مقالة منهجية

تحليل فصل الكروموسوم، هيستون أستيلاتيون، و مورفولوجيا المغزل في البويضات الحصان

DOI:

10.3791/55242

⸱

مايو 11, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Health, Animal Science and Food Safety, University of Milan, 2IRCCS. Istituto Ortopedico Galeazzi, 3PRC, CNRS, IFCE, Université de Tours, INRA, 4PAO, INRA, 5Clinique des Animaux de Compagnie et des Équidés, Université de Liège, 6University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Cluj-Napoca, Romania

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المخطوطة نهجا تجريبيا لتوصيف البويضات الحصانية شكليا وبيولوجيا كيميائيا. على وجه التحديد، ويوضح العمل الحالي كيفية جمع البويضات الحصان غير ناضجة وناضجة عن طريق الموجات فوق الصوتية الموجهة البيك البيك اب (أوبو) وكيفية التحقيق الفصل الكروموسوم، مورفولوجيا المغزل، هيستون العالمية هيستيون، والتعبير مرنا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تطوير مجال المساعدة على الإنجاب لعلاج العقم لدى النساء والحيوانات المصاحبة والأنواع المهددة بالانقراض. في الحصان، كما يسمح الاستنساخ بمساعدة لإنتاج الأجنة من الأداء العالي دون انقطاع حياتهم الرياضية ويسهم في زيادة في عدد من المهرات من الفرس ذات القيمة الوراثية العالية. يصف المخطوطة الحالية الإجراءات المستخدمة لجمع البويضات غير الناضجة والناضجة من المبيض الحصان باستخدام البيضة البيك اب (أوبو). ثم استخدمت هذه البويضات للتحقيق في حدوث أنيوبلوادي عن طريق تكييف بروتوكول وضعت سابقا في الفئران. على وجه التحديد، كانت الكروموسومات و سينتروميرس من الطور الثاني البويضات (مي) فلورزنتلي المسمى وتحسب على خطط التنسيق متتابعة بعد متحد البؤر المجهر ليزر المسح الضوئي. وكشف هذا التحليل عن حدوث أعلى في معدل أنيوبلوادي عندما تم جمع البويضات غير ناضجة من المسام ونضجت في المختبر مقارنة معفي الجسم الحي. المناعية للأنبوبين وشكل أستيل من هيستون أربعة في مخلفات يسين محددة كشفت أيضا الاختلافات في مورفولوجيا المغزل الانتصافي وفي النمط العالمي من أستيون هيستون. وأخيرا، تم التحقيق في التعبير عن ترميز مرناس لهستون ديستيلاسيس (هداس) وأسيتيل-ترانسفاسيس (هاتس) عن طريق النسخ العكسي والكمي ير (ف ير). لم تلاحظ أي اختلافات في التعبير النسبي للنصوص بين في المختبر وفي الجسم الحي نضجت البويضات. في اتفاق مع إسكات العام للنشاط النسخي خلال النضج البويضة، وتحليل مجموع المبلغ نص يمكن أن تكشف فقط استقرار مرنا أو تدهور. ولذلك، فإن هذه النتائج تشير إلى أن الأنظمة الأخرى متعدية وبعد متعدية قد تتأثر.

وعموما، فإن هذه الدراسة تصف نهجا تجريبيا ل مورفولوجيا و بيوشيميكالي وصف بويضة الحصان، و سيليرة لبنانية نوع من الصعب للغاية لدراسة بسبب انخفاض توافر عينة. ومع ذلك، فإنه يمكن توسيع معرفتنا على البيولوجيا التناسلية والعقم في الأنواع أحادي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تطوير مجموعة واسعة من تقنيات المساعدة على الإنجاب لعلاج العقم لدى النساء والحيوانات المصاحبة والأنواع المهددة بالانقراض. واحدة من الإجراءات الأكثر شيوعا في البيئات السريرية هو استرجاع الطور الثاني (مي) البويضات -stage من الجريبات المبيض عن طريق الموجات فوق الصوتية الموجهة المهبل المهبل، البيضاوي البيك اب (أوبو) 1 . ثم يتم تسميد هذه البويضات في المختبر (إيف)، مع الجنين الناتجة (ق) زرعها في الرحم المستلم. يتم استرجاع البويضات مرحلة مي (ناضجة) بعد إدارة الغدد التناسلية الخارجية. ومع ذلك، يرتبط هذا العلاج، في بعض المرضى، مع تطور متلازمة فرط المبيض (أوهس) 2 .

