, dogs, and humans. J Clin Microbiol. 29 (6), 1162-1170 (1991).">Dorward, D. W., Schwan, T. G., Garon, C. F. Immune capture and detection of Borrelia burgdorferi antigens in urine, blood, or tissues from infected ticks, mice, dogs, and humans. J Clin Microbiol. 29 (6), 1162-1170 (1991).
  9. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).">Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).
  10. Enterotoxigenic Escherichia coli vesicles target toxin delivery into mammalian cells. EMBO J. 23 (23), 4538-4549 (2004).">Kesty, N. C., Mason, K. M., Reedy, M., Miller, S. E., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli vesicles target toxin delivery into mammalian cells. EMBO J. 23 (23), 4538-4549 (2004).
  11. Invasion of protozoa by Legionella pneumophila and its role in bacterial ecology and pathogenesis. Appl Environ Microbiol. 64, 3127-3133 (1998).">Abu Kwaik, Y., Gao, L. Y., Stone, B. J., Venkataraman, C., Harb, O. S. Invasion of protozoa by Legionella pneumophila and its role in bacterial ecology and pathogenesis. Appl Environ Microbiol. 64, 3127-3133 (1998).
  12. The pathology of the Legionella pneumonias. A review of 74 cases and the literature. Hum Pathol. 12 (5), 401-422 (1981).">Winn, W. C., Myerowitz, R. L. The pathology of the Legionella pneumonias. A review of 74 cases and the literature. Hum Pathol. 12 (5), 401-422 (1981).
  13. Manipulation of host vesicular trafficking and innate immune defence by Legionella Dot/Icm effectors. Cell Microbiol. 13 (12), 1870-1880 (2011).">Ge, J., Shao, F. Manipulation of host vesicular trafficking and innate immune defence by Legionella Dot/Icm effectors. Cell Microbiol. 13 (12), 1870-1880 (2011).
  14. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 261-283 (2010).">Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 261-283 (2010).
  15. Membrane vesicles shed by Legionella pneumophila inhibit fusion of phagosomes with lysosomes. Infect Immun. 74 (6), 3285-3295 (2006).">Fernandez-Moreira, E., Helbig, J. H., Swanson, M. S. Membrane vesicles shed by Legionella pneumophila inhibit fusion of phagosomes with lysosomes. Infect Immun. 74 (6), 3285-3295 (2006).
  16. Proteomic characterization of the whole secretome of Legionella pneumophila and functional analysis of outer membrane vesicles. Infect Immun. 76 (5), 1825-1836 (2008).">Galka, F., et al. Proteomic characterization of the whole secretome of Legionella pneumophila and functional analysis of outer membrane vesicles. Infect Immun. 76 (5), 1825-1836 (2008).
  17. Human lung tissue explants reveal novel interactions during Legionella pneumophila infections. Infect Immun. 82 (1), 275-285 (2014).">Jager, J., et al. Human lung tissue explants reveal novel interactions during Legionella pneumophila infections. Infect Immun. 82 (1), 275-285 (2014).
  18. Naturally produced outer membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa elicit a potent innate immune response via combined sensing of both lipopolysaccharide and protein components. Infect Immun. 78 (9), 3822-3831 (2010).">Ellis, T. N., Leiman, S. A., Kuehn, M. J. Naturally produced outer membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa elicit a potent innate immune response via combined sensing of both lipopolysaccharide and protein components. Infect Immun. 78 (9), 3822-3831 (2010).
  19. Fusion of Legionella pneumophila outer membrane vesicles with eukaryotic membrane systems is a mechanism to deliver pathogen factors to host cell membranes. Cell Microbiol. , (2014).">Jager, J., Keese, S., Roessle, M., Steinert, M., Schromm, A. B. Fusion of Legionella pneumophila outer membrane vesicles with eukaryotic membrane systems is a mechanism to deliver pathogen factors to host cell membranes. Cell Microbiol. , (2014).
