Method Article

الكشف عن المشترك بين الكروموسومات الزيغ مستقرة من قبل الإسفار متعددة في الموقع التهجين (mFISH) والطيفية تنميط نووي (سكاى) في الفئران المشعع

DOI:

10.3791/55162

⸱

January 11th, 2017

 ,  , 
1Division of Radiation Health, Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Environmental Health, Fay W. Boozman School of Public Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Surgical Service, Central Arkansas Veterans Healthcare System

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول الحالي فائدة التهجين المضاق المتعدد في الموقع (mFISH) والتنميط النووي الطيفي (SKY) في تحديد الانحرافات المستقرة بين الكروموسومات في خلايا نخاع العظام للفئران بعد التعرض للإشعاع الكلي للجسم.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإشعاع المؤين (IR) يحفز العديد من الانحرافات الكروموسومية المستقرة وغير المستقرة. يمكن بسهولة تحديد الانحرافات غير المستقرة ، حيث يتعرض مورفولوجيا الكروموسوم للخطر بشكل كبير ، من خلال تقنيات تلطيخ الكروموسومات التقليدية. ومع ذلك ، فإن الكشف عن الانحرافات المستقرة ، والتي تنطوي على تبادل أو نقل المواد الوراثية دون تعديل كبير في مورفولوجيا الكروموسوم ، يتطلب تقنيات طلاء كروموسومات متطورة تعتمد على التهجين في الموقع لمسبارات الحمض النووي المسماة بالفلورسنت ، وهي تقنية طلاء كروموسوم تعرف شعبيا باسم التألق في الموقع التهجين (FISH). يمكن أن تكون مجسات FISH محددة للكروموسوم / الكروموسومات الكاملة أو منطقة فرعية دقيقة على الكروموسوم/الكروموسوم. لا تسمح الطريقة بتصور الانحرافات المستقرة فحسب ، بل يمكنها أيضا الكشف عن الكروموسوم / الكروموسوم أو تسلسل / تسلسل الحمض النووي المحدد المتورط في تكوين انحراف معين. تتوفر مجموعة متنوعة من تقنيات طلاء الكروموسوم في علم الوراثة الخلوية. هنا تتم مناقشة طريقتين شديدتي الحساسية ، التهجين المتعدد في الموقع (mFISH) والتنميط النووي الطيفي (SKY) ، لتحديد الانحرافات المستقرة بين الكروموسومات التي تتشكل في خلايا نخاع العظام للفئران بعد التعرض للإشعاع الكلي للجسم. على الرغم من أن كلتا التقنيتين تعتمدان على مجسات الحمض النووي المسمى بالفلورسنت ، إلا أن طريقة الكشف وعملية الحصول على الصور لإشارات الفلورسنت مختلفة. تم استخدام هاتين التقنيتين في مجالات بحثية مختلفة ، مثل بيولوجيا الإشعاع ، وعلم الوراثة الخلوية للسرطان ، وقياس الجرعات الحيوية للإشعاع بأثر رجعي ، وعلم الوراثة الخلوية السريري ، وعلم الوراثة الخلوية التطوري ، وعلم الوراثة الخلوية المقارن.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطريقتان الأكثر موثوقية لتحديد الانحرافات المستقرة بين الكروموسومات الناجمة عن الإشعاع هما التهجين الموضعي المتعدد (mFISH) ، والذي يسمح بطلاء كروموسومين أو أكثر في وقت واحد ، والتنميط النووي الطيفي (SKY) ، الذي يضفي لونا مميزا على كل زوج كروموسومات متماثلة في الجينوم. على عكس الانحرافات غير المستقرة ، فإن الانحرافات المستقرة مستمرة بطبيعتها ويمكن أن تنتشر لعدة أجيال في المجموعات السكانية المشععة1 ، وتعتبر "توقيعات" جزيئية حرجة للآفات الوراثية الخلوية التي يسببهاالإشعاع 2. أظهرت الدراسات التي أجرتها مجموعات مختلفة أن الانحرافات المستقرة مرتبطة بالتسبب في عدد من الأمراض وتطورها ، بما في ذلك السرطان3. قبل عصر طلاء الكروموسوم ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقا صارم مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وتمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة أركنساس للعلوم الطبية. تم إيواء جميع الحيوانات تحت منشأة الحيوان القياسية مكيفة الهواء في 20 ± 2 درجة مئوية مع 10-15 دورات ساعة من الهواء النقي وحرية الوصول إلى المواد الغذائية القوارض القياسية والمياه. ولدى وصوله، عقدت الفئران في الحجر الصحي لمدة 1 أسبوع، وقدم شهادة طعام القوارض.

التعرض 1.Radiation وفي فيفو اعتقال خلايا الطورية

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إجمالي إشعاع الجسم يدفع العديد من الانحرافات الكروموسومية في خلايا نخاع العظام من الفئران المعرضة للإشعاع. تم تحسين البروتوكول الحالي في الجسم الحي اعتقال الإنقسامية من خلايا نخاع العظام بعد التعرض للإشعاع، والحصاد من خلايا نخاع العظام من رجليه الخلفيتين من الفئران المعرضة للإشعاع وعزل خلايا نخاع العظام وحيدات النوى بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج، وإعداد ينتشر خلية الطورية، وبعدها الكشف عن التشوهات الكروموسومية مستقرة الإشعاع الناجم بوا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العديد من الخطوات الهامة التي تحدد نجاح mFISH وSKY. الخطوة الأولى والأكثر أهمية هو لتحسين معاملة الكولشيسين في الجسم الحي اعتقال الإنقسامية من الخلايا وحيدة النواة نخاع العظام. تركيز الكولشيسين والعلاج الوقت بمفرده أو بالتنسيق تحديد مؤشر الإنقسامية وكذلك كروموسوم التكثيف اثنين من أهم الشروط الأساسية لوحة كروموسوم فعالة. وتركيز عال الكولشيسين أو أطول وقت العلاج يؤدي إلى الكروموسومات مكثفة للغاية، والتي تتنافى لتمسخ السليم والتهجين. وعلاوة على ذلك، وتحديد دقيق لإعادة ترتيب .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذه الدراسة من قبل أركنساس الفضاء منح اتحاد والمعهد القومي للبحوث الفضاء الطبية الحيوية من خلال الإدارة الوطنية للملاحة الجوية والفضاء، يمنح NNX15AK32A (RP) وRE03701 (MH-J)، وP20 GM109005 (MH-J)، وإدارة المحاربين القدامى في الولايات المتحدة ( MH-J). نشكر كريستوفر Fettes، منسق برنامج لإدارة البيئة والصحة المهنية في جامعة أركنساس للعلوم الطبية، للمساعدة التحريرية في إعداد المخطوطة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
فورماميدسيجما ألدريتش221198-100 مل
SSC Buffer 20 & مرة ؛ كاشفSigma-AldrichS6639-1L
للتصوير الطيفي المطبقبالفأرFPRPR0030 / M40
CAD - مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة المركزةالتصوير الطيفي المطبقFPRPR0033
الدهانات المفردة حسب الطلب - 3 ألوان ؛ كروموسوم الماوس 1: أحمر ، كروموسوم الفأر 2: أخضر ، كروموسوم الفأر 3: التصويرالطيفي المائي التطبيقيFPRPR0182/10
أغطية زجاجيةفيشر Scientific12-545B
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
حمض الهيدروكلوريك ، 37٪ ، Acros OrganicsFisher ScientificAC45055-0025   ؛
أطباق تلطيخ زجاج فيشربراند مع غطاء لولبيفيشر ساينتيك08-816
محلول كلوريد البوتاسيوم KaryoMAX لايف تكنولوجيز10575-090
شرائح مجهر فيشر سوبرفروست بلسفيشر ساینتفيك12-550-15
مسحوق كولسيميدفيشر ساینتفيك50-464-757 
Histopaque-1083 سيجما ألدريتش10831
شيبرد مارك الأول ، موديل 25 < سوب > 137 < / sup> Cs irradiatorJL Shepherd & amp أسوشيتسموديل 484B
حقنة 1 ملBD Biosciences647911
الكحول الإيثيلي ، 200 برهانفيشر ScientificMEX02761
PBS ، (1x PBS Liq.) ، بدون الكالسيوم والمغنيسيومفيشر ScientificICN1860454
مصل الأبقار الجنينيفيشر Scientific10-437-010
الميثانولفيشر العلميA454SK-4
حمض الأسيتيك الجليديساينتيك
مجهر زايسAXIOImager.Z2
مختبر SKY المركز فيشر AC295320010

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
  2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Inter chromosomal Stable AberrationsMultiple Fluorescence In Situ HybridizationSpectral KaryotypingBone Marrow CellsTotal Body IrradiationMetaphase Cell SpreadsFluorescence MicroscopyChromosome PaintingCytogenetic AnalysisRadiation Biology

Related Articles