الاستفادة من القدرة الذاتية من نمت بشكل كامل، البويضات غير ناضجة (GV- مرحلة) لاستئناف عفوية الانقسام الاختزالي مرة واحدة معزولة عن بصيلاتهم، فمن الممكن الحصول على البويضات ناضجة دون أدمينيستيرون الغدد التناسلية 3 . ويسمى هذا الإجراء البويضات في النضج المختبر (إيفم) ويمثل أقل موجهة نحو المخدرات، وأقل تكلفة، وأكثر ملاءمة للمريض نهج لمساعدة التكنولوجيا الإنجابية. ومع ذلك، فإن نجاح تطوير الجنين مع البويضات في المختبر -matured أقل عموما من مع في الجسم الحي نضجت البويضات 4 ، 5 . تفسير محتمل هو أن في المختبر نضجت البويضات هي أكثر تضررا من الأخطاء في الفصل الكروموسوم، و أنيوبلوادي يؤدي إلى إعاقة التطور الجنيني الطبيعي 6 .

وفهم الأساس الجزيئي من الكروموسومات سوء الفصل أثناء إيفم الكشف في نهاية المطاف عن الإمكانات الكاملة لهذه التقنية. في هذا السياق، استخدم المنهج التجريبي للتحقيق في السمات المورفولوجية والبيوكيميائية للبويضات في المختبر -mureded، مقارنة مع في الجسم الحي نضجيتم وصف البويضات إد هنا 7 ، 8 . على وجه التحديد، يتم توضيح إجراءات ل أوبو من البويضات غير ناضجة وناضجة و إيفم من البويضات غير الناضجة باستخدام الخيول الكبار والطبيعة بشكل طبيعي كنموذج تجريبي. ثم، يتم استخدام المناعي وتحليل الصورة للتحقيق الكروموسوم الفصل، مورفولوجيا المغزل، والنمط العالمي من أستيون هيستون على هذه غاميتس. وأخيرا، وصف بروتوكول من النسخ العكسي وكمية ير لتحليل التعبير مرنا.

وبالمقارنة مع النماذج الحيوانية القوارض، والخيول لا تسمح التلاعب الجيني، هي أقل سهولة للتلاعب، وتتطلب صيانة باهظة الثمن. ومع ذلك، فإن هذا النموذج يكتسب اهتماما كبيرا لدراسة النضج البويضة 9 ، 10 بسبب تشابه لعلم وظائف الأعضاء المبيض الإنسان 11 ، 12 </ سوب>. وعلاوة على ذلك، فإن وضع بروتوكولات موثوقة من إيفم-إيف في الحصان له مصلحة اقتصادية كبيرة، لأنها تسمح لزيادة في عدد من المهرات من الفرس من القيمة الجينية العالية.

واحدة من القيود المفروضة على إجراء التجارب على البويضات، وخاصة في الأنواع أحادي، هو توافر عينة مقيدة. وقد تم التغلب على هذا الحد هنا عن طريق تعديل نهج، وضعت سابقا في الفئران، لبويضات الحصان 13 ، 14 من أجل إجراء العد الكروموسوم الذي يقلل من فقدان العينة (انظر المناقشة للمقارنة مع التقنيات المتاحة الأخرى). وعلاوة على ذلك، تم تحسين بروتوكول تلطيخ الثلاثي مضان لإجراء تحليلات متعددة على نفس العينة، وأجريت التحليلات q- ير على برك من 2 البويضات فقط.