  20. Legionella pneumophila-Derived Outer Membrane Vesicles Promote Bacterial Replication in Macrophages. PLoS Pathog. 12 (4), (2016).">Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila-Derived Outer Membrane Vesicles Promote Bacterial Replication in Macrophages. PLoS Pathog. 12 (4), (2016).
  21. Membrane vesicles of Clostridium perfringens type A strains induce innate and adaptive immunity. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 431-443 (2014).">Jiang, Y., Kong, Q., Roland, K. L., Curtiss, R. Membrane vesicles of Clostridium perfringens type A strains induce innate and adaptive immunity. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 431-443 (2014).
  22. Specific and nonspecific responses of murine B cells to membrane blebs of Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 61 (4), 1460-1467 (1993).">Whitmire, W. M., Garon, C. F. Specific and nonspecific responses of murine B cells to membrane blebs of Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 61 (4), 1460-1467 (1993).
  23. Helicobacter pylori outer membrane vesicles modulate proliferation and interleukin-8 production by gastric epithelial cells. Infect Immun. 71 (10), 5670-5675 (2003).">Ismail, S., Hampton, M. B., Keenan, J. I. Helicobacter pylori outer membrane vesicles modulate proliferation and interleukin-8 production by gastric epithelial cells. Infect Immun. 71 (10), 5670-5675 (2003).
  24. Enrichment of outer membrane vesicles shed by Legionella pneumophila. Methods Mol Biol. 954, 225-230 (2013).">Jager, J., Steinert, M. Enrichment of outer membrane vesicles shed by Legionella pneumophila. Methods Mol Biol. 954, 225-230 (2013).
  25. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).">Park, E. K., et al. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
  26. Human caspase-4 mediates noncanonical inflammasome activation against gram-negative bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6688-6693 (2015).">Casson, C. N., et al. Human caspase-4 mediates noncanonical inflammasome activation against gram-negative bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6688-6693 (2015).
  27. Components of the Legionella pneumophila flagellar regulon contribute to multiple virulence traits, including lysosome avoidance and macrophage death. Infect Immun. 73 (9), 5720-5734 (2005).">Molofsky, A. B., Shetron-Rama, L. M., Swanson, M. S. Components of the Legionella pneumophila flagellar regulon contribute to multiple virulence traits, including lysosome avoidance and macrophage death. Infect Immun. 73 (9), 5720-5734 (2005).
  28. MavN is a Legionella pneumophila vacuole-associated protein required for efficient iron acquisition during intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (37), 5208-5217 (2015).">Isaac, D. T., Laguna, R. K., Valtz, N., Isberg, R. R. MavN is a Legionella pneumophila vacuole-associated protein required for efficient iron acquisition during intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (37), 5208-5217 (2015).
  29. Sensing cytosolic RpsL by macrophages induces lysosomal cell death and termination of bacterial infection. PLoS Pathog. 11 (3), 1004704(2015).">Zhu, W., et al. Sensing cytosolic RpsL by macrophages induces lysosomal cell death and termination of bacterial infection. PLoS Pathog. 11 (3), 1004704(2015).
  30. Quantitative and qualitative preparations of bacterial outer membrane vesicles. Methods Mol Biol. 966, 259-272 (2013).">Chutkan, H., Macdonald, I., Manning, A., Kuehn, M. J. Quantitative and qualitative preparations of bacterial outer membrane vesicles. Methods Mol Biol. 966, 259-272 (2013).
  31. Stress-induced outer membrane vesicle production by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 195 (13), 2971-2981 (2013).">Macdonald, I. A., Kuehn, M. J. Stress-induced outer membrane vesicle production by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 195 (13), 2971-2981 (2013).
  32. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiol Res. 170, 1-9 (2015).">Klimentova, J., Stulik, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiol Res. 170, 1-9 (2015).
  33. https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause (2016).">Novartis.com. , Available from: https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause (2016).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة