يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية

16.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55219

⸱

فبراير 25, 2017

 ,  , 
1Laboratory of Pathology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 2Experimental Transplantation and Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute

في هذه المقالة

ملخص

نصف طريقة لفرز خلايا الثدييات المفردة وتحديد التعبير عن ما يصل إلى 96 جينا مستهدفا ذا أهمية في كل خلية. تتضمن هذه الطريقة استخدام معايير qPCR الداخلية لتمكين تقدير عدد النصوص المطلق.

الملخص

يمكن لقياسات التعبير الجيني من التجمعات السائبة للخلايا أن تحجب التباين النسخي الكبير للخلايا الفردية داخل تلك السكان. يمكن أن تساعد قياسات التعبير الجيني أحادي الخلية في تقييم دور الضوضاء في التعبير الجيني ، وتحديد الارتباطات في التعبير عن أزواج الجينات ، والكشف عن مجموعات سكانية فرعية من الخلايا التي تستجيب بشكل مختلف للمحفز. هنا ، نصف إجراء لقياس التعبير عن ما يصل إلى 96 جينا في خلايا ثدييات مفردة معزولة من مجموعة تنمو في زراعة الأنسجة. يتم فرز الخلايا في مخزن مؤقت للتحلل عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) ، ويتم نسخ أنواع mRNA ذات الأهمية وتضخيمها بشكل عكسي. ثم يتم قياس التعبير الجيني باستخدام جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي للموائع الدقيقة ، والذي يقوم بإجراء ما يصل إلى 96 فحصا qPCR على ما يصل إلى 96 عينة في المرة الواحدة. نصف أيضا إنشاء واستخدام معايير تضخم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتمكين تقدير العدد المطلق لكل نص. بالمقارنة مع الطرق الأخرى لقياس التعبير الجيني في الخلايا المفردة ، يسمح هذا النهج بالقياس الكمي لنصوص أكثر تميزا من RNA FISH بتكلفة أقل من RNA-Seq.

المقدمة

الخلايا الفردية في عدد السكان يمكن أن تظهر استجابات متباينة على نطاق واسع لحافز موحد الفسيولوجية 1، 2، 3، 4. التباين الوراثي للخلايا في عدد السكان هو آلية واحدة لهذا التنوع من الردود، ولكن هناك أيضا العديد من العوامل غير الوراثية التي يمكن أن تزيد من تنوع الاستجابات، حتى في عدد السكان نسيلي من الخلايا. على سبيل المثال، يمكن للمستويات البروتينات الفردية وغيرها من الجزيئات يشير مهمة تختلف على أساس خلية من خلايا، مما أدى إلى اختلاف في ملامح التعبير الجيني المصب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يحدث تنشيط الجينات في رشقات نارية قصيرة المدة من النصوص 5، 6 يمكن أن تقتصر على عدد قليل نسبيا من النصوص في انفجار 7، 8، 9. هذهstochasticity في تفعيل الجينات يمكن أن يساهم إلى حد كبير في التغير في الاستجابات البيولوجية ويمكن أن توفر ميزة انتقائية في الكائنات الحية الدقيقة 10 وفي خلايا الثدييات 1، 2 الاستجابة لحافز الفسيولوجية. بسبب كل من المصادر الوراثية وغير الوراثية من الاختلاف، والوضع التعبير الجيني في أي خلية معينة في استجابة لحافز قد تختلف كثيرا عن متوسط ​​الشخصي التعبير الجيني تم الحصول عليها من قياس استجابة كبيرة. تحديد المدى الذي تظهر الخلايا الفردية التباين في استجابة لحافز يتطلب تقنيات لعزل الخلايا الفردية، وقياس مستويات التعبير عن نسخ من الفائدة، والتحليل الحسابي للبيانات التعبير الناتجة عن ذلك.

هناك عدة طرق لمعايرة التعبير الجيني في الخلايا واحد، وتغطي مجموعة واسعة من التكاليف، وعدد من النصوص سبر، ودقة القياس الكمي. على سبيل المثال، وحيدة الخلية RNA تسلسل يقدم عمق واسعة من تغطية نص والقدرة على تحديد الآلاف من النصوص المتميزة للجينات أكثر أعرب للغاية في الخلايا الفردية. ومع ذلك، فإن التكاليف المرتبطة بهذا العمق التسلسل يمكن أن تكون باهظة، على الرغم من أن تكاليف تستمر في الانخفاض. على العكس من ذلك، واحد جزيء RNA مضان في الموقع التهجين (smRNA FISH) يقدم الكمي الدقيق للنصوص حتى لأدنى مستوى في التعبير عن الجينات بتكلفة معقولة في الجينات في المصالح. ومع ذلك، سوى عدد قليل من الجينات المستهدفة يمكن يعاير في خلية معينة من قبل هذا النهج. الكمية المقايسات PCR القائم، وصفت في هذا البروتوكول، وتوفر حلا وسطا بين هذه التقنيات. هذه المقايسات توظف في الوقت الحقيقي PCR آلة الموائع الدقيقة لقياس ما يصل إلى 96 نسخ من الفائدة في وقت ما يصل الى 96 الخلايا. في حين أن كل الطرق المذكورة أعلاه لديها تكاليف الأجهزة المطلوبة، فإن تكلفة أي فحص QPCR الفردية هي نسبيامنخفض. ويتم تكييف هذا البروتوكول من واحد اقترح من قبل الشركة المصنعة للفي الوقت الحقيقي آلة PCR الموائع الدقيقة (بروتوكول ADP 41، Fluidigm). لتمكين تقدير العدد المطلق للكل نص في النهج القائم على PCR، قمنا بتوسيع بروتوكول للاستفادة من الضوابط الداخلية للamplicons الجين المستهدف مستعدة التي يمكن استخدامها عبر تجارب متعددة.

وكمثال على هذا الأسلوب، يتم وصف الكمي للتعبير عن الجينات التي تنظمها القامع البروتين p53 ورم في قدم مكعبة-7 خلايا سرطان الثدي البشرية 11. وتحدى الخلايا مع وكيل الكيميائية التي يدفع الحمض النووي فواصل مزدوج الجديلة. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الاستجابة البروتين p53 على الحمض النووي فواصل مزدوج الجديلة يسلك قدرا كبيرا من عدم التجانس في الخلايا الفردية، سواء من حيث مستويات البروتين p53 12 و في تفعيل الجينات المستهدفة متميزة (11). وعلاوة على ذلك، البروتين p53 ينظم التعبير عن أكثر من 100تتميز جيدا الجينات المستهدفة المشاركة في العديد من مسارات المصب، بما في ذلك الاعتقال دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، والشيخوخة 13 و 14. لأن استجابة بوساطة البروتين p53 في كل خلية على حد سواء معقدة ومتغيرة، وتحليل فوائد النظام من توجه فيه ما يقرب من 100 الجينات المستهدفة يمكن سبر في وقت واحد في الخلايا الفردية، مثل تلك التي وصفها أدناه. مع تعديلات طفيفة (مثل طرق بديلة لعزل وحيدة الخلية وتحلل)، وبروتوكول يمكن تكييفه بسهولة لدراسة مجموعة واسعة من أنواع الثدييات الخلية، والنصوص، والاستجابات الخلوية.

مع الإعداد المسبق السليم، ويمكن إجراء جولة من فرز الخلايا وقياس التعبير الجيني وفقا لهذا البروتوكول على مدى ثلاثة أيام. ويقترح توقيت التالية: مقدما، حدد نسخ من الفائدة، وتحديد والتحقق من صحة أزواج التمهيدي أن تضخيم [كدنا من تلك transcrIPTS، وإعداد المعايير ويمزج التمهيدي باستخدام تلك الاشعال. في يوم 1 بعد العلاج بالخلايا، والحصاد وفرز الخلايا، نفذ عكس النسخ ومحددة التضخيم الهدف، ومعالجة العينات مع نوكلياز خارجية لإزالة الاشعال الفردية. في يوم 2، نفذ مراقبة الجودة على خلايا فرز باستخدام QPCR. وأخيرا، في يوم 3، وقياس التعبير الجيني في الخلايا مرتبة باستخدام ميكروفلويديك QPCR. ويلخص الشكل 1 الخطوات المتبعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التحضير المسبق

