نصف طريقة لفرز خلايا الثدييات المفردة وتحديد التعبير عن ما يصل إلى 96 جينا مستهدفا ذا أهمية في كل خلية. تتضمن هذه الطريقة استخدام معايير qPCR الداخلية لتمكين تقدير عدد النصوص المطلق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن لقياسات التعبير الجيني من التجمعات السائبة للخلايا أن تحجب التباين النسخي الكبير للخلايا الفردية داخل تلك السكان. يمكن أن تساعد قياسات التعبير الجيني أحادي الخلية في تقييم دور الضوضاء في التعبير الجيني ، وتحديد الارتباطات في التعبير عن أزواج الجينات ، والكشف عن مجموعات سكانية فرعية من الخلايا التي تستجيب بشكل مختلف للمحفز. هنا ، نصف إجراء لقياس التعبير عن ما يصل إلى 96 جينا في خلايا ثدييات مفردة معزولة من مجموعة تنمو في زراعة الأنسجة. يتم فرز الخلايا في مخزن مؤقت للتحلل عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) ، ويتم نسخ أنواع mRNA ذات الأهمية وتضخيمها بشكل عكسي. ثم يتم قياس التعبير الجيني باستخدام جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي للموائع الدقيقة ، والذي يقوم بإجراء ما يصل إلى 96 فحصا qPCR على ما يصل إلى 96 عينة في المرة الواحدة. نصف أيضا إنشاء واستخدام معايير تضخم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتمكين تقدير العدد المطلق لكل نص. بالمقارنة مع الطرق الأخرى لقياس التعبير الجيني في الخلايا المفردة ، يسمح هذا النهج بالقياس الكمي لنصوص أكثر تميزا من RNA FISH بتكلفة أقل من RNA-Seq.
المقدمة
الخلايا الفردية في عدد السكان يمكن أن تظهر استجابات متباينة على نطاق واسع لحافز موحد الفسيولوجية 1، 2، 3، 4. التباين الوراثي للخلايا في عدد السكان هو آلية واحدة لهذا التنوع من الردود، ولكن هناك أيضا العديد من العوامل غير الوراثية التي يمكن أن تزيد من تنوع الاستجابات، حتى في عدد السكان نسيلي من الخلايا. على سبيل المثال، يمكن للمستويات البروتينات الفردية وغيرها من الجزيئات يشير مهمة تختلف على أساس خلية من خلايا، مما أدى إلى اختلاف في ملامح التعبير الجيني المصب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يحدث تنشيط الجين....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التحضير المسبق
- اختر ما يصل إلى 96 جينًا مستهدفًا سيتم قياس تعبيرها.
ملاحظة: يجب أن يكون أحد هذه الجينات على الأقل "جينًا تدبيريًا" (housekeeping gene)، مثل ACTB أو GAPDH، والذي يُعرف بتعبيره بمستوى عالٍ وثابت نسبيًا تحت الظروف المستخدمة في التجربة. سيُستخدم هذا الجين لتحديد الآبار التي تم فرزها إيجابيًا (الخطوة 8.1) والعينات التي تم تضخيمها (الخطوة 10.1).
ملاحظة: في التجربة النموذجية، تم اختيار أهداف مباشرة لـ p53 معروفة بدقة ولها وظائف متنوعة11,14 بالإضافة إلى GAPDH كضابط تدبيري. يرجى مراجعة المرجع 11 للحصول على القائمة الكاملة للجينات المستهدفة وتسلسلات البادئات المستخدمة في هذه الدر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يظهر عرض عام للبروتوكول في الشكل 1، بما في ذلك خطوات معالجة الخلايا، وعزل الخلايا المفردة عن طريق FACS، وتوليد ومضاعفة مكتبات cDNA مسبقاً من محللات الخلايا المفردة، وتأكيد مكتبات cDNA للخلايا المفردة في الآبار المفروزة، وقياس التعبير الجيني بواسطة qPCR.
كجزء من التحضير لعزل الخلايا المفردة وتحليل التعبير الجيني، من الضروري أولاً تحديد أزواج من بادئات قليلة النيوكليوتيد (oligonucleotide primers) صالحة لكل جين مست.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لقد قدمنا طريقة لعزل خلايا الثدييات الفردية عن مجموعة من الخلايا الملتصقة المزروعة في المزرعة ولفحص التعبير عن ما يقرب من 96 جينا في كل خلية. يعد التحضير المسبق الجيد أمرا بالغ الأهمية حتى تعمل هذه الطريقة بشكل جيد. على وجه الخصوص ، يعد تصميم واختبار أزواج التمهيدي الخاصة بالنصوص ذات الأهمية (الخطوات 1.2-1.3) خطوات تستغرق وقتا طويلا ولكنها مهمة ، حيث تحدد البادئات جودة قياسات الخلية الواحدة. بمجرد الحصول على أزواج أولية موثوقة ، يتم استخدامها لتضخيم (كدنا) من النصوص ذات الأهمية. ثم يتم دمج الأمبليكونات معا بكميات متساوية.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نود أن نشكر V. Kapoor في CCR ETIB Flow Cytometry Core لمساعدتها في إجراء فرز الخلايا أثناء تطوير هذا البروتوكول. كما نشكر M. Raffeld ووحدة التشخيص الجزيئي CCR LP و J. Zhu و NHLBI DNA Sequencing and Genomics Core لمساعدتهم في إجراء qPCR أثناء تطوير هذا البروتوكول. تم دعم هذا البحث من قبل البرنامج الداخلي للمعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مجموعة RNeasy Plus Mini | Qiagen | 74134 | |
| طقم نسخ عكسي عالي السعة من cDNA مع مثبط RNase | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة | نيو إنجلاند BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction | Kit Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT طقم | فحص dsDNA عالي الحساسيةThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الالتصاق الولايات | المتحدة الأمريكية العلمية | 1420-2600 | |
| DNA تعليق العازلة | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2 مل Maxymum Recovery رقيقة الجدار أنابيب PCR Corning | PCR-02-L-C | ||
| GE 96.96 صفيف ديناميكي DNA ملزمة صبغ عينة & ; طقم كاشف تحميل الفحص | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life | Sciences SH30027.01 | |
| مصل بقري للجنين ، معتمد (الولايات المتحدة) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| محلول مضاد للمضادات الحيوية ومضاد للفطريات | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect طقم qRT-PCR بخطوة | واحدة ThermoFisher | 11753500 | |
| E. القولوني< / em> DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| فيلم ختم حراري ، معقم | إكسل علمي | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD العلوم البيولوجية | ||
| HyClone Trypsin 0.05٪ | GE Healthcare Life | Sciences SH30236.01 | |
| PBS ، 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40 & micro ؛ m Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix مع ROX | Bio-Rad | منخفض 172-5210 | |
| 96.96 مصفوفة ديناميكية IFC للتعبير الجيني (رقاقة qPCR الموائع الدقيقة) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| وحدة تحكم IFC HX (آلة التحميل) | Fluidigm | ||
| BioMark أو BioMark HD (آلة qPCR microfluidic) برنامج | الحقيقي Fluidigm | ||
| ؛ | Fluidigm | ||
| MATLAB | MathWorks |
المراجع
- Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
