يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الكشف عن المشترك بين الكروموسومات الزيغ مستقرة من قبل الإسفار متعددة

9.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55162

⸱

يناير 11, 2017

 ,  , 
1Division of Radiation Health, Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Environmental Health, Fay W. Boozman School of Public Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Surgical Service, Central Arkansas Veterans Healthcare System

في هذه المقالة

ملخص

يصف البروتوكول الحالي فائدة التهجين المضاق المتعدد في الموقع (mFISH) والتنميط النووي الطيفي (SKY) في تحديد الانحرافات المستقرة بين الكروموسومات في خلايا نخاع العظام للفئران بعد التعرض للإشعاع الكلي للجسم.

الملخص

الإشعاع المؤين (IR) يحفز العديد من الانحرافات الكروموسومية المستقرة وغير المستقرة. يمكن بسهولة تحديد الانحرافات غير المستقرة ، حيث يتعرض مورفولوجيا الكروموسوم للخطر بشكل كبير ، من خلال تقنيات تلطيخ الكروموسومات التقليدية. ومع ذلك ، فإن الكشف عن الانحرافات المستقرة ، والتي تنطوي على تبادل أو نقل المواد الوراثية دون تعديل كبير في مورفولوجيا الكروموسوم ، يتطلب تقنيات طلاء كروموسومات متطورة تعتمد على التهجين في الموقع لمسبارات الحمض النووي المسماة بالفلورسنت ، وهي تقنية طلاء كروموسوم تعرف شعبيا باسم التألق في الموقع التهجين (FISH). يمكن أن تكون مجسات FISH محددة للكروموسوم / الكروموسومات الكاملة أو منطقة فرعية دقيقة على الكروموسوم/الكروموسوم. لا تسمح الطريقة بتصور الانحرافات المستقرة فحسب ، بل يمكنها أيضا الكشف عن الكروموسوم / الكروموسوم أو تسلسل / تسلسل الحمض النووي المحدد المتورط في تكوين انحراف معين. تتوفر مجموعة متنوعة من تقنيات طلاء الكروموسوم في علم الوراثة الخلوية. هنا تتم مناقشة طريقتين شديدتي الحساسية ، التهجين المتعدد في الموقع (mFISH) والتنميط النووي الطيفي (SKY) ، لتحديد الانحرافات المستقرة بين الكروموسومات التي تتشكل في خلايا نخاع العظام للفئران بعد التعرض للإشعاع الكلي للجسم. على الرغم من أن كلتا التقنيتين تعتمدان على مجسات الحمض النووي المسمى بالفلورسنت ، إلا أن طريقة الكشف وعملية الحصول على الصور لإشارات الفلورسنت مختلفة. تم استخدام هاتين التقنيتين في مجالات بحثية مختلفة ، مثل بيولوجيا الإشعاع ، وعلم الوراثة الخلوية للسرطان ، وقياس الجرعات الحيوية للإشعاع بأثر رجعي ، وعلم الوراثة الخلوية السريري ، وعلم الوراثة الخلوية التطوري ، وعلم الوراثة الخلوية المقارن.

المقدمة

الطريقتان الأكثر موثوقية لتحديد الانحرافات المستقرة بين الكروموسومات الناجمة عن الإشعاع هما التهجين الموضعي المتعدد (mFISH) ، والذي يسمح بطلاء كروموسومين أو أكثر في وقت واحد ، والتنميط النووي الطيفي (SKY) ، الذي يضفي لونا مميزا على كل زوج كروموسومات متماثلة في الجينوم. على عكس الانحرافات غير المستقرة ، فإن الانحرافات المستقرة مستمرة بطبيعتها ويمكن أن تنتشر لعدة أجيال في المجموعات السكانية المشععة1 ، وتعتبر "توقيعات" جزيئية حرجة للآفات الوراثية الخلوية التي يسببهاالإشعاع 2. أظهرت الدراسات التي أجرتها مجموعات مختلفة أن الانحرافات المستقرة مرتبطة بالتسبب في عدد من الأمراض وتطورها ، بما في ذلك السرطان3. قبل عصر طلاء الكروموسوم (يشار إليه أيضا باسم علم الوراثة الخلوية الجزيئي) ، كانت تقنية G-banding التقليدية هي الطريقة الوحيدة للكشف عن الانحرافات الكروموسومية المستقرة. ومع ذلك ، فإن نطاقات الكروموسومات تمثل تحديا لعلماء الوراثة الخلوية لأن الدقة محدودة ، وقابلية التكاثر غير مؤكدة ، وهي إجراء كثيف العمالة ، ويتطلب علماء الوراثة الخلوية ذوي المهارات العالية والخبرة لتفسير موثوق للبيانات4. علاوة على ذلك ، لا تسمح تقنية النطاقات الكلاسيكية بالكشف عن إعادة ترتيب الكروموسومات المعقدة ، والتي تنطوي على تفاعل ثلاثة فواصل أو أكثر موزعة بين كروموسومين أو أكثر ، وهي نتيجة شائعة للتلف الإشعاعي. قد تستمر الانحرافات المعقدة لدى الأفراد بعد سنوات عديدة من التعرض للإشعاع ، مما يجعلها مفيدة لقياس الجرعات الحيويةبأثر رجعي 5. لذلك ، كان هناك حاجة إلى نهج بديل للتغلب على قيود تقنيات النطاقات التقليدية للكشف عن إعادة ترتيب الكروموسومات المستقرة.

في أواخر الستينيات ، بدأ العمل الرائد ل Gal and Pardue (1969) على التهجين الجزيئي باستخدام مجسات الحمض النووي المصنفة بالمواد المشعة حقبة جديدة في مجال علم الوراثة الخلوية ، مما سمح بالكشف عن تسلسل DNA محدد على الكروموسومات6. ومع ذلك ، فإن استخدام المجسات المشعة للتهجين الجزيئي كان له العديد من العيوب: المجسات المشعة غير مستقرة نسبيا ، ويعتمد نشاط المسبار على التحلل الإشعاعي للنظير المستخدم ، والتهجين يستغرق وقتا أطول ، والدقة محدودة ، والمجسات مكلفة نسبيا ، والمواد المشعة تشكل خطرا على الصحة. وبالتالي ، أصبح من الضروري تطوير وتصميم مجسات غير مشعة. تغلب إدخال مجسات الحمض النووي الموسومة بالفلورسنت في الثمانينيات والتسعينيات على قيود المجسات المشعة وعزز بشكل كبير سلامة وحساسية وخصوصية تقنية التهجين7-10. تؤدي مجسات الفلورسنت إلى ظهور إشارات ساطعة للغاية عند ملاحظتها تحت مجاهر مضان مجهزة بمرشحات الإثارة والانبعاث المناسبة. يمكن التعرف بسهولة على أي خسارة أو كسب أو إعادة ترتيب للكروموسوم / الكروموسوم المسمى بالفلورسنت أو جزء من الكروموسوم باستخدام تقنية FISH هذه.

أدى

تحليل الانحرافات الكروموسومية بواسطة طلاء FISH إلى تقدم ملحوظ في أبحاث الوراثة الخلوية على مر السنين. أدى تصميم مجسات مصنفة بالفلورسنت لتطبيقات محددة تتراوح من المجسات الخاصة بالموضع إلى مجسات طلاء الكروموسوم بالكامل إلى تطوير المجال بشكل كبير. وقد سهل هذا أيضا اكتشاف إعادة الترتيب تحت المجهري ("الخفي") ، والتي لم تكن ممكنة من خلال نطاقات الكروموسوم التقليدية. أثبتت لوحة الكروموسوم بواسطة mFISH و SKY أنها أدوات قيمة لتحديد عمليات إعادة الترتيب البسيطة والمعقدة بين الكروموسومات. المبادئ الأساسية لكلتا التقنيتين متشابهة ، لكن طريقة الكشف عن إشارة الفلورسنت وتمييزها بعد التهجين في الموقع وعملية الحصول على الصور مختلفة. في mFISH ، يتم التقاط صور منفصلة لكل من الفلوروكرومات الأربعة باستخدام مرشحات مجهر ممر النطاق الضيق. ثم يتم استخدام برنامج مخصص لدمج الصور. أثناء وجودك في SKY ، يعتمد الحصول على الصورة على مزيج من الفحص المجهري الفائفلوري ، وتصوير الجهاز المقترن بالشحنة ، والتحليل الطيفي فورييه ، والذي يسمح بقياس طيف الانبعاث بأكمله مع تعريض واحد في جميع نقاط الصورة. في كل من mFISH و SKY ، يتم التقاط الصور أحادية اللون بشكل مستقل ، ثم دمجها ، وأخيرا ، يتم تعيين ألوان زائفة فريدة للكروموسومات في صور أحادية اللون بناء على الصبغة المحددة المرتبطة بكل مسبار فلوروكروم.