  1. اختر ما يصل إلى 96 جينًا مستهدفًا سيتم قياس تعبيرها.
    ملاحظة: يجب أن يكون أحد هذه الجينات على الأقل "جينًا تدبيريًا" (housekeeping gene)، مثل ACTB أو GAPDH، والذي يُعرف بتعبيره بمستوى عالٍ وثابت نسبيًا تحت الظروف المستخدمة في التجربة. سيُستخدم هذا الجين لتحديد الآبار التي تم فرزها إيجابيًا (الخطوة 8.1) والعينات التي تم تضخيمها (الخطوة 10.1).
    ملاحظة: في التجربة النموذجية، تم اختيار أهداف مباشرة لـ p53 معروفة بدقة ولها وظائف متنوعة11,14 بالإضافة إلى GAPDH كضابط تدبيري. يرجى مراجعة المرجع 11 للحصول على القائمة الكاملة للجينات المستهدفة وتسلسلات البادئات المستخدمة في هذه الدراسة.
  2. حدد أزواج البادئات المحتملة والخاصة بالجينات المستهدفة (على سبيل المثال، باستخدام المراجع العلمية أو أداة لتصميم البادئات مثل Primer-BLAST)15. قم بتركيب البادئات وحافظ عليها بتركيز مخزون قدره 100 μM في ماء خالٍ من النوكلياز.
    ملاحظة: يجب أن يتراوح طول هذه البادئات بين 15-25 قاعدة؛ وأن تُنتج قطعة تضخيم (amplicon) بطول 90-130 زوجًا من القواعد (bp)؛ وأن تشمل وصلة إكسونية (exon junction)، إن وجدت، لتقليل فرصة تضخيم DNA الجينومي؛ وأن تكون درجات حرارة الانصهار 60 ± 1 °C؛ وأن يكون لها حد أدنى من البنية الثانوية16. ستُستخدم هذه البادئات لبدء عملية النسخ العكسي، وتضخيم cDNA من النسخ المستهدفة، وقياس التعبير الجيني باستخدام qPCR المعتمد على صبغة ربط DNA.
  3. التحقق من صحة البادئات.
    1. أولاً، استخلص cDNA من الخلايا المستهدفة. قم بجمع RNA من الخلايا باستخدام طقم جمع RNA وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة أو طرق البيولوجيا الجزيئية القياسية17. قم بإجراء النسخ العكسي للـ RNA إلى cDNA باستخدام طقم نسخ عكسي مع سداسيات عشوائية (random hexamers) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة أو الطرق القياسية17.
    2. لكل زوج من البادئات، قم بإعداد qPCR باستخدام خليط رئيسي (master mix) من صبغة ربط DNA، وبادئات أمامية وعكسية، والـ cDNA من الخطوة السابقة، باتباع توصيات الشركة المصنعة للخليط الرئيسي فيما يخص ظروف التفاعل المقترحة. قم بتشغيل هذه التفاعلات على جهاز PCR في الوقت الحقيقي باستخدام بروتوكول دورات حرارية موصى به من قبل الشركة المصنعة للخليط الرئيسي يتضمن الحصول على منحنى الانصهار.
    3. بعد الـ qPCR، قم بتشغيل عينات DNA المضخمة على هلام أغاروز بنسبة 2% w/v، وقم بتصوير الـ DNA باستخدام صبغة متداخلة مع الـ DNA باتباع بروتوكول قياسي17.
    4. حدد كفاءة زوج البادئات من خلال إنشاء منحنى قياسي من تخفيفات متسلسلة للـ cDNA (التي تم تحضيرها في الخطوة 1.3.1) وفقًا لبروتوكول قياسي16.
      ملاحظة: سينتج زوج البادئات الجيد منحنى انصهار بقمة واحدة محددة جيدًا وحزمة واحدة في الموقع المتوقع على الهلام16,17 (الشكل 2). إذا كان منحنى الانصهار يحتوي على قمم متعددة أو "كتف"، أو إذا ظهرت في الهلام حزم متعددة أو تلطخ (smear)، فإن البادئات تقوم بتضخيم تسلسل غير مستهدف. أعد تصميم أي بادئات لوحظ تضخيمها لتسلسلات غير مستهدفة وكرر خطوات التحقق السابقة حسب الضرورة. كما يجب أن يتميز زوج البادئات الجيد بكفاءة تتراوح بين 90-110%، مع قيمة R2 ≥0.985 للمنحنى القياسي16؛ وأعد تصميم أي بادئات تقع كفاءتها أو قيمة R2 الخاصة بها خارج هذه النطاقات.
  4. تحضير المعايير من قطع DNA مضخمة ومنقاة.
    1. لكل زوج بادئات تم التحقق من صحته:
      1. قم بتضخيم المنطقة المستهدفة من cDNA باستخدام DNA polymerase عالي الدقة وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة للبوليميراز فيما يخص تركيزات البادئات وDNA القالب، وظروف التفاعل، وظروف دورات PCR، أو باستخدام بروتوكول PCR قياسي17.
      2. قم بتشغيل cDNA المضخم على هلام أغاروز بنسبة 2% w/v وصوّر الحزمة باستخدام صبغة متداخلة مع الـ DNA17. استقطع الحزمة التي تمثل قطعة التضخيم باستخدام شفرة حلاقة نظيفة وضع قطعة الهلام في أنبوب طرد مركزي دقيق.
      3. قم بتنقية قطعة التضخيم من الهلام باستخدام إجراء استخلاص قياسي من الهلام، مثل الاستخلاص المعتمد على الأغاراز (agarase)17 أو طقم استخلاص من الهلام باستخدام عمود طرد مركزي (spin-column)، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
      4. قس تركيز قطعة التضخيم باستخدام طقم قياس كمي لـ dsDNA المعتمد على الفلورة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. اقسم تركيز dsDNA المقاس على الوزن الجزيئي المعروف لقطعة التضخيم بناءً على تسلسلها للحصول على عدد جزيئات قطعة التضخيم لكل µl.
      5. في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2.0 ml ومنخفض الارتباط، أضف 2 µl من قطعة التضخيم المنقاة إلى حجم من محلول عازل لتعليق DNA بحيث يكون التركيز النهائي لقطعة التضخيم 5 x 108 جزيء/µl.
    2. عند تنقية جميع قطع التضخيم، ادمج 18 µl من كل قطعة تضخيم منقاة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2.0 ml ومنخفض الارتباط. أضف محلول عازل لتعليق DNA للوصول إلى حجم إجمالي قدره 1,800 µl؛ وبذلك يصبح تركيز كل قطعة تضخيم 5 x 106 جزيء/µl.
      ملاحظة: هذا المزيج، الذي يحتوي على قطع تضخيم cDNA من جميع الجينات المستهدفة بكميات متساوية مولاريًا ومعروفة، سيُستخدم كمعيار في qPCR للخلية الواحدة.
    3. قم برج هذا المعيار "5e6" جيدًا باستخدام جهاز الفورتيكس (vortex)، ثم قم بتدويره لمدة 10 ثوانٍ عند 2,000 x g، وقسمه إلى حصص قدرها 20 µl في أنابيب PCR منخفضة الارتباط. تُخزن هذه الحصص عند -80 °C.
  5. تحضير مزيج بادئات التضخيم النوعي للمستهدف (STA) بتركيز (10x).
    1. في أنبوب مخروطي سعة 15 ml، ادمج 25 µl من كل بادئة مخزونة بتركيز 100 µM (حتى 192 بادئة). أضف محلول عازل لتعليق DNA للوصول إلى حجم إجمالي قدره 5,000 µl.
      ملاحظة: تركيز كل بادئة في هذا المزيج هو 500 nM. ستستخدم كل لوحة من الخلايا المفرزة 105.6 µl من مزيج البادئات هذا لبدء النسخ العكسي والتضخيم النوعي للمستهدف. حجم مزيج البادئات المذكور هنا يكفي لإعداد 45 لوحة للفرز. يُنصح بتحضير حجم كافٍ من مزيج البادئات بحيث لا يحتاج لإعادة التحضير إلا مرة واحدة؛ قم بتعديل الأحجام حسب الضرورة.
    2. امزج المكونات جيدًا باستخدام الفورتيكس، وقسمها إلى حصص قدرها 110 µl، وخزن هذه الحصص عند -20 °C.
  6. تحضير مخاليط المقايسة، واحدة لكل زوج من البادئات، لاستخدامها في qPCR المعتمد على شريحة الموائع الدقيقة.
    1. في كل بئر من لوحة PCR ذات 96 بئرًا، ادمج 3.0 µl من البادئة الأمامية بتركيز 100 µM لجين معين، و3.0 µl من البادئة العكسية المقابلة بتركيز 100 µM، و24.0 µl من محلول عازل لتعليق DNA، و30.0 µl من كاشف تحميل المقايسة بتركيز 2x.
    2. قم برج هذه اللوحة باستخدام الفورتيكس، وتدويرها لمدة 10 ثوانٍ عند 500 x g، وتخزينها عند -20 °C.
  7. قم بإنشاء برنامجين للدورات الحرارية: RTSTA (النسخ العكسي والتضخيم النوعي للمستهدف؛ الجدول 1) و EXOI (المعالجة بإنزيم exonuclease I؛ الجدول 2).

2. المعالجة

  1. قم بزراعة الخلايا الثديية في طبق زراعة أنسجة بحيث تنمو لتصل إلى درجة الالتحام المطلوبة عند وقت المعالجة، وذلك اعتماداً على ظروف الدراسة التجريبية. وبالنسبة للمثال المعروض في هذه الدراسة، يتم زراعة 4 x 105 من خلايا MCF-7 p53-Venus18 لكل طبق سعة 6 cm في وسط RPMI يحتوي على 10% من مصل جنين البقر (FBS)، و 100 U/ml من البنسلين، و 100 mg/ml من الستربتومايسين، و 250 ng/ml من الأمفوتيريسين B. تُحضن الخلايا لمدة يومين عند درجة حرارة 37 °C مع 5% CO2 حتى تصل نسبة الالتحام إلى 50%.
  2. عالج الخلايا لتهيئة الحالة المطلوبة بناءً على الدراسة التجريبية. وبالنسبة للمثال المعروض في هذه الدراسة، يتم تحضين خلايا MCF-7 p53-Venus مع 400 ng/ml من النيوكارزينوستاتين لمدة 3 hr أو 8.5 hr أو 14 hr أو 24 hr.

3. تحضير محلول التحلل لفرز الخلايا

ملاحظة: يستغرق تحضير طبق واحد من محلول التحلل (lysis buffer) حوالي 1 hr. ويُنصح بتحضير وفرز عدة أطباق، نظرًا لأن فرز الخلايا قد يكون غير فعال وقد ينتج عن ذلك العديد من الآبار التي لا تحتوي على خلايا يمكن اكتشافها.

  1. قم بتنظيف المنضدة، والماصات، وحامل الأنابيب، وحوامل ألواح PCR المبردة، والقفازات باستخدام محلول إزالة تلوث DNA تحضيراً لعملية PCR.
  2. خفف مثبط RNAse إلى تركيز 2.64 U/µl عن طريق إضافة مثبط RNAse المركز إلى ماء خالٍ من النيوكلياز في أنبوب سعة 1.5 ml.
    ملاحظة: يتيح ذلك إضافة مثبط RNAse إلى محلول التحلل دون الحاجة إلى سحب أحجام أقل من 1 µl.
  3. قم بتحضير محلول التحلل للخلايا عن طريق دمج المكونات المدرجة في الجدول 3.
  4. انقل 92.4 µl من محلول التحلل الخاص بالخلايا إلى أنبوب منفصل؛ سيكون هذا هو محلول التحلل لمعايير الأمبليكون (amplicon standards).
  5. باستخدام رؤوس ماصات وأنابيب طرد مركزي دقيقة منخفضة الارتباط، حضّر 200 µl و 500 µl من DNA بكتيريا E. coli مخففة إلى 3.1 pg/µl و 6.2 pg/µl على التوالي، باستخدام محلول تعليق DNA.
  6. أضف 184.8 µl من DNA بكتيريا E. coli بتركيز 3.1 pg/µl إلى محلول التحلل الخاص بالخلايا.
    ملاحظة: يعمل DNA بكتيريا E. coli كـ DNA حامل لتوسيع نطاق احتمالات الارتباط غير النوعي للبادئات، وبالتالي تقليل احتمالية أن يؤدي ازدواج البادئات (primer dimerization) إلى تكوين ناتج PCR.
  7. تحضير المعايير.
    1. قم بتسمية ستة أنابيب طرد مركزي دقيقة منخفضة الارتباط كـ 5e5، 5e4، ... 5e0.
    2. أضف 90 µl من محلول تعليق DNA إلى أنبوب "5e5".
    3. أضف 90 µl من DNA بكتيريا E. coli بتركيز 6.2 pg/µl إلى كل من الأنابيب الخمسة الأخرى. احتفظ بجميع الأنابيب على الثلج.
      ملاحظة: إن دمج DNA الحامل في المعايير يجعل الكتلة الإجمالية لـ DNA في آبار المعايير قابلة للمقارنة بتلك الموجودة في آبار الخلية الواحدة؛ وهذا يقلل من احتمالية تأثر تركيز المعايير بارتباط DNA بجدران الأنابيب أو رؤوس الماصات.
    4. خذ عينة من معيار "5e6" (5 x 106 جزيئات/µl من كل أمبليكون، المحضر في الخطوة 1.4) من التخزين. قم بالرج سريعاً باستخدام جهاز vortext ثم الطرد المركزي لفترة وجيزة (5 ثوانٍ عند 500 x g) للتأكد من تجمع السائل في قاع الأنبوب.
    5. باستخدام رأس ماصة منخفض الارتباط، أضف 10 µl من معيار 5e6 إلى أنبوب "5e5". قم بالرج سريعاً، ثم الطرد المركزي (5 ثوانٍ عند 500 x g)، وأعد الأنبوب إلى الثلج.
    6. اسحب 10 µl من أنبوب "5e5" وضعها في أنبوب "5e4". قم بالرج سريعاً، ثم الطرد المركزي (5 ثوانٍ عند 500 x g)، وأعده إلى الثلج.
    7. كرر هذه التخفيفات التسلسلية، بحيث يتلقى كل أنبوب 10 µl من الأنبوب السابق، حتى يتم تخفيف المعيار في جميع الأنابيب.
  8. حضر صفاً من 12 أنبوب PCR مع أغطيتها. وزع 67 µl من محلول التحلل الخاص بالخلايا في كل أنبوب. أغلق الأنابيب وقم بالطرد المركزي لفترة وجيزة (5 ثوانٍ عند 500 x g) إذا لزم الأمر.
  9. باستخدام ماصة 12 قناة، وزع 9 µl من محلول التحلل الخاص بالخلايا من صف أنابيب PCR في كل بئر من الصفوف السبعة الأولى من لوح PCR (الشكل 3).
  10. وزع 7 µl من محلول التحلل الخاص بالمعايير في كل بئر من الصف الأخير من اللوح (الشكل 3).
  11. باستخدام رؤوس ماصات منخفضة الارتباط، أضف 2 µl من المعيار إلى كل بئر في الصف السفلي وفقاً لخريطة اللوح (الشكل 3).
    ملاحظة: 2 µl من معيار 5 x 100 جزيئات/µl تعادل 10 جزيئات، إلخ.
  12. أضف 2 µl من DNA بكتيريا E. coli بتركيز 3.1 pg/µl في آبار 10 خلايا و 100 خلية؛ وأضف 2 µl من DNA بكتيريا E. coli بتركيز 6.2 pg/µl في آبار "بدون خلايا".
    ملاحظة: يحتوي كل بئر من آبار الخلية الواحدة، و 10 خلايا، و 100 خلية على 6.2 pg من DNA بكتيريا E. coli، وهو ما يقارب كتلة DNA الجينومي في خلية بشرية واحدة. بينما يحتوي كل بئر من آبار المعايير وآبار "بدون خلايا" على 12.4 pg من DNA بكتيريا E. coli، وهو ما يعادل تقريباً محتوى خليتين بشريتين.
  13. أغلق اللوح باستخدام سدادة حرارية معقمة، وقم بالطرد المركزي لمدة 5 ثوانٍ عند 500 x g، واحفظه في درجة حرارة 4 °C حتى تصبح الخلايا جاهزة للفرز.

4. إعداد جهاز فرز الخلايا

  1. قم ببرمجة جهاز فرز الخلايا المنشط بالفلورة للفرز في طبق ذي 96 بئراً وفقاً لخريطة الطبق (الشكل 3)؛ ويجب عدم فرز أي خلايا في الآبار H1-H8 أو H11-H12.
  2. تحقق من توجيه جهاز فرز الخلايا بدقة للفرز في طبق PCR.
    1. اضبط زاوية تيار الفرز على أدنى قيمة ممكنة؛ حيث يزيد هذا الإعداد من احتمالية فرز الخلايا في قاع الآبار بدلاً من اصطدامها بالجوانب.
    2. لتوجيه الجهاز، قم بإغلاق طبق PCR فارغ بإحكام واستخدم تيار الاختبار لـ "فرز" قطرات من PBS على سدادة الطبق الفارغ، وفقاً لتعليمات الجهاز19؛ ويجب أن تسقط القطرات على سطح السدادة في موقع فوق مركز البئر. وللحصول على أفضل النتائج، تحقق من دقة التوجيه على طول وعرض الطبق.
    3. إذا لم تسقط القطرات في الموقع الصحيح، قم بمسحها من على سطح السدادة، وأعد معايرة جهاز فرز الخلايا وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة للجهاز، وكرر العملية حتى يتم ترسيب القطرات في تيار الفرز بشكل صحيح.

5. حصاد الخلايا وفرزها

  1. قم بمعالجة الخلايا بالتربسين حسب ما هو مناسب لخط الخلايا. على سبيل المثال، بالنسبة لخلايا MCF-7، اسحب الوسط من الخلايا، واشطف الخلايا بـ 1 ml من تربسين بتركيز 0.05%، ثم حضن الخلايا مع 2 ml من تربسين بتركيز 0.05% لمدة 5 min عند 37 °C و 5% CO2.
  2. أضف 8 ml من وسط زراعة الخلايا إلى الخلايا المعالجة بالتربسين، وانقل كامل الـ 10 ml من معلق الخلايا إلى أنبوب سعة 15 ml. قم بالطرد المركزي لمدة 4 min عند 400 x g.
  3. اسحب السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في PBS + 2% FBS.
    ملاحظة: يؤدي استخدام حجم أقل عند إعادة التعليق إلى تركيز الخلايا وتسهيل عملية فرز الخلايا؛ حيث يعمل حجم إعادة تعليق قدره 500 µl بشكل جيد لطبق خلايا بقطر 6 cm عند درجة تلاقي 50%.
  4. انقل معلق الخلايا إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي سعة 5 ml، مع السحب والضخ عبر مرشح 40 µm لإزالة تكتلات الخلايا.
  5. قم بالطرد المركزي لطبق محلول التحلل عند 400 x g لمدة 30 sec عند 4 °C قبل فرز الخلايا لضمان استقرار السائل في قاع الآبار.
  6. أدخل الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا في جهاز فرز الخلايا. افتح الختم الموجود على طبق محلول التحلل، وفرز الخلايا المستهدفة بعناية في الطبق وفقاً لخريطة الطبق وباتباع تعليمات الشركة المصنعة لجهاز فرز الخلايا19. لضمان فرز الخلايا المفردة بأقصى درجة من النقاء، قم بتشغيل الجهاز في وضع "single cell" واستخدم تقنية تحديد البوابات القياسية لقياس التدفق الخلوي بناءً على التشتت الأمامي والجانبي19.
    ملاحظة: في التجربة المثال، حدد بوابة الخلايا بناءً على فلورة p53-Venus لعزل أكثر الخلايا الفردية سطوعاً بنسبة 15%11.
  7. أغلق الطبق بختم حراري معقم جديد، وقم بالطرد المركزي عند 400 x g لمدة 1 min عند 4 °C. ضع الطبق في الجهاز الدوري الحراري وقم بتشغيل برنامج RTSTA (راجع الخطوة 1.7).
    ملاحظة: تقوم هذه العملية بنسخ عكسي لـ mRNA من الخلايا المفروزة، ثم تضخيم cDNA للنصوص الجينية المستهدفة.

6. المعالجة بإنزيم الإكسونوكلياز

  1. قم بخلط exonuclease I المخفف عن طريق دمج المكونات المدرجة في الجدول 4. جهز صفاً مكوناً من 12 أنبوب PCR مع أغطيتها. وزع 30.5 µl من exonuclease I المخفف في كل أنبوب. أغلق الأنابيب وقم بتدويرها لفترة وجيزة (5 sec عند 500 x g) لضمان استقرار السائل في قاع الأنبوب.
  2. عند انتهاء عملية RTSTA، قم بتدوير لوح العينات لمدة 5 sec عند 500 x g. وباستخدام ماصة ذات 12 قناة، وزع 3.6 µl من exonuclease I المخفف في كل بئر من آبار اللوح.
  3. أغلق اللوح باستخدام سدادة حرارية معقمة وقم بتدويره لفترة وجيزة (5 sec عند 500 x g). ضع اللوح في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل برنامج EXOI (راجع الخطوة 1.7).
    ملاحظة: تعمل هذه الخطوة على تحلل أي بادئات متبقية بعد تضخيم الهدف المحدد حتى لا تتداخل مع عمليات PCR المستقبلية.

7. تخفيف العينة

  1. عند الانتهاء من المعالجة بإنزيم exonuclease، أضف 32.4 µl من محلول TE buffer إلى كل بئر في لوحة العينات؛ وتعتبر هذه نقطة توقف اختيارية، حيث يمكن تخزين العينات عند -20 °C لعدة أيام.

8. مراقبة جودة الفرز باستخدام qPCR

ملاحظة: نظرًا لأن فرز الخلايا ليس فعالاً بشكل تام، فإن هذه الخطوة ضرورية لتحديد أي من آبار اللوحة المفرزة قد استقبلت خلية بالفعل. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه العينات لإجراء المزيد من التحليلات.

  1. قياس تعبير الجين المرجعي (housekeeping gene) في كل عينة بواسطة qPCR.
    1. تحضير 900 µl من المزيج الرئيسي (master mix) لـ qPCR يحتوي على صبغة ربط DNA لـ 96 تفاعلاً وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة للبوليميراز، باستخدام بادئات لأحد الجينات المرجعية التي تم اختيارها في الخطوة 1.1؛ ستعتمد التركيزات الدقيقة لمحلول التفاعل المنظم، والبوليميراز، والبادئات، إلخ لهذا التفاعل على نوع البوليميراز المستخدم.
    2. توزيع 9 µl من المزيج الرئيسي على كل بئر من آبار لوحة PCR ذات الـ 96 بئراً. إضافة 1 µl من العينة من لوحة العينات إلى البئر المقابل في لوحة PCR.
    3. تشغيل اللوحة على جهاز PCR في الوقت الحقيقي (real-time PCR) باستخدام بروتوكول دورات حرارية مقترح من الشركة المصنعة للمزيج الرئيسي أو باتباع بروتوكول قياسي20.
  2. تحليل بيانات qPCR20؛ يظهر في الشكل 4 مثال على بيانات qPCR من خطوات مراقبة جودة الفرز المدرجة أدناه.
    1. التحقق من أن القياسات المأخوذة من الآبار الخالية من الخلايا (no-cell wells) تظهر مستوى منخفضاً (خلفية) من تعبير الجينات أو لا تظهر أي تعبير على الإطلاق.
    2. التحقق من أن القياسات المأخوذة من الآبار التي تحتوي على خلية واحدة (1-cell wells) تنقسم بوضوح إلى مجموعتين: عينات إيجابية ذات تعبير جيني مرتفع، وعينات سلبية ذات مستويات تعبير خلفية أو لا تظهر تعبيراً على الإطلاق، بشكل مشابه للآبار الخالية من الخلايا.
      ملاحظة: تمثل العينات ذات التعبير الجيني المرتفع الخلايا التي تم فرزها فعلياً؛ ويجب استبعاد العينات ذات التعبير الخلفي من التحليلات اللاحقة.
    3. التحقق من أن القياسات المأخوذة من الآبار التي تحتوي على 10 خلايا و100 خلية تعكس تعبيراً جينياً أعلى مما هو عليه في الآبار الإيجابية ذات الخلية الواحدة، مع مراعاة احتمالية أن يؤدي الفرز غير الفعال إلى احتواء تلك الآبار على عدد خلايا أقل من المطلوب.
    4. التحقق من أن القياسات المأخوذة من الآبار القياسية موزعة بالتساوي في الحيز اللوغاريتمي (أي أن قيم Ct موزعة بالتساوي).
  3. بعد تحديد جميع عينات الخلية الواحدة الإيجابية، يتم إنشاء خريطة لوحة "مزيج العينات" (Sample Mixes) لتعيين عينات الخلية الواحدة الإيجابية على لوحة جديدة ذات 96 بئراً. تدرج ثمانية آبار للمعايرات القياسية في خريطة اللوحة هذه. انظر الشكل 5 للحصول على مثال.

9. قياس التعبير الجيني باستخدام تقنية qPCR الموائع الدقيقة

ملاحظة: في كل خطوة من هذه القسم، استخدم الماصة حتى التوقف الأول فقط لتقليل تكوّن الفقاعات في الكواشف.

  1.  افتح صفاً مكوناً من 8 أنابيب PCR. وفي حال وجود عدة ألواح من العينات، افتح صفاً ثانياً من 8 أنابيب PCR وقم بترقيم الأنابيب من 1 إلى 8؛ حيث سيُخصص هذا الصف لتجميع المعايير من ألواح متعددة.
  2. في أنبوب سعة 1.5 ml، اخلط 360 µl من المزيج الرئيسي لـ qPCR بصبغة ربط DNA مع 36 µl من كاشف تحميل العينة بصبغة ربط DNA. قم بالرج بجهاز vortex لفترة وجيزة ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 sec بسرعة 2,000 x g. وزع هذا الخليط (396 µl) على الصف غير المرقم من أنابيب PCR الثمانية، بمعدل 48 µl في كل أنبوب.
  3. باستخدام ماصة ذات 8 قنوات، وزع 3.3 µl من خليط المزيج الرئيسي وكاشف تحميل العينة في كل بئر من ألواح PCR الجديدة ذات 96 بئراً. ضع ملصقاً على هذا اللوح باسم "خلطات العينات" (Sample Mixes).
  4. لكل لوح PCR من العينات:
    1. رج اللوح بجهاز vortex لمدة 10 sec ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 sec بسرعة 500 x g. انزع الغطاء وانقل 2.7 µl من كل عينة خلية واحدة موجبة إلى البئر المقابل لها في لوح "خلطات العينات" وفقاً لآبار الخلية الواحدة المحددة في خريطة اللوح.
    2. إذا كان هناك لوح واحد فقط من العينات، فانقل 2.7 µl من كل معيار مضخم إلى البئر المقابل له في لوح "خلطات العينات" وفقاً لخريطة اللوح.
    3. إذا كانت هناك ألواح متعددة من العينات، فانقل 2.7 µl من كل معيار مضخم إلى موضعه المقابل في الصف المرقم من أنابيب PCR. أضف المعايير من لوح العينات الحالي إلى أي معايير موجودة مسبقاً. عند الانتهاء، قم بإغلاق لوح العينات باستخدام غشاء إحكام.
  5. في حال وجود ألواح متعددة من العينات:
    1. رج صف أنابيب PCR التي تحتوي على المعايير بجهاز vortex لمدة 10 sec ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 sec بسرعة 2,000 x g. انقل 2.7 µl من كل أنبوب من المعايير المختلطة إلى البئر المقابل في لوح "خلطات العينات" وفقاً لخريطة اللوح.
  6. املأ آبار NTC بـ 2.7 µl من الماء الخالي من النوكلياز حيثما هو محدد في خريطة اللوح. أغلق لوح "خلطات العينات" بإحكام واحفظه في درجة حرارة 4 °C حتى وقت الحاجة.
  7. انزع الملصق من الجزء السفلي لشريحة qPCR مائعية دقيقة (microfluidic) جديدة. وباستخدام حقنة تحتوي على سائل خط التحكم مع إبقاء الغطاء عليها، اضغط لأسفل على كل نابض مجمع لفك إحكامه، ثم احقن كل مجمع بـ 150-200 µl من سائل خط التحكم.
  8. أدخل الشريحة في آلة التحميل وقم بتشغيل نص "التحضير" (Prime). تستغرق هذه العملية حوالي 20 min.
  9. عند انتهاء التحضير، قم برج ألواح خلطات المقايسة (التي تم تحضيرها في الخطوة 1.6) وخلطات العينات بجهاز vortex ثم قم بالطرد المركزي لترسيب المحتويات.
  10. باستخدام ماصة ذات 8 قنوات، انقل 4.5 µl من كل خلطة مقايسة إلى الجانب الأيسر من شريحة qPCR المائعية الدقيقة وفقاً للمخطط الموضح في الشكل 6. استخدم الماصة بحذر شديد لتجنب تكوين فقاعات هوائية في قاع الآبار. عند الانتهاء، أغلق لوح خلطات المقايسة بإحكام واحفظه في درجة حرارة -20 °C للاستخدام المستقبلي.
  11. انقل 4.5 µl من كل خلطة عينة إلى الجانب الأيمن من شريحة qPCR المائعية الدقيقة وفقاً لـ الشكل 6. أدخل الشريحة في آلة التحميل وقم بتشغيل نص "تحميل الخليط" (Load Mix). تستغرق هذه العملية حوالي 90 min.
  12. قم بتشغيل آلة PCR المائعية الدقيقة في الوقت الحقيقي، وابدأ برنامج جمع البيانات، وقم بتشغيل المصباح لتسخينه. تستغرق هذه العملية حوالي 20 min.
  13. عند انتهاء نص "تحميل الخليط"، تأكد من عدم وجود خطوط عرضية في الشريحة، لأن ذلك يشير إلى وجود مشكلة في التحميل. قم بإزالة أي جزيئات غبار من الشريحة بعناية باستخدام شريط لاصق (Scotch tape) أو شريط مختبري. أدخل الشريحة في آلة PCR المائعية الدقيقة في الوقت الحقيقي وقم بتشغيل نص جمع البيانات. استخدم برنامج التحليل لفحص النتائج وتصدير البيانات لإجراء مزيد من التحليل.

10. تحليل البيانات

  1. استبعد القياسات التي تظهر فيها منحنيات تضخيم qPCR جودة رديئة (أي،، والتي لا تشبه فيها المنحنيات منحنى التضخيم السيني القياسي)20.
  2. استبعد العينات التي تحتوي على أكثر من 30 قياساً ذا جودة رديئة أو قياسات صفرية، أو التي يكون فيها تعبير الجين المرجعي (انظر الخطوة 1.1) أقل بكثير من غالبية العينات الأخرى (الشكل 7).
  3. لكل جين، قم بتقدير الموقع الصحيح لذروة الانصهار باعتباره الوسيط لمواقع ذروة الانصهار من كل عينة. إذا كان هناك قياس يحتوي على ذروة انصهار تقع على مسافة تزيد عن 1 °C من الوسيط، استبعد ذلك القياس من الاعتبار20.
  4. قم بإنشاء منحنى قياسي لكل جين لتقدير عدد جزيئات mRNA في كل عينة باستخدام جدول بيانات أو لغة برمجة.20.
    ملاحظة: تتكون المعايير في هذه التجربة من 10 أو 100 أو 1,000 أو 10,000 جزيء من الـ dsDNA المقابل لكل نسخة نسخ (transcript) مستهدفة. ولو كانت عملية النسخ العكسي ذات كفاءة تامة، لكانت المعايير تعادل 20 و200 و2,000 و20,000 جزيء من الـ mRNA، بما أن الـ mRNA والـ cDNA أحاديي السلسلة. ولكن من الناحية العملية، ليس الأمر كذلك، لذا نعبر عن القياسات كتقدير بوحدات جزيء × E.نسخ عكسي، حيث Eتفاعل السلسلة البوليميريزية العكسي كفاءة النسخ العكسي.
    1. لكل بئر قياسي، حدد م، وعدد جزيئات الحمض النووي أحادي الخيط ssDNA (ضعف عدد جزيئات الحمض النووي مزدوج الخيط dsDNA) قبل التضخيم (على سبيل المثال، 20 جزيئاً، 200 جزيء، إلى آخره.).
    2. لكل بئر قياسي، حدد الـ سيت القيمة المستمدة من تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)20.
    3. باستخدام قيم م و كربونتـ، قم بإجراء تحليل انحدار خطي باستخدام المعادلة التالية لإنشاء منحنى قياسي يتضمن المعلمات a و b لكل جين، وإيجاد الـ R2 القيمة كمؤشر على جودة المطابقة:
      صيغة التوازن الساكن، Ct=a ln(m)+b، مخطط للبحث التعليمي حول المفاهيم اللوغاريتمية.
    4. احسب كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من المنحنى القياسي. هـ لكل جين:
      معادلة توضح الدالة الأسية، E = e^(1/a) - 1، مفهوم رياضي.
      ملاحظة: قيمة الـ هـ أكبر بكثير من 1.0 (على سبيل المثال، هـ > 1.1) غير واقعي من الناحية الفيزيائية؛ و R2 قيمة الانحدار الخطي أقل بكثير من 1.0 (على سبيل المثال، R2 < (0.985) تعني أن المعايير لا تعمل بشكل موثوق. تشير هذه المشكلات عموماً إلى أن أدنى معيار لنتائج التضخيم يقل عن عتبة القياس الكمي الموثوق، وبالتالي يجب استبعاد المعيار الأدنى من الانحدار الخطي. وإذا تعذر إجراء انحدار خطي ملائم باستخدام ثلاثة معايير فريدة على الأقل، يتم التخلص من قياسات التعبير الجيني لهذا الجين.
    5. إذا كان الانحدار الخطي ملائماً، فاستخدم معاملات الملاءمة الناتجة. a و b لكل جين لتقدير عدد جزيئات الـ mRNA ميرجى تزويدي بالنص المراد ترجمته. (بوحدات جزيئات × Eتفاعل النسخ العكسي) للجين المقابل في كل عينة خلية واحدة من العينات المقاسة سيتـ القيمة:
      معادلة الاضمحلال الأسي، \(m_{est} = e^{\frac{c_{t}-b}{a}}\)، صيغة رياضية.
    6. حدد أي قياس mيُرجى تقديم النص المراد ترجمته. < ١ كما مترتقدير = 0. كما يجب تحديد أي قياس لم يحدث فيه تضخيم في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، وبالتالي لا يوجد سيت قيمة كـ متأكيد = 0.
      ملاحظة: القياسات التي تحتوي على مـتقدير يتم إيجاد القيم التي تكون أقل من أدنى معيار أو أعلى من أقصى معيار مستخدم في تحليل الانحدار عن طريق الاستقراء الخارجي من المنحنى القياسي. ولا تُعد هذه التقديرات بالضرورة غير صالحة، ولكن يجب التعامل معها بحذر.
  5. تَصوُّر بيانات التعبير الجيني للخلية الواحدة.
    1. قم بإنشاء مخطط سرب النحل (beeswarm plot) (Dorn, J. and Holy, T., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/37105) بحيث تمثل كل نقطة التعبير الجيني في خلية معينة؛ ويظهر مثال على ذلك في الشكل 8.
    2. قم بإنشاء مخطط كمان (Dorn, J., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661) يمثل فيه عرض "الكمان" تكرار قياسات التعبير الجيني حول مستوى معين في مجموعة الخلايا التي تم تحليلها؛ ويظهر مثال على ذلك في الشكل 8.
      ملاحظة: يمكن للتحليلات الأكثر تطوراً استقصاء علاقات التعبير بين أزواج من الجينات21,22 ويمكن استنتاج شبكات التعبير الجيني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يظهر عرض عام للبروتوكول في الشكل 1، بما في ذلك خطوات معالجة الخلايا، وعزل الخلايا المفردة بواسطة FACS، وتوليد وتضخيم أولي لمكتبات cDNA من نواتج تحلل الخلايا المفردة، والتأكد من مكتبات cDNA للخلايا المفردة في الآبار التي تم فرزها، وقياس التعبير الجيني بواسطة qPCR.

تمهيداً لعزل الخلايا المفردة وتحليل التعبير الجيني، من الضروري أولاً تحديد أزواج بادئات قليلة النوكليوتيد (oligonucleotide primer pairs) صالحة لكل جين ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لقد قدمنا طريقة لعزل خلايا الثدييات الفردية عن مجموعة من الخلايا الملتصقة المزروعة في المزرعة ولفحص التعبير عن ما يقرب من 96 جينا في كل خلية. يعد التحضير المسبق الجيد أمرا بالغ الأهمية حتى تعمل هذه الطريقة بشكل جيد. على وجه الخصوص ، يعد تصميم واختبار أزواج التمهيدي الخاصة بالنصوص ذات الأهمية (الخطوات 1.2-1.3) خطوات تستغرق وقتا طويلا ولكنها مهمة ، حيث تحدد البادئات جودة قياسات الخلية الواحدة. بمجرد الحصول على أزواج أولية موثوقة ، يتم استخدامها لتضخيم (كدنا) من النصوص ذات الأهمية. ثم يتم دمج الأمبليكونات معا بكميات متساوية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نود أن نشكر V. Kapoor في CCR ETIB Flow Cytometry Core لمساعدتها في إجراء فرز الخلايا أثناء تطوير هذا البروتوكول. كما نشكر M. Raffeld ووحدة التشخيص الجزيئي CCR LP و J. Zhu و NHLBI DNA Sequencing and Genomics Core لمساعدتهم في إجراء qPCR أثناء تطوير هذا البروتوكول. تم دعم هذا البحث من قبل البرنامج الداخلي للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة RNeasy Plus MiniQiagen74134
طقم نسخ عكسي عالي السعة من cDNA مع مثبط RNaseThermoFisher4374966
Phusion بوليميراز الحمض النووي عالي الدقةنيو إنجلاند BioLabsM0530S
QIAquick Gel ExtractionKit Qiagen28704
Quant-iT طقمفحص dsDNA عالي الحساسيةThermoFisherQ33120 
2.0 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الالتصاق الولاياتالمتحدة الأمريكية العلمية1420-2600
DNA تعليق العازلةTeknovaT0221
Axygen 0.2 مل Maxymum Recovery رقيقة الجدار أنابيب PCR CorningPCR-02-L-C
GE 96.96 صفيف ديناميكي DNA ملزمة صبغ عينة & ; طقم كاشف تحميل الفحصFluidigm100-3415
HyClone RPMI 1640 mediaGE Healthcare LifeSciences SH30027.01
مصل بقري للجنين ، معتمد (الولايات المتحدة)ThermoFisher16000-044
محلول مضاد للمضادات الحيوية ومضاد للفطرياتCorning30-004-CI
NeocarzinostatinSigmaN9162
ELIMINaseDecon Labs1101
SUPERase-InThermoFisherAM2696
CellsDirect طقم qRT-PCR بخطوةواحدة ThermoFisher11753500
E. القولوني< / em> DNAAffymetrix14380 10 MG
فيلم ختم حراري ، معقمإكسل علميSTR-THER-PLT
BD FACSAria IIuBD العلوم البيولوجية
HyClone Trypsin 0.05٪GE Healthcare LifeSciences SH30236.01
PBS ، 1xCorning21-040-CV
Falcon 40 & micro ؛ m Cell StrainerCorning352340
Exonuclease INew England BioLabsM0293S
SsoFast EvaGreen Supermix مع ROXBio-Radمنخفض 172-5210
96.96 مصفوفة ديناميكية IFC للتعبير الجيني (رقاقة qPCR الموائع الدقيقة)FluidigmBMK-M-96.96
وحدة تحكم IFC HX (آلة التحميل)Fluidigm
BioMark أو BioMark HD (آلة qPCR microfluidic) برنامجالحقيقي Fluidigm
  ؛Fluidigm
MATLABMathWorks
Kit تحليل PCR في الوقت برنامج

المراجع

  1. Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
  2. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  3. Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).
  4. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
  5. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
  6. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4 (10), e309+(2006).
  7. Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
  8. Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+(2015).
  9. Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).
  10. Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
  11. Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).
  12. Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).
  13. Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).
  14. Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).
  15. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13 (1), 134(2012).
  16. PCR Technologies: A Technical Guide. , Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).
  17. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  18. Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).
  19. Flow Cytometry: Principles and Applications. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
  20. Real-time PCR. , Taylor & Francis. (2006).
  21. Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13 (1), 328(2012).
  22. Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).
  23. Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).
  24. Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77(2016).
  25. Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).
  26. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  27. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
  28. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

FACS RT STA I
وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.