وعموما، فإن هذه الدراسة تصف نهجا تجريبيا يهدف إلى تشورفيا و تشيميا كيميائياراكتريز البويضة الحصان، وهو نوع من الخلايا التي هي صعبة للغاية للدراسة بسبب توفر عينة منخفضة. ومع ذلك، فإنه يمكن توسيع معرفتنا في البيولوجيا التناسلية والعقم من الأنواع أحادي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامها سييا فال دي لوير رقم 19 وتم تنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. جمع البويضات والنضج في المختبر

  1. البيضة البيك اب
    1. تقييم يوميا عن طريق الموجات فوق الصوتية قطر بصيلات المبيض في فوج من فرس الكبار. في ظهور بصيلات ≥33 مم (الجريب المهيمن)، حقن الفرس مع 1500 وحدة دولية من الغدد التناسلية المشيمية البشرية (قوات حرس السواحل الهايتية) في الجزء العلوي من الوريد الوداجي (الرابع).
      1. قبل تنفيذ الحقن، مسحة المنطقة مع الكحول، حدد ثقب الوداجي، ووضع الإبهام 2-3 سم تحت موقع الحقن للحث على الوريد في الارتفاع. إدراج الإبرة موازية تقريبا على الرقبة ونضح للتأكد من أن الإبرة في الوريد (الدم سوف يدخل حقنة). عند هذه النقطة، حقن. هغ سوف تحفز متشبع البويضة في الجريب المهيمنة.
    2. 35 ساعة بعد الحقن هغ، رزين الفرس مع ديتوميدين (15 ميكروغرام / كغ، الرابع)، طرطرات بوتورفانول (10 ميكروغرام / كغ، الرابع) و بروميل بوتيلسكوبولامين (0.2-0.3 ملغ / كغ، 15 مل / فرس، 4).
    3. ربط الإبرة إلى الموجات فوق الصوتية التحقيق. إدراج الموجات فوق الصوتية التحقيق عن طريق المهبل وعقد المبيض ترانزريكتالي لمواجهة الموجات فوق الصوتية التحقيق. توجيه مشغل واحد للمناورة الإبرة والآخر لعقد المبيض في المكان، مع بصيلات تواجه مسبار الموجات فوق الصوتية . تبدأ من المبيض مع بصيلات المهيمنة.
    4. ثقب الجدار المهبلي وجدار الجريب المهيمن مع الإبرة (مجسات الموجات فوق الصوتية ل أوبو مجهزة قناة للإبرة متصلة بنظام الشفط). سوف ينيدل تكون مرئية في الصورة إكوغرافيك.
    5. نضح السوائل الجريبي في أنبوب مخروطي 50 مل متصلة بنظام الشفط. صب محتوى المخروطيةأنبوب إلى طبق بتري كبير والبحث عن مجمع البويضة المركب (كوك) باستخدام ستيريوميكروسكوب.
    6. منذ كوك لا يتم استرجاعها دائما مع السائل الجريبي، مسح بصيلات مع المالحة المعدلة الفوسفات المالحة المالحة (دبس) التي تحتوي على 5 إيو / مل هيبارينات 37 درجة مئوية. فحص دبس لوجود كوك، كما هو موضح سابقا للسائل الجريبي في الخطوة 1.1.5. تدفق عدة مرات حتى يتم استرداد كوك.
    7. مرة واحدة يتم استرداد كوك من الجريب المهيمن، ثقب ومسح بصيلات ≥5 و ≤25 مم، كما هو موضح للجريب المهيمن في الخطوات 1.1.3-1.1.4. الجريبات ≥5 و ≤25 لا تعبر عن هرمون لوتينيزينغ / كوريوغونادوتروبين مستقبلات (لغر)، وبالتالي، فإن البويضات لا تنضج ردا على قوات حرس السواحل الهايتيه وسيتم جمعها في مرحلة غف (غير ناضجة). تبقي فقط كوك مع عدة طبقات كاملة من الخلايا الركام والبني، والبلازما حبيبات ناعما. تجاهل الآخرين.
    8. في نهاية أوبو، فيجيكت الفرس مع البنزيل والبنسلين 15،000 وحدة دولية / حيوان لمنع العدوى.
    9. منزل الفرس في هادئة ونظيفة مستقرة لمدة لا تقل عن 2 ساعة. تحقق علامات الوعي من خلال تحديد موقف الأذنين، رد فعل على المحفزات (على سبيل المثال، الضوضاء)، والمشية قبل أن يعود الفرس إلى الشركة من الحيوانات الأخرى.
  2. النضج في المختبر
    1. (HM120) هيبس هيومان، هيبارين، و 0.4٪ من ألبومين المصل البقري (بسا)، والبنسلين، والستربتومايسين إلى 37 درجة مئوية. إعداد هذه الوسيلة مقدما. تصفية تعقيم والحفاظ عليه في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    2. إعداد المتوسطة إيفم عن طريق استكمال ناهكو 3- مخزنة TCM199 (25 ملي ناهكو 3 ) مع 50 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (إغف) و 20٪ مصل العجل 7 . استخدام ناهكو 3- مخزنة TCM199 في غضون 3 أسابيع من فتح زجاجة جديدة. إعداد إغف مقدما كما الأسهم 100X، وتجميده في -20 درجة مئوية، واستخدامه في غضون 6 أشهر. الاستغناء 500 ميكرولتر في آبار طبق 4-جيدا واحتضان في الهواء ترطيب مع 5٪ كو 2 في 38.5 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل.
    3. بعد استرجاع كوك من الجريبات ≥5 و ≤25 ملم، ووضعها في طبق بتري (قطرها 3.5 سم) مليئة 2 مل من هيبيس-TCM199. نقل كوك إلى مناطق مختلفة من الطبق من أجل غسل الحطام الخلوي.
    4. نقل كوك إلى الوسط إيفم واحتضان لمدة 28 ساعة في الهواء ترطيب مع 5٪ كو 2 في 38.5 درجة مئوية.

2. المناعي وتحليل الصورة

  1. كروموسوم العد
    1. بعد جمع من بصيلات المهيمنة أو في نهاية إيفم، احتضان كوك مع 100 ميكرومتر موناسترول لمدة 1 ساعة في الهواء مرطب مع 5٪ كو 2 في 38.5 درجة مئوية. إعداد موناسترول مقدما كما 100x الأسهم وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
    2. إزالة الخلايا الركامعن طريق معاملتها مع 0.5٪ هيالورونيداز أو بيبتينغ بلطف؛ إزالة زونا بلوسيدا عن طريق معالجته في 0.2٪ بروناز. إعداد هيالورونيداز وبروناز مقدما كما 10X الأسهم وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
    3. إصلاح البويضات في بارافورمالدهيد 4٪ في دبس لمدة 15 دقيقة في 38.5 درجة مئوية تليها 45 دقيقة أخرى في 4 درجات مئوية.
      الحذر! ارتداء معدات الوقاية الشخصية عند التعامل مع بارافورمالدهيد، والتخلص من المواد الملوثة وفقا للمبادئ التوجيهية للتخلص من النفايات الخطرة.
    4. غسل البويضات عن طريق نقل بالتتابع في 3 آبار مليئة 500 ميكرولتر من دبس تستكمل مع 0.1٪ كحول بولي فينيل (بفا). بيرمابيليز في 0.3٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (رت).
    5. كتلة غير محددة بيندينغبلي الحضانة في دبس تستكمل مع 1٪ ألبومين المصل البقري (دبس-1٪ بسا) و 10٪ مصل حمار العادي لمدة 30 دقيقة على الأقل في رت. يمكن أن تبقى العينات في حجب الحل في 4 درجات مئوية لمدة 3-4 أيام.
    6. لالتلطيخ الأولية، واحتضان البويضات في أرنب مكافحة أورورا B فوسفو-Thr232 في دبس تستكمل مع 1٪ بسا (التخفيف 1:50) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    7. غسل البويضات كما هو موضح في الخطوة 2.1.4. احتضان البويضات في حل من تيترا-ميثيلرهودامين إيسوثيوسيانات (تريتك) -conjugated حمار المضادة للأرنب مفتش (1: 100 في دبس-1٪ بسا) لمدة 1 ساعة في رت في الظلام.
    8. غسل البويضات كما هو موضح في الخطوة 2.1.4، ومن ثم وضع 3-4 البويضات في قطرة من غير تصلب، ومكافحة تتلاشى تصاعد المتوسطة تستكمل مع 20 ميكرومتر YOPRO1 على شريحة زجاجية. كرر الإجراء حتى يتم تركيب جميع البويضات (3-4 البويضات في الشريحة).
    9. السماح للبويضات لتسوية لمدة 10 دقيقة في وسط تصاعد، ومن ثم تغطيتها مع ساترة. لتجنب سحق البويضات، وتطبيق شرائط اثنين من الشريط على الوجهين قبل وضع ساترة على الشريحة الزجاجية.
      ملاحظة: هذا الاحتياط سوف تضمن أيضا أن جميع العينات على حد سواء مضغوط بين الزجاج سليدي و ساترة. يمكن تجميد الشرائح الزجاجية في -20 درجة مئوية وتصوير خلال 2-3 أيام التالية.
    10. صورة العينات على متحد البؤر المجهر المسح بالليزر مع هدف 60X باستخدام الأحمر (سينتروميرس) والأخضر (الكروموسومات) قنوات 7 ، 13 ، 14 ، 20 ، 21 . مسح العينات التي تغطي لوحة ميتافاسيك كله على محور Z، مع خطوات كل 0.35 ميكرون. حفظ الصور الرقمية من كل خطة واحدة.
    11. عد سينتروميرز في المقاطع متحد البؤر التسلسلية باستخدام وظيفة العد الخلية من برنامج نيه إيماجيج (متوفر في: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
      ملاحظة: تجنب عدد المتكررة من سينتروميرز التي تظهر على الأقسام المجاورة عن طريق تحديد سينتروميرز التي تظهر، والبقاء، وتختفي في أقسام متتابعة مع رمز رقمي.
    12. كرر شركة الكروموسوماتفي الخطوة 2.1.11 مع مشغل مستقل.
      ملاحظة: تصنيف البويضات كما وبلويد (32 الكروموسومات)، فرط (32)، أو نقص الصيغة الصبغية (<32).
  2. المغزل مورفولوجيا و هيستون أستيلاتيون
    1. بعد جمع من بصيلات المهيمنة أو في نهاية إيفم، وإزالة الخلايا الركام عن طريق العلاج في 0.5٪ هيالورونيداز أو عن طريق بيبتينغ لطيف، كما هو موضح في الخطوة 2.1.2.
    2. غسل البويضات في دبس-بفا، كما هو الحال في الخطوة 2.1.4، وإصلاحها في بارافورمالدهيد 2.5٪ لمدة 20 دقيقة في 38 درجة مئوية. يغسل على نطاق واسع، كما هو موضح في الخطوة 2.1.4، و بيرمابيليز في 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق في رت.
      ملاحظة: ارتداء معدات الوقاية الشخصية عند التعامل مع بارافورمالدهيد والتخلص من المواد الملوثة وفقا للمبادئ التوجيهية للتخلص من النفايات الخطرة.
    3. كتلة غير محددة بيندينبي حضانة في دبس تستكمل مع 2٪ ألبومين المصل البقري (دبس - 2٪ بسا)، 0.05٪ سابونين، و 10٪ مصل حمار العادي فوr 2 h في رت.
      ملاحظة: يمكن أن تبقى العينات في حجب الحل في 4 درجات مئوية لمدة 3 - 4 أيام.
    4. لالتلطيخ الابتدائي، واحتضان البويضات في الماوس مكافحة ألفا توبولين (1: 150) والأرنب المضادة acH4K16 (1: 250) في دبس-2٪ بسا مع 0.05٪ سابونين في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    5. غسل البويضات كما هو الحال في الخطوة 2.1.4. احتضان البويضات في حل من الأخضر الفلورسنت صبغ مترافق حمار المضادة للماوس مفتش (1: 500) والحمر مترافق مع حمار المضادة للأرنب مفتش (1: 100) في دبس-2٪ بسا مع 0.05٪ سابونين لمدة 1 ساعة في رت في الظلام.
    6. غسل البويضات كما هو الحال في الخطوة 2.1.4، ومن ثم وضع 3-4 البويضات في قطرة من غير تصلب، ومكافحة تتلاشى تصاعد المتوسطة تستكمل مع 1 ميكروغرام / مل 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (دابي) على شريحة زجاجية.
    7. جبل البويضات على الشرائح الزجاجية كما هو موضح في الخطوة 2.1.8.
    8. صورة العينات على متحد البؤر المجهر المسح بالليزر مع هدف 60X باستخدام الأحمر (acH4K16) والأخضر (ألفا-توبولين)، والأزرق (دنا) القنوات.
      ملاحظة: حافظ على إعدادات الليزر للقنوات الحمراء والزرقاء ثابتة في جميع أنحاء الاستحواذ على جميع العينات. مسح العينات التي تمتد المغزل ميتوتيك كله و لوحة ميتافاسيك على المحور Z، مع خطوات كل 0.35 ميكرون. حفظ الصور الرقمية (خطط واحدة وصورة 3D المتوقعة).
    9. قياس طول القطب إلى القطب المغزل وقطر المغزل في الحد الأقصى للعرض على الصورة المعروضة باستخدام وظيفة قياس برنامج نيه إيماجيج (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30 هتمل). كرر كل 3 مرات وحساب المتوسط.
    10. تحديد مضان النسبية من acH4K16 باستخدام وظيفة كثافة متكاملة من نيه إيماجيج البرمجيات (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). تطبيعه لكثافة متكاملة من تلطيخ دابي.

