مقالة منهجية

وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية

DOI:

10.3791/55219

⸱

فبراير 25, 2017

 ,  , 
1Laboratory of Pathology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 2Experimental Transplantation and Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف طريقة لفرز خلايا الثدييات المفردة وتحديد التعبير عن ما يصل إلى 96 جينا مستهدفا ذا أهمية في كل خلية. تتضمن هذه الطريقة استخدام معايير qPCR الداخلية لتمكين تقدير عدد النصوص المطلق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن لقياسات التعبير الجيني من التجمعات السائبة للخلايا أن تحجب التباين النسخي الكبير للخلايا الفردية داخل تلك السكان. يمكن أن تساعد قياسات التعبير الجيني أحادي الخلية في تقييم دور الضوضاء في التعبير الجيني ، وتحديد الارتباطات في التعبير عن أزواج الجينات ، والكشف عن مجموعات سكانية فرعية من الخلايا التي تستجيب بشكل مختلف للمحفز. هنا ، نصف إجراء لقياس التعبير عن ما يصل إلى 96 جينا في خلايا ثدييات مفردة معزولة من مجموعة تنمو في زراعة الأنسجة. يتم فرز الخلايا في مخزن مؤقت للتحلل عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) ، ويتم نسخ أنواع mRNA ذات الأهمية وتضخيمها بشكل عكسي. ثم يتم قياس التعبير الجيني باستخدام جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي للموائع الدقيقة ، والذي يقوم بإجراء ما يصل إلى 96 فحصا qPCR على ما يصل إلى 96 عينة في المرة الواحدة. نصف أيضا إنشاء واستخدام معايير تضخم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتمكين تقدير العدد المطلق لكل نص. بالمقارنة مع الطرق الأخرى لقياس التعبير الجيني في الخلايا المفردة ، يسمح هذا النهج بالقياس الكمي لنصوص أكثر تميزا من RNA FISH بتكلفة أقل من RNA-Seq.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الفردية في عدد السكان يمكن أن تظهر استجابات متباينة على نطاق واسع لحافز موحد الفسيولوجية 1، 2، 3، 4. التباين الوراثي للخلايا في عدد السكان هو آلية واحدة لهذا التنوع من الردود، ولكن هناك أيضا العديد من العوامل غير الوراثية التي يمكن أن تزيد من تنوع الاستجابات، حتى في عدد السكان نسيلي من الخلايا. على سبيل المثال، يمكن للمستويات البروتينات الفردية وغيرها من الجزيئات يشير مهمة تختلف على أساس خلية من خلايا، مما أدى إلى اختلاف في ملامح التعبير الجيني المصب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يحدث تنشيط الجينات في رشقات نارية قصيرة المدة من النصوص 5، 6 يمكن أن تقتصر على عدد قليل نسبيا من النصوص في انفجار 7، 8، 9. هذهstochasticity في تفعيل الجينات يمكن أن يساهم إلى حد كبير في التغير في الاستجابات البيولوجية ويمكن أن توفر ميزة انتقائية في الكائنات الحية الدقيقة 10 وفي خلايا الثدييات 1، 2 الاستجابة لحافز الفسيولوجية. بسبب كل من المصادر الوراثية وغير الوراثية من الاختلاف، والوضع التعبير الجيني في أي خلية معينة في استجابة لحافز قد تختلف كثيرا عن متوسط ​​الشخصي التعبير الجيني تم الحصول عليها من قياس استجابة كبيرة. تحديد المدى الذي تظهر الخلايا الفردية التباين في استجابة لحافز يتطلب تقنيات لعزل الخلايا الفردية، وقياس مستويات التعبير عن نسخ من الفائدة، والتحليل الحسابي للبيانات التعبير الناتجة عن ذلك.

هناك عدة طرق لمعايرة التعبير الجيني في الخلايا واحد، وتغطي مجموعة واسعة من التكاليف، وعدد من النصوص سبر، ودقة القياس الكمي. على سبيل المثال، وحيدة الخلية RNA تسلسل يقدم عمق واسعة من تغطية نص والقدرة على تحديد الآلاف من النصوص المتميزة للجينات أكثر أعرب للغاية في الخلايا الفردية. ومع ذلك، فإن التكاليف المرتبطة بهذا العمق التسلسل يمكن أن تكون باهظة، على الرغم من أن تكاليف تستمر في الانخفاض. على العكس من ذلك، واحد جزيء RNA مضان في الموقع التهجين (smRNA FISH) يقدم الكمي الدقيق للنصوص حتى لأدنى مستوى في التعبير عن الجينات بتكلفة معقولة في الجينات في المصالح. ومع ذلك، سوى عدد قليل من الجينات المستهدفة يمكن يعاير في خلية معينة من قبل هذا النهج. الكمية المقايسات PCR القائم، وصفت في هذا البروتوكول، وتوفر حلا وسطا بين هذه التقنيات. هذه المقايسات توظف في الوقت الحقيقي PCR آلة الموائع الدقيقة لقياس ما يصل إلى 96 نسخ من الفائدة في وقت ما يصل الى 96 الخلايا. في حين أن كل الطرق المذكورة أعلاه لديها تكاليف الأجهزة المطلوبة، فإن تكلفة أي فحص QPCR الفردية هي نسبيامنخفض. ويتم تكييف هذا البروتوكول من واحد اقترح من قبل الشركة المصنعة للفي الوقت الحقيقي آلة PCR الموائع الدقيقة (بروتوكول ADP 41، Fluidigm). لتمكين تقدير العدد المطلق للكل نص في النهج القائم على PCR، قمنا بتوسيع بروتوكول للاستفادة من الضوابط الداخلية للamplicons الجين المستهدف مستعدة التي يمكن استخدامها عبر تجارب متعددة.