مساهمة تحليل mFISH و SKY في مجال بيولوجيا الإشعاع رائعة ، لا سيما بالنسبة لتقدير الجرعة بأثر رجعي للتعرض البشري للأشعة تحت الحمراء (قياس الجرعات الحيوية للإشعاع) 11-14 ، وتقييم مخاطر التسرطن الإشعاعي15 ، بالإضافة إلى الكشف عن السرطان الثانوي المرتبط بالعلاج الإشعاعي وتقديره16. أظهرت دراسة حديثة أجريت على الفئران أن تقنية طلاء الكروموسوم القائمة على FISH هي أيضا أداة مهمة لتقييم فعالية الإجراء المضاد للإشعاع17. في هذه الدراسة ، تم إثبات تأثير التعرض لإشعاع الجسم الكلي على تحريض انحرافات كروموسومية مستقرة في خلايا نخاع العظام للفئران باستخدام تقنيات mFISH و SKY.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقا صارم مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وتمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة أركنساس للعلوم الطبية. تم إيواء جميع الحيوانات تحت منشأة الحيوان القياسية مكيفة الهواء في 20 ± 2 درجة مئوية مع 10-15 دورات ساعة من الهواء النقي وحرية الوصول إلى المواد الغذائية القوارض القياسية والمياه. ولدى وصوله، عقدت الفئران في الحجر الصحي لمدة 1 أسبوع، وقدم شهادة طعام القوارض.

التعرض 1.Radiation وفي فيفو اعتقال خلايا الطورية

  1. الفئران فضح برنامج الأمم المتحدة للتخدير إلى 2 غراي إشعاع كامل الجسم في غرفة التشعيع. خلال التشعيع والفئران مكان في الغرفة عقد جيد التهوية للتأكد من أنها لا تتحرك بحرية والحصول على جرعة موحدة.
  2. ضخ 100 ميكرولتر من 0.05٪ محلول الكولشيسين (جمسحوق olchicine الذائبة في الكالسيوم والمغنيسيوم خالية PBS) البريتونى باستخدام إبرة 25 G المرفقة مع 1 مل حقنة واحدة. تجنب حقن مباشرة في أي جهاز.
  3. ترك الحيوان في قفص لمدة 2 ساعة قبل الحصاد خلية نخاع العظام. مراقبة الحيوانات لأي علامات الألم أو الضيق.

2. نخاع العظم خلية الحصاد وعزل خلايا نخاع العظم وحيدات النوى التي كتبها التدرج الكثافة الطرد المركزي

  1. الموت ببطء الماوس عن طريق CO 2 الخنق.
  2. رذاذ الايثانول 70٪ على ظهري وبطني الجانب.
  3. جعل شق 2 سم على جلد البطن مع مقص حاد. فهم الجلد على جانبي الشق مع ملاقط حادة وسحب بلطف فتح عضلات البطن.
  4. قطع كل من رجليه الخلفيتين مع مقص والمكان على الفور لهم في قبل المبردة برنامج تلفزيوني مع 4٪ FBS.
  5. بعناية تنظيف جميع العضلات التي تعلق على أطرافه الخلفية مع حادة razorblade والشاش والقطن ضمادة.
  6. فصل الساق من عظم الفخذ. تقليم كل من النصائح من كل العظام مع razorblade.
  7. مسح محتويات نخاع العظام مع 3 مل برنامج تلفزيوني (مع 4٪ FBS) باستخدام إبرة 23 G تعلق على حقنة مل 3 وجمع المحتوى في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تمرير تعليق الخلية لا يقل عن 10 مرات من خلال إبرة لجعل التعليق خلية واحدة.
  8. بعناية تراكب تعليق الخلية على حجم مساو من متوسطة فصل الخلايا اللمفاوية (3 مل) من دون إزعاج واجهة بين تعليق خلية والمتوسطة فصل الخلايا اللمفاوية. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. جمع معطف الشهباء بعناية من دون إزعاج طبقات ونقل أخرى في 15 أنبوب جديد للطرد المركزي مل.

3. إعداد ينتشر خلية الطورية

  1. إضافة 10 مل PBS إلى الأنبوب الذي يحتوي على معطف الشهباء.
  2. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة بعناية طاف. ثم تفريق رانه الخلية بيليه مع التنصت لطيف وإضافة 10 مل برنامج تلفزيوني.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. إزالة طاف دون الإخلال بيليه الخلية، تفريق بيليه، وإضافة 4 مل من محلول كلوريد البوتاسيوم 0.075 M منخفض التوتر قبل تحسنت. إضافة قطرة محلول منخفض التوتر قطرة مع الهز المستمر لطيف.
  6. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  7. بعد العلاج ناقص التوتر، إضافة حجم مساو (4 مل) من تثبيتي (الميثانول: حمض الخليك الجليدي، 3: 1 ت / ت) في أنبوب 15 مل وتخلط بلطف بواسطة أنبوب للقلب.
  8. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف.
  9. تفريق بيليه الخلية مع البزل تليها دوامة طيف لبضع ثوان، وإضافة 3 مل من تثبيتي انخفاض حل قطرة مع الهز المستمر.
  10. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
  11. إزالة طاف وتفتيت الخلية بيليه مع جنتلو التنصت، وإضافة 3 مل مثبت الطازجة.
  12. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف. تفريق بيليه الخلية مع التنصت لطيف، وإضافة جديدة 3 مل مثبت.
  13. كرر الخطوة 3.12 مرتين أكثر.
  14. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف دون الإخلال بيليه الخلية. ثم إضافة 400-600 ميكرولتر تثبيتي، وتخلط جيدا مع pipetting ل.
  15. إسقاط 30 ميكرولتر خلايا ثابتة على الشرائح قبل تنظيفها والرطب يميل بزاوية 45 درجة، والسماح للشرائح في الهواء الجاف تماما بين عشية وضحاها.

4. ماوس كروموسوم الطلاء بواسطة mFISH

  1. كروموسوم تمسخ
    1. ضع الشريحة التي تحتوي على هوامش خلية الطورية في 2X SSC لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. يذوى الشرائح عن طريق غسل الايثانول التسلسلي لمدة 2 دقيقة لكل منهما في 70٪، 80٪، و 100٪. احتضان لمدة 60 دقيقة عند 65 درجة مئوية.
    3. سخن 40 مل تمسخ الحل (70٪ الفورماميد / 2X SSجيم؛ درجة الحموضة 7.0) إلى 70 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية) في جرة Coplin زجاج لمدة 30 دقيقة. تفسد الكروموسومات التي يحتضنها الشريحة في حل تمسخ قبل تحسنت 1 - 1.5 دقيقة.
    4. إخماد الانزلاق على الفور في الجليد الباردة الايثانول 70٪ لمدة 2 دقيقة لوقف عملية تمسخ، وكذلك لمنع الكروموسومات التشويه والتحريف من إعادة الصلب. ثم جفف عن طريق الغسيل مع 80٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة. تكرار غسل الإيثانول مع الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة. تماما تجف الشريحة في درجة حرارة الغرفة.
  2. تمسخ وتهجين دقق خليط
    1. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة الخليط التحقيق الموردة من قبل الشركة المصنعة، ونقل 10 ميكرولتر من خليط التحقيق في 500 ميكرولتر المفاجئة غطاء أنبوب الطرد المركزي، وتفسد من الحضانة عند 80 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية) في حمام مائي لمدة 7 دقائق.
    2. وضع أنبوب الطرد المركزي مع خليط التحقيق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    3. ضعي الخليط التحقيق التشويه والتحريف على الشريحة مع chromoso التشويه والتحريفزارة التربية والعلم.
    4. تغطية بعناية المنطقة مع 18 مم × 18 مم غطاء زجاجي زلة والقضاء على أي فقاعات الهواء مرئية عن طريق الضغط بلطف جدا زلة غطاء على الشريحة. اغلاق جميع الجوانب الأربعة من زلة غطاء مع الاسمنت والمطاط واحتضان لمدة 12 ساعة إلى 16 ساعة في الظلام عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب لتهجين.
  3. آخر التهجين الغسيل وكشف
    1. إزالة بعناية الاسمنت والمطاط وانزلاق الغطاء.
    2. الشرائح مكان في SSC 0.4x قبل تحسنت في 74 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
    3. غسل الشريحة في غسل حل ثانيا (4X SSC / 0.1٪ توين 20) لمدة 2 دقيقة.
    4. ضع 20 ميكرولتر من مكافحة تتلاشى المتوسطة المتزايدة مع دابي مباين (1.5 ميكروغرام / مل)، وتغطي مع ساترة الزجاج. اضغط برفق على ساترة مع الأنسجة مختبر لإزالة فقاعات الهواء وحل تصاعد الزائد. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر.
    5. عرض الشرائح باستخدام المجهر الفلورسنت مزودة بمرشحات المناسبة.

5. الطيفي تنميط نووي (سكاى) من الكروموسومات ماوس

  1. كروموسوم والتحقيق تمسخ
    1. يوازن الشرائح في 2X SSC في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة، دون أن تهتز.
    2. يذوى الشرائح في سلسلة الايثانول (70٪، 80٪، والإيثانول بنسبة 100٪) لمدة 2 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. الهواء الجاف الشريحة لإزالة الايثانول تماما.
    3. دافئ 40 مل من محلول تمسخ (70٪ الفورماميد / 2X SSC، 7.0 درجة الحموضة) في جرة Coplin زجاج لمدة 30 دقيقة.
    4. احتضان الشريحة في حل تمسخ قبل تحسنت ل 1 إلى 1.5 دقيقة.
    5. على الفور تزج الشريحة في الجليد الباردة الايثانول 70٪ لمدة 2 دقيقة لوقف عملية تمسخ، وكذلك لمنع الكروموسومات التشويه والتحريف من إعادة الصلب.
    6. يذوى الشرائح عن طريق وضعها في 80٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة ثم إلى 100٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    7. تفسد التحقيق SKY (قارورة رقم 1 التي توفرها الشركة المصنعة) في حمام مائي تعيين إلى 80 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية)لمدة 7 دقائق، ثم وضع على الفور في حمام مائي مجموعة مختلفة إلى 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  2. مسبار التهجين
    1. إضافة 10 ميكرولتر من التحقيق SKY التشويه والتحريف على الكروموسومات التشويه والتحريف.
    2. وضع بعناية على 18 ملم × 18 ملم ساترة الزجاج على التحقيق SKY بحيث محاصرون جود فقاعات الهواء تحت ساترة.
    3. ختم حواف ساترة مع الاسمنت والمطاط.
    4. ضع الشريحة في غرفة lightproof ترطيب واحتضان في الظلام عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة إلى 36 ساعة.
  3. الغسل بعد التهجين وكشف الإسفار
    1. إزالة الاسمنت والمطاط بعناية فائقة من دون إزعاج ساترة.
    2. ضع الشريحة في قبل تحسنت حل الغسيل السريع (0.4x SSC) عند 72 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق مع الهز المستمر. تزج الشريحة في غسل حل ثالثا (4X SSC / 0.1٪ توين 20)، واحتضان لمدة 1 دقيقة في حين تهتز.
    3. اختياري: إضافة 80 ميكرولتر من عرقلة كاشف(قارورة رقم 2 التي توفرها الشركة المصنعة) على مجال التهجين، ووضع 24 ملم × 60 ملم ساترة البلاستيك، واحتضان في الظلام عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في غرفة ترطيب.
    4. إزالة بلطف ساترة البلاستيك وغسل الشريحة مع ما قبل تحسنت (45 درجة مئوية) حل غسل الثالث لمدة 5 دقائق.
    5. تطبيق 80 ميكرولتر من Cy5 تلطيخ كاشف (قارورة رقم 3 التي توفرها الشركة المصنعة)، وضع 24 ملم × 60 ملم ساترة البلاستيك، واحتضان عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 40 دقيقة في غرفة ترطيب.
    6. تراجع الشريحة في وعاء زجاجي Coplin يحتوي قبل حرارة (45 درجة مئوية) غسل حل ثالثا (4X SSC / 0.1٪ توين 20)، واحتضان عند 45 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 2 دقيقة مع اهتزاز. كرر هذه الخطوة غسل 3 مرات.
    7. تطبيق 80 ميكرولتر من Cy5.5 تلطيخ كاشف (قارورة رقم 4 التي توفرها الشركة المصنعة)، وضع 24 ملم × 60 ملم ساترة البلاستيك، واحتضان عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 40 دقيقة في غرفة ترطيب.
    8. غسل الشريحة 3 مرات مع قبل حرارة (45 درجة مئوية) حل غسل الثالث.
    9. عقد الشريحة في موقف يميل ضد منشفة ورقية لتجفيف السوائل الزائدة. إضافة 20 ميكرولتر مكافحة تتلاشى دابي كاشف (قارورة رقم 5 المقدمة من قبل الشركة المصنعة) ووضع بعناية 24 ملم × 60 ملم ساترة الزجاج دون إدخال أي فقاعات الهواء. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر ونلاحظ مع المجهر epifluorescence مجهزة لالتقاط الصور SKY.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إجمالي إشعاع الجسم يدفع العديد من الانحرافات الكروموسومية في خلايا نخاع العظام من الفئران المعرضة للإشعاع. تم تحسين البروتوكول الحالي في الجسم الحي اعتقال الإنقسامية من خلايا نخاع العظام بعد التعرض للإشعاع، والحصاد من خلايا نخاع العظام من رجليه الخلفيتين من الفئران المعرضة للإشعاع وعزل خلايا نخاع العظام وحيدات النوى بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج، وإعداد ينتشر خلية الطورية، وبعدها الكشف عن التشوهات الكروموسومية مستقرة الإشعاع الناجم بوا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

العديد من الخطوات الهامة التي تحدد نجاح mFISH وSKY. الخطوة الأولى والأكثر أهمية هو لتحسين معاملة الكولشيسين في الجسم الحي اعتقال الإنقسامية من الخلايا وحيدة النواة نخاع العظام. تركيز الكولشيسين والعلاج الوقت بمفرده أو بالتنسيق تحديد مؤشر الإنقسامية وكذلك كروموسوم التكثيف اثنين من أهم الشروط الأساسية لوحة كروموسوم فعالة. وتركيز عال الكولشيسين أو أطول وقت العلاج يؤدي إلى الكروموسومات مكثفة للغاية، والتي تتنافى لتمسخ السليم والتهجين. وعلاوة على ذلك، وتحديد دقيق لإعادة ترتيب ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذه الدراسة من قبل أركنساس الفضاء منح اتحاد والمعهد القومي للبحوث الفضاء الطبية الحيوية من خلال الإدارة الوطنية للملاحة الجوية والفضاء، يمنح NNX15AK32A (RP) وRE03701 (MH-J)، وP20 GM109005 (MH-J)، وإدارة المحاربين القدامى في الولايات المتحدة ( MH-J). نشكر كريستوفر Fettes، منسق برنامج لإدارة البيئة والصحة المهنية في جامعة أركنساس للعلوم الطبية، للمساعدة التحريرية في إعداد المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فورماميدسيجما ألدريتش221198-100 مل
SSC Buffer 20 & مرة ؛ كاشفSigma-AldrichS6639-1L
للتصوير الطيفي المطبقبالفأرFPRPR0030 / M40
CAD - مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة المركزةالتصوير الطيفي المطبقFPRPR0033
الدهانات المفردة حسب الطلب - 3 ألوان ؛ كروموسوم الماوس 1: أحمر ، كروموسوم الفأر 2: أخضر ، كروموسوم الفأر 3: التصويرالطيفي المائي التطبيقيFPRPR0182/10
أغطية زجاجيةفيشر Scientific12-545B
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
حمض الهيدروكلوريك ، 37٪ ، Acros OrganicsFisher ScientificAC45055-0025   ؛
أطباق تلطيخ زجاج فيشربراند مع غطاء لولبيفيشر ساينتيك08-816
محلول كلوريد البوتاسيوم KaryoMAX لايف تكنولوجيز10575-090
شرائح مجهر فيشر سوبرفروست بلسفيشر ساینتفيك12-550-15
مسحوق كولسيميدفيشر ساینتفيك50-464-757 
Histopaque-1083 سيجما ألدريتش10831
شيبرد مارك الأول ، موديل 25 < سوب > 137 < / sup> Cs irradiatorJL Shepherd & amp أسوشيتسموديل 484B
حقنة 1 ملBD Biosciences647911
الكحول الإيثيلي ، 200 برهانفيشر ScientificMEX02761
PBS ، (1x PBS Liq.) ، بدون الكالسيوم والمغنيسيومفيشر ScientificICN1860454
مصل الأبقار الجنينيفيشر Scientific10-437-010
الميثانولفيشر العلميA454SK-4
حمض الأسيتيك الجليديساينتيك
مجهر زايسAXIOImager.Z2
مختبر SKY المركز فيشر AC295320010

المراجع

  1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
  2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).
  3. Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy? Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).
  4. Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics. Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).
  5. Hande, M. P., et al. Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study. Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).
  6. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  7. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  8. Hopman, A. H., et al. Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization. Histochemistry. 85, 1-4 (1986).
  9. Nederlof, P. M., et al. Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry. 10, 20-27 (1989).
  10. Nederlof, P. M., et al. Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry. 11, 126-131 (1990).
  11. Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation. Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).
  12. Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure. Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).
  13. Edwards, A. A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).
  14. Bauchinger, M., et al. Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).
  15. Hieber, L., et al. Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH. J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691(2011).
  16. Cohen, N., et al. detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype. Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).
  17. Pathak, R., et al. The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage. Pharm Res. , (2016).
  18. Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).
  19. Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. A new method for improving metaphase chromosome spreading. Cytometry A. 51, 46-51 (2003).
  20. Hande, M. P., et al. Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome. Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).
  21. Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values. Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).
  22. Kanda, R., et al. Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction. Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).
  23. Kakazu, N., et al. Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis. Lancet. 357, 529-530 (2001).
  24. Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions). Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).
  25. Abrahams, B. S., et al. Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation. Genesis. 36, 134-141 (2003).
  26. Savage, J. R., Simpson, P. On the scoring of FISH-"painted" chromosome-type exchange aberrations. Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).
  27. Savage, J. R., Simpson, P. FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges. Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).
  28. Tucker, J. D., et al. PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting. Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).
  29. Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems. Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).
  30. Lucas, J. N., et al. Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).
  31. Braselmann, H., et al. SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis. Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).
  32. Sokolova, I. A., et al. The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).
  33. Lindholm, C., et al. Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH. Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الكشف عن المشترك بين الكروموسومات الزيغ مستقرة من قبل الإسفار متعددة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.