3. تحليل التعبير مرنا

  1. بعد أن تم استرجاع مركبات كوك من الجريبات 5 إلى 25 ملم، وجمع الخلايا الحبيبية قأوسبنسيون التي بقيت في طبق بتري وغسله مرتين في دبس الباردة عن طريق الطرد المركزي في 10600 x ج لمدة 2 دقيقة. تجميد المفاجئة في النيتروجين السائل. تخزين العينات في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. فإن الخلايا تخدم لمنحنى القياسية.
  2. إزالة بعناية جميع الخلايا الركام، كما هو موضح في الخطوة 2.1.2، من غير ناضجة (غف)، في المختبر نضجت، وفي الجسم الحي نضجت البويضات.
  3. غسل البويضات، كما هو موضح في 2.1.4، في دبس-بفا، وجمعها منفردة في 1 وحدات التخزين ميكرولتر، ووضع 2 ميكرولتر رنالاتر على القمة. المفاجئة تجميد في النيتروجين السائل. تخزين العينات في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  4. إضافة 2 خريج من الحمض النووي الريبي لوسيفيراس إلى كل عينة كما ارتفاع في. تجمع البويضات 2 × 2 واستخراج الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مجموعة غشاء السيليكا القائم على فلتر مناسبة لاستعادة الحمض النووي الريبي من عينات صغيرة.
  5. عكس نسخ الحمض النووي الريبي في 10 ميكرولتر مع 0.25 ميكروغرام هيكسامرز عشوائية والفأر مولوني فيروس سرطان الدم النسخ العكسي ترانسكريبتاس لمدة 1 ساعة في 37 و # 176، C. تخزين العينات في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  6. تمييع [كدنا] من الخلايا الحبيبية في المياه خالية من ريبونوكلياز إلى 50 نانوغرام / ميكرولتر. تمييع متسلسل هذا الحل 1:10 للحصول على 5 نانوغرام / ميكرولتر، 0.5 نانوغرام / ميكرولتر، 0.05 نانوغرام / ميكرولتر، و 0.005 نانوغرام / ميكرولتر الحلول.
  7. تجميع ردود الفعل في ثلاث نسخ في حجم ما مجموعه 20 ميكرولتر لكل رد فعل باستخدام كدنا يعادل 0.05 البويضات كما الركيزة، أو 5 ميكرولتر من التخفيفات المسلسل من كدنا الخلية غرانولوسا، 10 ميكرولتر من سبرميكس الأخضر سيبر، و 0.3 ميكرومتر من كل التمهيدي محددة ( الجدول 1 ).
  8. تشغيل رد فعل في سيكلر الحرارية باستخدام بروتوكول 3 خطوات: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، وكرر 40 مرة. وأخيرا، والحصول على منحنى ذوبان، بدءا من 60 درجة مئوية، وزيادة درجة الحرارة بنسبة 0.5 درجة مئوية كل 20 ثانية تصل إلى 95 درجة مئوية.
  9. تقييم كمية البداية (سك) من مرنا محددة في عينات البويضة باستخدام منحنى القياسيةf "> 15 محسوبة على أساس عينة الخلايا الحبيبية.عبر عن البيانات كنسبة بين سك من الجينات في المصالح والمربع من جينات التدبير المنزلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصف النتائج الأصلية لهذه التجارب في العمق سابقا 7 ويتم الإبلاغ عنها هنا كمثال على النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام البروتوكولات وصفها.