وكمثال على هذا الأسلوب، يتم وصف الكمي للتعبير عن الجينات التي تنظمها القامع البروتين p53 ورم في قدم مكعبة-7 خلايا سرطان الثدي البشرية 11. وتحدى الخلايا مع وكيل الكيميائية التي يدفع الحمض النووي فواصل مزدوج الجديلة. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الاستجابة البروتين p53 على الحمض النووي فواصل مزدوج الجديلة يسلك قدرا كبيرا من عدم التجانس في الخلايا الفردية، سواء من حيث مستويات البروتين p53 12 و في تفعيل الجينات المستهدفة متميزة (11). وعلاوة على ذلك، البروتين p53 ينظم التعبير عن أكثر من 100تتميز جيدا الجينات المستهدفة المشاركة في العديد من مسارات المصب، بما في ذلك الاعتقال دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، والشيخوخة 13 و 14. لأن استجابة بوساطة البروتين p53 في كل خلية على حد سواء معقدة ومتغيرة، وتحليل فوائد النظام من توجه فيه ما يقرب من 100 الجينات المستهدفة يمكن سبر في وقت واحد في الخلايا الفردية، مثل تلك التي وصفها أدناه. مع تعديلات طفيفة (مثل طرق بديلة لعزل وحيدة الخلية وتحلل)، وبروتوكول يمكن تكييفه بسهولة لدراسة مجموعة واسعة من أنواع الثدييات الخلية، والنصوص، والاستجابات الخلوية.

مع الإعداد المسبق السليم، ويمكن إجراء جولة من فرز الخلايا وقياس التعبير الجيني وفقا لهذا البروتوكول على مدى ثلاثة أيام. ويقترح توقيت التالية: مقدما، حدد نسخ من الفائدة، وتحديد والتحقق من صحة أزواج التمهيدي أن تضخيم [كدنا من تلك transcrIPTS، وإعداد المعايير ويمزج التمهيدي باستخدام تلك الاشعال. في يوم 1 بعد العلاج بالخلايا، والحصاد وفرز الخلايا، نفذ عكس النسخ ومحددة التضخيم الهدف، ومعالجة العينات مع نوكلياز خارجية لإزالة الاشعال الفردية. في يوم 2، نفذ مراقبة الجودة على خلايا فرز باستخدام QPCR. وأخيرا، في يوم 3، وقياس التعبير الجيني في الخلايا مرتبة باستخدام ميكروفلويديك QPCR. ويلخص الشكل 1 الخطوات المتبعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_title" >1. التحضير المسبق

  1. حدد ما يصل إلى 96 جينا مهما سيتم قياس تعبيره.
    ملاحظة: يجب أن يكون واحد على الأقل من هذه الجينات "جين التدبير المنزلي" ، مثل ACTB أو GAPDH ، والذي من المعروف أنه يتم التعبير عنه عند مستوى مرتفع وثابت نسبيا في ظل الظروف المستخدمة في التجربة. سيتم استخدام هذا الجين لتحديد الآبار التي تم فرزها إيجابيا (الخطوة 8.1) والعينات المضخمة (الخطوة 10.1).
    ملاحظة: بالنسبة للتجربة على سبيل المثال ، تم اختيار الأهداف المباشرة المميزة جيدا ل p53 مع مجموعة متنوعة من الوظائف المعروفة< فئة الدعم = "xref">11،14 و GAPDH كعنصر تحكم في التدبير المنزلي. يرجى الاطلاع على المرجع 11 للحصول على القائمة الكاملة للجينات المستهدفة والتسلسلات التمهيدية المستخدمة في هذه الدراسة.
  2. تحديد أزواج التمهيدي المحتملة الخاصة بالجينات ذات الأهمية (على سبيل المثال ، باستخدام الأدبيات العلمية أو أداة تصميم التمهيدي مثل Primer-BLAST) < sup class = "xref" > 15. قم بتصنيع البادئات والحفاظ عليها بتركيز مخزون 100 ميكرومتر في ماء خال من النوكلياز.
    ملاحظة: يجب أن يكون طول هذه الاشعال 15-25 قاعدة ؛ إنتاج أمبليكون 90-130 زوجا أساسيا (BP) طويلا ؛ تمتد تقاطع exon ، إن وجد ، لتقليل فرصة تضخيم الحمض النووي الجيني ؛ درجات حرارة انصهار 60 ± 1 درجة مئوية ؛ ولها الحد الأدنى من البنية الثانوية < فئة الدعم = "xref" > 16. سيتم استخدام هذه الاشعال لتحضير النسخ العكسي ، وتضخيم (كدنا) من النصوص ذات الأهمية ، وقياس التعبير الجيني في qPCR القائم على صبغة ربط الحمض النووي.
  3. تحقق من صحة الاشعال.
    1. أولا ، احصل على (كدنا) من الخلايا ذات الأهمية. حصاد الحمض النووي الريبي من الخلايا باستخدام مجموعة حصاد الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة أو طرق البيولوجيا الجزيئية القياسية< فئة الدعم = "xref">17. قم بنسخ الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي (كدنا) باستخدام مجموعة نسخ عكسية مع سداسيات عشوائية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة أو الطرق القياسية< فئة الدعم = "xref">17.
    2. لكل زوج أولي ، قم بإعداد qPCR مع مزيج صبغة ربط الحمض النووي الرئيسي ، والبادئات الأمامية والعكسية ، والحمض النووي (كدنا) من الخطوة السابقة ، باتباع توصيات الشركة المصنعة للمزيج الرئيسي لظروف التفاعل المقترحة. قم بتشغيل هذه التفاعلات على جهاز PCR في الوقت الفعلي باستخدام بروتوكول التدوير الحراري الموصى به من قبل الشركة المصنعة للمزيج الرئيسي والذي يتضمن الحصول على منحنى الذوبان.
    3. بعد qPCR ، قم بتشغيل عينات الحمض النووي المضخمة على 2٪ وزن / حجم جل الاغاروز وتصور الحمض النووي عبر صبغة إقحام الحمض النووي باتباع بروتوكول قياسي < فئة sup = "xref" >17.
    4. حدد كفاءة زوج التمهيدي عن طريق إنشاء منحنى قياسي من التخفيفات التسلسلية ل (كدنا) (تم إجراؤه في الخطوة 1.3.1) وفقا لبروتوكول قياسي<فئة الدعم = "xref">16.
      ملاحظة: سينتج عن زوج التمهيدي الجيد منحنى ذوبان بذروة واحدة محددة جيدا ونطاق واحد في الموقع المتوقع على فئة هلام < sup = "xref" > 16 ، < sup class = "xref" > 17 (الشكل 2). إذا كان منحنى الذوبان يحتوي على قمم متعددة أو "كتف" ، أو إذا كان الجل يحتوي على أشرطة متعددة أو مسحة ، فإن البادئات تضخم تسلسلا خارج الهدف. أعد تصميم أي بادئات لوحظت لتضخيم التسلسلات خارج الهدف وتكرار خطوات التحقق السابقة حسب الضرورة. سيكون لزوج التمهيدي الجيد أيضا كفاءة 90-110٪ ، مع R2 ≥0.985 للمنحنى القياسي<فئة sup = "xref">16 ؛ أعد تصميم أي بادئات تقع فيها الكفاءة أو R2 خارج هذه النطاقات.
  4. إعداد المعايير من مكبرات الحمض النووي النقية.
    1. لكل زوج تمهيدي تم التحقق من صحته:
      1. تضخيم منطقة الاهتمام من (كدنا) باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة للبوليميراز لتركيزات الحمض النووي التمهيدي والقالب ، وظروف التفاعل ، وظروف دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو باستخدام بروتوكول PCR القياسي< فئة الدعم = "xref">17.
      2. قم بتشغيل (كدنا) المضخم على 2٪ وزن / حجم هلام الاغاروز وتصور الفرقة باستخدام صبغة إقحام الحمض النووي < فئة الدعم = "xref">17. قم باستئصال الشريط الذي يمثل الامبليكون باستخدام شفرة حلاقة نظيفة وضع قطعة الجل في أنبوب طرد مركزي دقيق.
      3. قم بتنقية الأمبليكون من الجل باستخدام إجراء قياسي لاستخراج الجل ، مثل الاستخراج القائم على الأجاراز < فئة الدعم = "xref">17 أو مجموعة استخراج هلام العمود الدوار ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      4. قم بقياس تركيز الأمبليكون باستخدام مجموعة قياس كمية dsDNA القائمة على التألق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اقسم تركيز dsDNA المقاس على الوزن الجزيئي المعروف للأمبليكون بناء على تسلسل الأمبليكون للحصول على عدد جزيئات الأمبليكون لكل ميكرولتر.
      5. في أنبوب ميكرو فوج منخفض الارتباط سعة 2.0 مل ، أضف 2 ميكرولتر من الأمبليكون المنقى إلى حجم المخزن المؤقت لتعليق الحمض النووي بحيث يكون التركيز النهائي للأمبليكون 5 × 108 جزيئات / ميكرولتر.
    2. عندما يتم تنقية جميع الأمبليكونات ، اجمع 18 ميكرولتر من كل أمبليكون منقى في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الارتباط سعة 2.0 مل. أضف المخزن المؤقت لتعليق الحمض النووي ليصبح الحجم الإجمالي 1,800 ميكرولتر ؛ وبالتالي ، فإن تركيز كل أمبليكون هو 5 × 106 جزيئات / ميكرولتر
      ملاحظة: هذا الخليط ، الذي يحتوي على أمبليكونات (كدنا) من جميع الجينات ذات الأهمية بكميات متساوية المولار المعروفة ، سيكون بمثابة معيار في qPCR أحادي الخلية.
    3. دوامة هذا المعيار "5e6" جيدا ، تدور لمدة 10 ثوان عند 2,000 × جم ، وتقسم إلى 20 ميكرولتر في أنابيب PCR منخفضة الارتباط. قم بتخزين الحصص عند -80 درجة مئوية.
  5. قم بإعداد مزيج التمهيدي لتضخيم الهدف المحدد (STA) (10x).
    1. في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، امزج 25 ميكرولتر من كل برايمر مخزون 100 ميكرومتر (حتى 192). أضف المخزن المؤقت لتعليق الحمض النووي لعمل حجم إجمالي يبلغ 5,000 ميكرولتر
      ملاحظة: تركيز كل برايمر في هذا الخليط هو 500 نانومتر. ستستخدم كل لوحة من الخلايا المصنفة 105.6 ميكرولتر من هذا المزيج التمهيدي لتجهيز النسخ العكسي وتضخيم الهدف المحدد. حجم مزيج التمهيدي الوارد هنا يكفي لعمل 45 طبقا للفرز. ينصح بعمل حجم كبير بما يكفي من مزيج التمهيدي بحيث يحتاج إلى صنعه مرة واحدة فقط ؛ قم بقياس وحدات التخزين حسب الضرورة.
    2. تخلط جيدا عن طريق الدوامة ، وتقسم إلى 110 ميكرولتر ، وتخزن الحصص عند -20 درجة مئوية.
  6. قم بإعداد خلطات الفحص ، واحدة لكل زوج أولي ، لاستخدامها في qPCR القائم على رقاقة الموائع الدقيقة.
    1. في كل بئر من لوحة PCR ذات 96 بئرا ، اجمع بين 3.0 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي 100 ميكرومتر لجين معين ، و 3.0 ميكرولتر من التمهيدي العكسي المقابل 100 ميكرومتر ، و 24.0 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتعليق الحمض النووي ، و 30.0 ميكرولتر من كاشف تحميل الفحص 2x.
    2. قم بتدوير هذه اللوحة ، وتدور لمدة 10 ثوان عند 500 × جم ، وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  7. إنشاء برنامجين للدورة الحرارية: RTSTA (النسخ العكسي وتضخيم الهدف المحدد ؛ الجدول 1) و EXOI (علاج نوكلياز خارجي ؛ الجدول 2).
< p class = "jove_title" >2. العلاج
  1. ضع خلايا الثدييات على طبق زراعة الأنسجة بحيث تنمو إلى التقاء المطلوب في وقت العلاج ، اعتمادا على ظروف الدراسة التجريبية. على سبيل المثال المقدم في هذه الدراسة ، اللوحة 4 × 105 MCF-7 p53-Venus cells< sup class = "xref" >18 لكل طبق 6 سم في RPMI مع 10٪ مصل بقري جنين (FBS) ، 100 U / ml البنسلين ، 100 مجم / مل ستربتومايسين ، و 250 نانوغرام / مل أمفوتريسين B. احتضان الخلايا لمدة يومين عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى تصل إلى 50٪ التقاء.
  2. عالج الخلايا لتحديد حالة الاهتمام بناء على الدراسة التجريبية. على سبيل المثال المقدم في هذه الدراسة ، احتضان خلايا MCF-7 p53-Venus مع 400 نانوغرام / مل نيوكارزينوستاتين لمدة 3 ساعات أو 8.5 ساعة أو 14 ساعة أو 24 ساعة.
< p class = "jove_title" >3. تحضير المخزن المؤقت للتحلل لفرز الخلايا

ملاحظة: يستغرق صنع لوحة واحدة من المخزن المؤقت للتحلل حوالي 1 ساعة. ينصح بعمل وفرز ألواح متعددة ، حيث يمكن أن يكون فرز الخلايا غير فعال وينتج عنه العديد من الآبار بدون خلية يمكن اكتشافها.

  1. قم بتنظيف المقعد والماصات ورف الأنبوب وحاملات ألواح PCR الباردة والقفازات بمحلول تطهير الحمض النووي استعدادا لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
  2. قم بتخفيف مثبط RNAse إلى 2.64 وحدة / ميكرولتر عن طريق إضافة مثبط RNAse إلى الماء الخالي من النوكلياز في أنبوب سعة 1.5 ><مل. ملاحظة: يسمح هذا بإضافة مثبط RNAse إلى المخزن المؤقت للتحلل دون سحب كميات أقل من ميكرولتر.
  3. قم بعمل مخزن مؤقت للخلايا عن طريق الجمع بين المكونات المدرجة في الجدول 3.
  4. انقل 92.4 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل للخلايا إلى أنبوب منفصل ؛ سيكون هذا هو المخزن المؤقت للتحلل لمعايير Amplicon.
  5. باستخدام أطراف ماصة منخفضة الارتباط وأنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة، قم بإعداد 200 ميكرولتر و500 ميكرولتر من بكتريا قولونية الحمض النووي المخفف إلى 3.1 بيكوغرام/ميكرولتر و6.2 بيكوغرام/ميكرولتر، على التوالي، مع مخزن مؤقت لتعليق الحمض النووي.
  6. أضف 184.8 ميكرولتر من 3.1 بيكوغرام / ميكرولتر بكتريا قولونية الحمض النووي إلى المخزن المؤقت للتحلل للخلايا.
    ملاحظة: يعمل الحمض النووي الحامل للإشريكية القولونية على توسيع نطاق إمكانيات ربط التمهيدي غير المحددة وبالتالي تقليل احتمالية أن يؤدي ثنائي التمهيدي إلى منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
  7. إعداد المعايير.
    1. قم بتسمية ستة أنابيب لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الربط على أنها 5e5 ، 5e4 ، ... 5e0.
    2. أضف 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتعليق الحمض النووي إلى أنبوب "5e5".
    3. أضف 90 ميكرولتر من 6.2 بيكوغرام / ميكرولتر بكتريا قولونية DNA إلى كل من الأنابيب الخمسة الأخرى. احتفظ بجميع الأنابيب على الجليد.
      ملاحظة: دمج الحمض النووي الناقل في المعايير يجعل الكتلة الإجمالية للحمض النووي في الآبار القياسية قابلة للمقارنة مع تلك الموجودة في الآبار المكونة من خلية واحدة. هذا يقلل من احتمالية تأثر تركيز المعايير بارتباط الحمض النووي بالأنابيب أو أطراف الماصة.
    4. خذ حصة من معيار "5e6" (5 × 106 جزيئات / ميكرولتر من كل مكبر للصوت ، محضر في الخطوة 1.4) من التخزين. دوامة لفترة وجيزة وتدور لفترة وجيزة (5 ثوان عند 500 × جم) للتأكد من أن السائل في قاع الأنبوب.
    5. باستخدام طرف ماصة منخفض الربط ، أضف 10 ميكرولتر من معيار 5e6 إلى الأنبوب "5e5". دوامة لفترة وجيزة ، تدور (5 ثوان عند 500 × جم) ، وأعد الأنبوب إلى الجليد.
    6. الماصة 10 ميكرولتر من الأنبوب "5e5" إلى الأنبوب "5e4". دوامة لفترة وجيزة ، تدور (5 ثوان عند 500 × جم) ، ثم ضعها مرة أخرى على الجليد.
    7. كرر هذه التخفيفات التسلسلية ، حيث يتلقى كل أنبوب 10 ميكرولتر من الأنبوب السابق ، حتى يكون لجميع الأنابيب تخفيف قياسي.
  8. قم بإعداد صف من 12 أنبوب PCR بأغطية. قم بتوزيع 67 ميكرولتر من عازلة تحلل "الخلية" على كل أنبوب. قم بتغطية الأنابيب وقم بتدويرها لفترة وجيزة (5 ثوان عند 500 × جم) إذا لزم الأمر.
  9. باستخدام ماصة ذات 12 قناة، قم بتوزيع 9 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل "الخلوي" من صف أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في كل بئر من الصفوف السبعة الأولى من لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 3).
  10. قم بتوزيع 7 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل "القياسي" على كل بئر من الصف الأخير من اللوحة (الشكل 3).
  11. باستخدام أطراف ماصة منخفضة الربط ، أضف 2 ميكرولتر من المعيار إلى كل بئر من الصف السفلي وفقا لخريطة اللوحة (الشكل 3).
    ملاحظة: 2 ميكرولتر من 5 × 100 جزيئات/ميكرولتر قياسية مبالغ إلى 10 جزيئات, [إتك].
  12. أضف 2 ميكرولتر من 3.1 بيكوغرام / ميكرولتر بكتريا قولونية في الآبار المكونة من 10 خلايا و 100 خلية ؛ أضف 2 ميكرولتر من 6.2 بيكوغرام / ميكرولتر بكتريا قولونية في الآبار الخالية من الخلايا><. ملاحظة: يحتوي كل بئر مكون من خلية واحدة و 10 خلايا و 100 خلية على 6.2 بيكوغرام من الحمض النووي للإشريكية القولونية ، مما يقارب كتلة الحمض النووي الجيني في خلية بشرية واحدة. يحتوي كل بئر قياسي ولا خلوي على 12.4 بيكوغرام من الحمض النووي للإشريكية القولونية ، أي ما يقرب من خليتين بشريتين.
  13. أغلق اللوحة باستخدام مانع تسرب حراري معقم ، وقم بتدويرها لمدة 5 ثوان عند 500 × جم ، واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى تصبح الخلايا جاهزة للفرز.

4. إعداد فارز الخلايا

  1. قم ببرمجة فارز الخلايا المنشط بالفلورة للفرز في صفيحة مكونة من 96 بئرا وفقا لخريطة اللوحة (الشكل 3) ؛ لا ينبغي فرز أي خلايا في آبار H1-H8 أو H11-H12.
  2. تحقق من أن فارز الخلايا موجه جيدا للفرز في لوحة PCR.
    1. اضبط زاوية تيار الفرز على أدنى حد ممكن ؛ يزيد هذا الإعداد من فرصة فرز الخلايا في قيعان الآبار بدلا من ضرب الجوانب.
    2. لتوجيه الماكينة ، أغلق لوحة PCR فارغة واستخدم دفق الاختبار "لفرز" قطرات PBS على ختم اللوحة الفارغة ، وفقا لتعليمات الماكينة< فئة sup = "xref">19 ؛ يجب أن تهبط القطرات على سطح الختم في موضع فوق مركز البئر. للحصول على أفضل النتائج ، تحقق من الهدف عبر طول وعرض اللوحة.
    3. إذا لم تهبط القطرات في الموضع الصحيح ، فقم بمسحها عن سطح مانع التسرب ، وأعد معايرة فارز الخلايا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للماكينة ، وكرر ذلك حتى يتم ترسيب القطرات الموجودة في تيار الفرز بشكل صحيح.
< p class = "jove_title" >5. حصاد الخلايا وفرزها
  1. قم بتربسين الخلايا بما يتناسب مع خط الخلية. على سبيل المثال ، بالنسبة لخلايا MCF-7 ، استنشق الوسط من الخلايا ، واشطف الخلايا ب 1 مل من 0.05٪ تريبسين ، واحتضان الخلايا ب 2 مل من 0.05٪ تريبسين لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  2. أضف 8 مل من وسط زراعة الخلايا إلى الخلايا المكربسة وانقل كل 10 مل من تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 4 دقائق عند 400 × جم.
  3. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في PBS + 2٪ FBS.
    ملاحظة: يركز حجم إعادة التعليق الأصغر الخلايا ويسهل فرز الخلايا ؛ يعمل حجم إعادة التعليق 500 ميكرولتر بشكل جيد مع طبق 6 سم من الخلايا عند التقاء 50٪.
  4. انقل معلق الخلية إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي سعة 5 مل ، وسحب العينة من خلال مرشح 40 ميكرومتر لإزالة كتل الخلايا.
    5. قم
  5. بالطرد المركزي للوحة عازلة التحلل عند 400 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية قبل فرز الخلايا للتأكد من أن السائل في قاع الآبار.
  6. أدخل الأنبوب مع تعليق الخلية في فارز الخلايا. افتح الختم الموجود على لوحة المخزن المؤقت للتحلل وفرز الخلايا ذات الأهمية بعناية في اللوحة وفقا لخريطة اللوحة واتبع تعليمات الشركة المصنعة لفارز الخلايا< فئة الدعم = "xref">19. لضمان فرز الخلايا المفردة بأقصى درجة نقاء ، قم بتشغيل الجهاز في وضع "خلية واحدة" واستخدم بوابات قياس التدفق الخلوي القياسية بناء على التشتت الأمامي والجانبي < فئة sup = "xref" >19.
    ملاحظة: في مثال التجربة ، قم ببوابة الخلايا القائمة على مضان p53-Venus لعزل ألمع 15٪ من الخلايا الفردية< فئة sup = "xref">11.
  7. أغلق اللوحة بختم حراري جديد معقم وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ضع اللوحة في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل برنامج RTSTA (انظر الخطوة 1.7).
    ملاحظة: يؤدي هذا إلى إجراء نسخ عكسي على mRNA من الخلايا التي تم فرزها ثم يؤدي إلى تضخيم (كدنا) للنصوص ذات الأهمية.
< p class = "jove_title" >6. علاج نوكلياز خارجي
  1. امزج نوكلياز خارجي مخفف I عن طريق الجمع بين المكونات المدرجة في الجدول 4. قم بإعداد صف من 12 أنبوب PCR مع أغطية. قم بتوزيع 30.5 ميكرولتر من نوكلياز خارجي المخفف I في كل أنبوب. قم بتغطية الأنابيب وتدويرها لفترة وجيزة (5 ثوان عند 500 × جم) للتأكد من أن السائل في قاع الأنبوب.
  2. عند الانتهاء من RTSTA، قم بتدوير لوحة العينة لمدة 5 ثوان عند 500 × جم. باستخدام ماصة ذات 12 قناة، قم بتوزيع 3.6 ميكرولتر من نوكلياز خارجي المخفف I في كل بئر من اللوحة.
  3. أغلق اللوحة بختم حراري معقم وقم بتدويرها لفترة وجيزة (5 ثوان عند 500 × جم). ضع اللوحة في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل برنامج EXOI (انظر الخطوة 1.7).
    ملاحظة: تعمل هذه الخطوة على تدهور أي بادئات متبقية بعد تضخيم هدف محدد بحيث لا تتداخل مع تفاعل البوليميراز المتسلسل في المستقبل.
< p class = "jove_title" >7. تخفيف العينة
  1. عند الانتهاء من معالجة نوكلياز خارجي ، أضف 32.4 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE إلى كل بئر من لوحة العينة ؛ هذه نقطة توقف اختيارية ، ويمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية لعدة أيام.

8. فرز مراقبة الجودة باستخدام qPCR

ملاحظة: نظرا لأن فرز الخلايا ليس فعالا تماما ، فإن هذه الخطوة ضرورية لتحديد آبار اللوحة التي تم فرزها بالفعل تلقت خلية. يمكن بعد ذلك استخدام هذه العينات لمزيد من التحليل.

  1. قم بقياس التعبير الجيني للتدبير المنزلي في كل عينة بواسطة qPCR.
    1. قم بإعداد 900 ميكرولتر من مزيج qPCR الرئيسي لصبغة ربط الحمض النووي ل 96 تفاعلا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للبوليميراز باستخدام بادئات لأحد جينات التدبير المنزلي المختارة في الخطوة 1.1 ؛ تعتمد التركيزات الدقيقة للعازلة للتفاعل ، والبوليميراز ، والبادئات ، وما إلى ذلك لهذا التفاعل على البوليميراز المحدد المستخدم.
    2. وزعي 9 ميكرولتر من المزيج الرئيسي على كل بئر من لوحة PCR سعة 96 بئرا. أضف 1 ميكرولتر من العينة من لوحة العينة إلى البئر المقابل للوحة PCR.
    3. قم بتشغيل اللوحة على جهاز PCR في الوقت الفعلي باستخدام بروتوكول التدوير الحراري الذي اقترحته الشركة المصنعة للمزيج الرئيسي أو باتباع بروتوكول قياسي< فئة sup = "xref">20.
  2. قم بتحليل بيانات qPCR < sup class = "xref" >20 ؛ يظهر مثال على بيانات qPCR من خطوات مراقبة جودة الفرز المدرجة أدناه في الشكل 4.
    1. تحقق من أن القياسات من الآبار الخالية من الخلايا تظهر مستوى منخفضا (خلفية) من التعبير الجيني أو عدم وجود تعبير على الإطلاق.
    2. تحقق من أن القياسات من الآبار المكونة من خلية واحدة تنقسم بوضوح إلى مجموعتين: عينات موجبة ذات تعبير جيني عال وعينات سلبية ذات مستويات خلفية من التعبير أو عدم وجود تعبير على الإطلاق ، على غرار الآبار الخالية من الخلية.
      ملاحظة: تمثل العينات ذات التعبير الجيني العالي الخلايا الفعلية التي تم فرزها. يجب استبعاد أولئك الذين لديهم تعبير عن الخلفية من إجراء مزيد من التحليل.
    3. تحقق من أن القياسات من الآبار المكونة من 10 خلايا و 100 خلية تعكس تعبيرا جينيا أعلى مما كانت عليه في الآبار الموجبة المكونة من خلية واحدة ، مما يسمح باحتمال أن يتسبب الفرز غير الفعال في احتواء خلايا تلك الآبار على خلايا أقل من المطلوب.
    4. تحقق من أن القياسات من الآبار القياسية موزعة بالتساوي في الفضاء اللوغاريتمي (أي أن قيم Ct موزعة بالتساوي).
  3. بعد تحديد جميع العينات الموجبة المكونة من خلية واحدة ، قم بعمل خريطة لوحة "مزيج العينة" لتعيين عينات موجبة من خلية واحدة على لوحة جديدة مكونة من 96 بئرا. قم بتضمين ثمانية آبار للمعايير على خريطة اللوحة هذه. انظر الشكل 5 للحصول على مثال.
فئة

9. قياس التعبير الجيني باستخدام qPCR الموائع الدقيقة

ملاحظة: لكل خطوة في هذا القسم، قم بتمرير الماصة إلى المحطة الأولى فقط لتقليل تكوين الفقاعات في الكواشف.

  1. افتح صفا من 8 أنابيب PCR. إذا كانت هناك لوحات متعددة من العينات ، فافتح الصف الثاني من 8 أنابيب PCR وقم بتسمية الأنابيب من 1 إلى 8. سيكون هذا الصف لتجميع المعايير من لوحات متعددة.
  2. في أنبوب سعة 1.5 مل ، امزج 360 ميكرولتر من مزيج qPCR الرئيسي لصبغة ربط الحمض النووي مع 36 ميكرولتر من كاشف تحميل عينة صبغة ربط الحمض النووي. دوامة لفترة وجيزة وتدور لمدة 10 ثوان عند 2,000 × جم. قسم هذا الخليط (396 ميكرولتر) إلى صف غير مسمى من 8 أنابيب PCR ، مع وضع 48 ميكرولتر في كل أنبوب.
  3. باستخدام ماصة ذات 8 قنوات، قم بتوزيع 3.3 ميكرولتر من خليط كاشف تحميل المزيج الرئيسي/العينة في كل بئر من لوحة PCR جديدة سعة 96 بئرا. قم بتسمية هذه اللوحة ، "عينات من الخلطات".
  4. لكل لوحة PCR من العينات:
      قم
    1. بتدوير اللوحة لمدة 10 ثوان وتدور لمدة 10 ثوان عند 500 × جم. قم بإزالة الغطاء وانقل 2.7 ميكرولتر من كل عينة موجبة من خلية واحدة إلى البئر المقابل لها على لوحة خلطات العينة للآبار المكونة من خلية واحدة المشار إليها في خريطة اللوحة.
    2. إذا كان هناك لوحة واحدة فقط من العينات ، فقم بنقل 2.7 ميكرولتر من كل معيار مضخم إلى البئر المقابل له على لوحة خلطات العينة وفقا لخريطة اللوحة.
    3. إذا كانت هناك لوحات متعددة من العينات ، فقم بنقل 2.7 ميكرولتر من كل معيار مضخم إلى موضعه المقابل في الصف المسمى من أنابيب PCR. أضف معايير من لوحة العينات الحالية إلى أي معايير موجودة بالفعل. أغلق لوحة العينات عند الانتهاء باستخدام فيلم مانع للتسرب.
  5. إذا كانت هناك لوحات متعددة من العينات:
    1. دوامة صف أنابيب PCR التي تحتوي على معايير لمدة 10 ثوان وتدور لمدة 10 ثوان عند 2,000 × جم. انقل 2.7 ميكرولتر من كل أنبوب من المعايير المختلطة إلى البئر المقابل على لوحة خلطات العينة وفقا لخريطة اللوحة.
  6. قم بتحميل آبار NTC ب 2.7 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكلياز كما هو موضح على خريطة اللوحة. أغلق طبق خلطات العينة واحفظه على حرارة 4 درجات مئوية لحين الحاجة.
  7. انزع الملصق من أسفل شريحة qPCR الموائع الدقيقة الجديدة. باستخدام حقنة من سائل خط التحكم مع استمرار الغطاء ، ادفع كل زنبرك تراكم لأسفل لفكه ، وحقن كل مجمع ب 150-200 ميكرولتر من سائل خط التحكم.
  8. أدخل الشريحة في آلة التحميل وقم بتشغيل البرنامج النصي "Prime". يستغرق هذا ~ 20 دقيقة.
  9. عند الانتهاء من التحضير ، قم بتدوير وتدوير ألواح خلطات الفحص (المحضرة في الخطوة 1.6) وخلطات العينات.
  10. باستخدام ماصة ذات 8 قنوات ، انقل 4.5 ميكرولتر من كل مزيج فحص إلى الجانب الأيسر من شريحة qPCR الموائع الدقيقة وفقا للرسم البياني في الشكل 6. الماصة بعناية فائقة لتجنب تكوين فقاعات هواء في قاع الآبار. عند الانتهاء ، أغلق لوحة خلطات الفحص واحفظها عند -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
  11. انقل 4.5 ميكرولتر من كل مزيج عينة إلى الجانب الأيمن من شريحة qPCR الموائع الدقيقة وفقا للشكل 6. أدخل الشريحة في آلة التحميل وقم بتشغيل البرنامج النصي "Load Mix". يستغرق هذا ~ 90 دقيقة.
  12. قم بتشغيل جهاز PCR في الوقت الفعلي للموائع الدقيقة ، وابدأ برنامج جمع البيانات ، وقم بتشغيل المصباح لتسخينه. يستغرق هذا ~ 20 دقيقة.
  13. عند الانتهاء من البرنامج النصي Load Mix، تحقق من عدم وجود خطوط عبر الشريحة - وهذا قد يشير إلى وجود مشكلة في التحميل. قم بإزالة أي جزيئات غبار بعناية من الرقاقة باستخدام شريط سكوتش أو شريط مختبر. أدخل الشريحة في جهاز PCR في الوقت الفعلي للموائع الدقيقة وقم بتشغيل البرنامج النصي لجمع البيانات. استخدم برنامج التحليل لفحص النتائج وتصدير البيانات لمزيد من التحليل.
< p class = "jove_title" >10. تحليل البيانات
  1. قم بإزالة القياسات التي تظهر فيها منحنيات تضخيم qPCR جودة رديئة (أي التي لا تشبه المنحنيات منحنى التضخيم السيني القياسي)< فئة الدعم = "xref">20.
  2. قم بإزالة العينات التي تحتوي على أكثر من 30 قياسا رديئا أو صفريا أو التي يكون التعبير الجيني للتدبير المنزلي (انظر الخطوة 1.1) أقل بكثير من غالبية العينات الأخرى (الشكل 7).
  3. لكل جين ، قم بتقدير موقع ذروة الذوبان الصحيح كمتوسط مواقع ذروة الذوبان من كل عينة. إذا كان القياس يحتوي على ذروة ذوبان تقع على بعد أكثر من 1 درجة مئوية من الوسيط ، فقم بإزالة هذا القياس من الاعتبار< فئة الدعم = "xref">20.
  4. لكل جين ، قم بإنشاء منحنى قياسي لتقدير عدد الرنا المرسال في كل عينة باستخدام جدول بيانات أو لغة برمجة نصية< sup class = "xref">20.< / > ملاحظة: تتكون المعايير في هذه التجربة من 10 أو 100 أو 1000 أو 10000 جزيء من dsDNA تتوافق مع كل نسخة ذات أهمية. إذا كان النسخ العكسي فعالا تماما ، فإن المعايير ستتوافق مع 20 و 200 و 2000 و 20000 و 20000 جزيء من mRNA ، نظرا لأن mRNA و cDNA أحادي الشريطة. من الناحية العملية ، ليس هذا هو الحال ، لذلك نعبر عن القياسات كتقدير بوحدات الجزيئات × ERT ، حيث ERT هي كفاءة النسخ العكسي.
    1. لكل بئر قياسي ، حدد m ، عدد جزيئات ssDNA (ضعف عدد جزيئات dsDNA) قبل التضخيم (على سبيل المثال ، 20 جزيئا ، 200 جزيء ، إلخ).
    2. لكل بئر قياسي ، حدد قيمة Ct من qPCR20.
    3. باستخدام قيم m و Ct ، قم بإجراء انحدار خطي باستخدام المعادلة التالية لإنشاء منحنى قياسي مع المعلمات a و b لكل جين ، وابحث عن قيمة R2 كمؤشر على جودة الملاءمة:
      figure-protocol-1
    4. من المنحنى القياسي ، احسب كفاءة PCR E لكل جين:
      figure-protocol-2
      ملاحظة: القيمة E الأكبر بكثير من 1.0 (على سبيل المثال ، E > 1.1) ليست واقعية فيزيائيا. تعني قيمة R2 للانحدار الخطي أقل بكثير من 1.0 (على سبيل المثال ، R2 < 0.985) أن المعايير لا تعمل بشكل موثوق. تشير هذه المشكلات عموما إلى أن أدنى معيار أمبليكون يقع تحت عتبة القياس الكمي الموثوق به ، وبالتالي يجب استبعاد أدنى معيار من الانحدار الخطي. إذا تعذر إجراء انحدار خطي مناسب باستخدام ثلاثة معايير فريدة على الأقل ، فتجاهل قياسات التعبير للجين.
    5. إذا كان الانحدار الخطي كافيا ، فاستخدم معلمات الملاءمة الناتجة أ و ب لكل جين لتقدير عدد جزيئات الرنا المرسال mest (بوحدات الجزيئات × ERT) للجين المقابل في كل عينة من خلية واحدة من قيمة Ct المقاسة:
      figure-protocol-3
    6. قم بتعيين أي قياس mest < 1 على أنه mest = 0. أيضا ، قم بتعيين أي قياس بدون تضخيم في qPCR وبالتالي لا توجد قيمة Ct على أنها mest = 0.
      ملاحظة: يتم العثور على القياسات التي يقل mest عن أدنى أو أكبر من أعلى معيار مستخدم في الانحدار عن طريق الاستقراء من المنحنى القياسي. هذه التقديرات ليست بالضرورة باطلة ولكن يجب النظر إليها بحذر.
  5. تصور بيانات التعبير الجيني أحادي الخلية.
    1. اصنع قطعة أرض سرب النحل (Dorn، J. and Holy، T.، 2012، http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/37105) حيث تمثل كل نقطة التعبير الجيني في خلية معينة؛ يظهر مثال في الشكل 8.
    2. قم بعمل مخطط كمان (Dorn، J.، 2012، http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661) حيث يمثل عرض "الكمان" تكرار قياسات التعبير الجيني حول مستوى معين في عدد الخلايا التي تم تحليلها؛ مثال موضح في الشكل 8.
      ملاحظة: يمكن للتحليلات الأكثر تعقيدا أن تحقق من العلاقات في التعبير بين أزواج الجينات < sup class = "xref" > 21 ، < sup class = "xref" >22 ويمكن أن تستنتج شبكات التعبير الجيني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرة عامة على البروتوكول موضحة في الشكل 1 ، بما في ذلك خطوات معالجة الخلايا ، وعزل الخلايا المفردة بواسطة FACS ، وتوليد وتضخيم مكتبات (كدنا) من محللات الخلية الواحدة ، وتأكيد مكتبات (كدنا) أحادية الخلية في الآبار التي تم فرزها ، وقياس التعبير الجيني بواسطة qPCR.

استعدادا لعزل الخلية المفردة وتحليل التعبير الجيني ، من الضروري أولا تحديد أزواج أوليمر قليلة النوكليوتيدات الصالحة لكل جين مستهدف محل اهتمام. يوضح ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قدمنا طريقة لعزل خلايا الثدييات الفردية عن مجموعة من الخلايا الملتصقة المزروعة في المزرعة ولفحص التعبير عن ما يقرب من 96 جينا في كل خلية. يعد التحضير المسبق الجيد أمرا بالغ الأهمية حتى تعمل هذه الطريقة بشكل جيد. على وجه الخصوص ، يعد تصميم واختبار أزواج التمهيدي الخاصة بالنصوص ذات الأهمية (الخطوات 1.2-1.3) خطوات تستغرق وقتا طويلا ولكنها مهمة ، حيث تحدد البادئات جودة قياسات الخلية الواحدة. بمجرد الحصول على أزواج أولية موثوقة ، يتم استخدامها لتضخيم (كدنا) من النصوص ذات الأهمية. ثم يتم دمج الأمبليكونات معا بكميات متساوية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر V. Kapoor في CCR ETIB Flow Cytometry Core لمساعدتها في إجراء فرز الخلايا أثناء تطوير هذا البروتوكول. كما نشكر M. Raffeld ووحدة التشخيص الجزيئي CCR LP و J. Zhu و NHLBI DNA Sequencing and Genomics Core لمساعدتهم في إجراء qPCR أثناء تطوير هذا البروتوكول. تم دعم هذا البحث من قبل البرنامج الداخلي للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة RNeasy Plus MiniQiagen74134
طقم نسخ عكسي عالي السعة من cDNA مع مثبط RNaseThermoFisher4374966
Phusion بوليميراز الحمض النووي عالي الدقةنيو إنجلاند BioLabsM0530S
QIAquick Gel ExtractionKit Qiagen28704
Quant-iT طقمفحص dsDNA عالي الحساسيةThermoFisherQ33120 
2.0 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الالتصاق الولاياتالمتحدة الأمريكية العلمية1420-2600
DNA تعليق العازلةTeknovaT0221
Axygen 0.2 مل Maxymum Recovery رقيقة الجدار أنابيب PCR CorningPCR-02-L-C
GE 96.96 صفيف ديناميكي DNA ملزمة صبغ عينة & ; طقم كاشف تحميل الفحصFluidigm100-3415
HyClone RPMI 1640 mediaGE Healthcare LifeSciences SH30027.01
مصل بقري للجنين ، معتمد (الولايات المتحدة)ThermoFisher16000-044
محلول مضاد للمضادات الحيوية ومضاد للفطرياتCorning30-004-CI
NeocarzinostatinSigmaN9162
ELIMINaseDecon Labs1101
SUPERase-InThermoFisherAM2696
CellsDirect طقم qRT-PCR بخطوةواحدة ThermoFisher11753500
E. القولوني< / em> DNAAffymetrix14380 10 MG
فيلم ختم حراري ، معقمإكسل علميSTR-THER-PLT
BD FACSAria IIuBD العلوم البيولوجية
HyClone Trypsin 0.05٪GE Healthcare LifeSciences SH30236.01
PBS ، 1xCorning21-040-CV
Falcon 40 & micro ؛ m Cell StrainerCorning352340
Exonuclease INew England BioLabsM0293S
SsoFast EvaGreen Supermix مع ROXBio-Radمنخفض 172-5210
96.96 مصفوفة ديناميكية IFC للتعبير الجيني (رقاقة qPCR الموائع الدقيقة)FluidigmBMK-M-96.96
وحدة تحكم IFC HX (آلة التحميل)Fluidigm
BioMark أو BioMark HD (آلة qPCR microfluidic) برنامجالحقيقي Fluidigm
  ؛Fluidigm
MATLABMathWorks
Kit تحليل PCR في الوقت برنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
  2. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  3. Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).
  4. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
  5. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
  6. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4 (10), e309+(2006).
  7. Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
  8. Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+(2015).
  9. Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).
  10. Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
  11. Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).
  12. Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).
  13. Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).
  14. Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).
  15. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13 (1), 134(2012).
  16. PCR Technologies: A Technical Guide. , Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).
  17. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  18. Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).
  19. Flow Cytometry: Principles and Applications. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
  20. Real-time PCR. , Taylor & Francis. (2006).
  21. Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13 (1), 328(2012).
  22. Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).
  23. Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).
  24. Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77(2016).
  25. Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).
  26. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  27. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
  28. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FACS RT STA I

مقالات ذات صلة