معدل النضج

من بين 32 كوك التي استعادها أوبو من المسام المهيمنة، كان 28 (88٪) في مر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن إيفم قد أجريت في الخيول لأكثر من 20 عاما 16 ، ونحن لا نعرف حتى الآن ما إذا كان البويضة يمكن أن يكون أصل أنيوبلوادي الغدة الجنينية، كما اقترح للبشر 17 . والسبب هو على الأرجح أن إعداد ينتشر البويضة لنتائج العد الكروموسوم في فقدان عينة كبيرة. مع هذا في الاعتبار، تم إجراء مسح للأساليب المستخدمة في التحقيق في الأخطاء في الفصل الكروموسوم للبحث عن أنسب التقنيات لتطبيقها على البويضات الحصان. تم العثور على أربعة تقنيات رئيسية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفون أن يشكروا فابريس فنسنت على الدعم الذي قدمه مع المسح الضوئي المجهري البؤري بالليزر (لم) ، وفليب بارير وتييري بلارد لأداء المسح المبيض بالموجات فوق الصوتية يوميا وحقن قوات حرس السواحل الهايتية. وأيد هذا العمل جزئيا مشروع "ريجيون سارديغنا أند ريجيون لومبارديا" "إكس أوفو أومنيا" (المنحة رقم 26096200 إلى مكافحة غسل الأموال). (العقد 2012 إلى فف)، FP7-بيوبل-2011- سيغ، الوكالة التنفيذية للبحوث (ريا) "برو-أوفوم" (المنحة رقم 303640 إلى فل)، و FP7-بيوبل-2011- سيغ. ومدرسة ما بعد الدكتوراه في الزراعة والطب البيطري، بتمويل مشترك من الصندوق الاجتماعي الأوروبي، البرنامج التشغيلي القطاعي لتنمية الموارد البشرية للفترة 2007-2013 (العقد رقم بوسدرو / 89 / 1.5 / S / 62371 إلى إدارة المعلومات). تم تمويل جمع البويضات في الجسم الحي من قبل معهد فرانسيس دو تشيفال إت دي l'إكيتاتيون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مسبار الموجات فوق الصوتيةAlokaUST-5820-7،5
سينترافيت الغدد التناسلية المشيمية البشريةCHO0041،500 وحدة / IV
ديتوميدينcentravetMED0109 - 15 & جم / كجم IV
بوتيل سكوبولامين برومورcentravetEST0010.2 مجم / كجم IV
مجهر مجهرNIKONSMZ-2B
بوتورفانولcentravetDOL00310 & micro ؛ جم / كجم IV
بنزيل البنسلينcentravetDEP203 IM15,000 UI /
TCM199Sigma-AldrichM3769 مسحوق 10X1Lل HEPES-buffered TCM199
ملح الصوديوم HepesSigma-AldrichH3784-100G
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichA8806
الهيبارين  Sigma-AldrichH3149-10KU
NaHCO3< / sub>-buffered TCM199Sigma-AldrichM2154-500MLالسائل لعامل نمو البشرة المتوسط IVM
سيجما-ألدريتشE4127
مصل ربلة الساق حديثي الولادةسيجما-ألدريتشN4762-500ML
4 أطباقنانكلونحاضنة 144444
HeraeusBB6060
monastrolSigma-AldrichM8515
hyaluronidaseSigma-AldrichH3506
pronaseSigma-AldrichP5147
paraformaldehydeSigma-AldrichP6148
كحول البولي فينيلSigma-Aldrich341584
تريتون-X 100سيجما ألدريتشT8787
مصل الحمار العاديسيجما ألدريتشD9663
أرنب مضاد للشفق القطبي ب فوسفو-Thr232BioLegend636102
الحمار المترافق TRITC المضاد للأرانب مختبرات IgGVector مختبرات711-025-152
مختبرات Vecta-ShieldVectorH-1000
YOPRO1Thermofisher مجهرY3603
LSM 780متحد البؤر ZISS
LSM 700برنامج Zeiss
ImageJrsb.info. nih.gov/ij/download.htmlماوس مورد
مضاد لألفا توبولينسيجما-ألدريتشT8203
أرنب مضاد ل acH4K16Upstate التكنولوجيا الحيوية07-329
AlexaFluor 488-coniugated حمار مضاد للفأر IgGLife TechnologiesA21202
4',6-diamidino-2-phenylindoleSigma-AldrichD8417جهاز
طرد مركزيDAPI Eppendorf5417R
RNALaterInvitrogenAM7020
Luciferase RNAPromegaL4561
PicoPure RNA Isolation KitApplied Biosystems12204-01
hexamers عشوائيةThermofisher ScientificN8080127
فأر مولوني فيروس سرطان الدم النسخ العكسيThermofisher Scientific28025013
SYBR الأخضر SupermixBioRad1708880
بادئات محددةSigma-Aldrichتم تصميم بادئات محددة باستخدام برنامج Primer3Plus (مورد مجاني) حراري
cyclerBioRadMyiQ
ماوس أحادي النسيلة مضادCENPA Abcam ab13939
ماوس أحادي النسيلة مضاد للشفق القطبي BAbcamab3609
المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر العلمي مجهر المسح الضوئي بالليزر مجاني ل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467(1984).
  2. Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
  3. Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
  4. Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
  5. Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
  6. Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
  7. Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
  8. Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
  9. Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
  10. Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
  11. Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
  12. Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
  13. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  14. Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
  15. Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
  16. Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
  17. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  18. Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
  19. Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
  20. Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
  21. Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
  22. Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
  23. Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217(2012).
  24. Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377(2013).
  25. Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
  26. Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58(2013).
  27. Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
  28. Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
  29. Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
  30. Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
  31. Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة