مقالة منهجية

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

DOI:

10.3791/55255

⸱

مايو 24, 2017

 ,  ,  , 
1Stem Cell and Regenerative Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR, 2Computational and Systems Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، ونحن بالتفصيل طريقة S تساوي P سورلين كروسلينكد، L إيغاتد، و S المنتخبة H الهجينة (سبلاش)، والتي تمكن رسم الخرائط على نطاق الجينوم التفاعلات داخل الجزيئات وبين الجزيئات رنا-رنا في الجسم الحي . سبلاش يمكن تطبيقها لدراسة رنا تفاعلات الكائنات الحية بما في ذلك الخميرة والبكتيريا والبشر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

معرفة كيفية تفاعل الحمض النووي الريبي مع أنفسهم ومع الآخرين هو المفتاح لفهم تنظيم الجينات رنا على أساس في الخلية. في حين أظهرت أمثلة على التفاعلات الحمض النووي الريبي رنا مثل التفاعلات الرنا الميكروي-مرنا لتنظيم التعبير الجيني، والمدى الكامل لتفاعلات الحمض النووي الريبي تحدث في الخلية لا يزال مجهولا. الأساليب السابقة لدراسة التفاعلات الحمض النووي الريبي ركزت في المقام الأول على مجموعات فرعية من الحمض النووي الريبي التي تتفاعل مع بروتين معين أو أنواع الحمض النووي الريبي. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة اسمها S تساوي P سورلين كروسلينكد، L إيغاتد، و S المنتخبة H الهجين (سبلاش) التي تسمح التقاط الجينوم واسعة من التفاعلات الحمض النووي الريبي في الجسم الحي بطريقة غير منحازة. سبلاش يستخدم في الجسم الحي كروسلينكينغ، ربط القرب، وارتفاع تسلسل الإنتاجية لتحديد الجزيئات داخل الجزيئات و بين الجزيئات شركاء الاقتران على الصعيد العالمي. سبلاش يمكن تطبيقها على الكائنات الحية المختلفة بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا البشرية، وكذلكs الظروف الخلوية المتنوعة لتسهيل فهم ديناميات منظمة رنا تحت السياقات الخلوية المتنوعة. كامل بروتوكول سبلاش التجريبية يستغرق حوالي 5 أيام لإكمال وسير العمل الحسابي يستغرق حوالي 7 أيام لإكمال.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراسة كيفية جزيئات أضعاف وتفاعل مع بعضها البعض هو المفتاح لفهم تنظيم الجينات في الخلية. في حين تم تركيز الكثير من الجهد في العقد الماضي على فهم كيفية مساهمة الحمض النووي والبروتينات في تنظيم الجينات، أقل نسبيا هو معروف عن تنظيم ما بعد النسخي التعبير الجيني. الحمض النووي الريبي يحمل المعلومات في كل من تسلسلها الخطي وفي هيكلها الثانوي والثالث 1 . قدرتها على قاعدة الزوج مع نفسها ومع الآخرين مهم لوظيفتها في الجسم الحي . وقد وفرت التطورات الأخيرة في إنتاجية عالية رنا التحقيق هيكل الثانوي رؤى قيمة في مواقع المناطق مزدوجة ومفردة الذين تقطعت بهم السبل في ترانسكريبتوم 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، هاولا تزال المعلومات المتعلقة بشركاء التفاعل المقترن مفقودة إلى حد كبير. لتحديد تسلسل الحمض النووي الريبي الذي يتفاعل مع منطقة رنا أخرى في ترانسكريبتوم، نحن بحاجة إلى المعلومات العالمية الحكمة.

إن رسم خرائط تفاعلات الحمض الريبي النووي (رنا) بين الزوجين بطريقة عالمية وغير منحازة كان تقليديا تحديا كبيرا. في حين أن النهج السابقة، مثل كلاش 9 ، هيكليب 10 و راب 11 ، وتستخدم لتحديد تفاعلات الحمض النووي الريبي على نطاق واسع، وهذه التقنيات عادة رسم الاقتران قاعدة الحمض النووي الريبي لمجموعة فرعية من الحمض النووي الريبي التي تتفاعل مع بروتين معين أو أنواع الحمض النووي الريبي. وتشمل التطورات الأخيرة في دراسة التفاعلات رنا العالمية طريقة ربل 12 ، والتي لا استقرار التفاعلات الحمض النووي الريبي في الجسم الحي ، وبالتالي قد التقاط فقط مجموعة فرعية من التفاعلات في الجسم الحي . وللتغلب على هذه التحديات، طورنا نحن وغيرهم استراتيجيات غير متحيزة على نطاق الجينومp رنا إنتيراكتوميس في الجسم الحي ، وذلك باستخدام إصدارات معدلة من سبورالين كروسلينكر 13 ، 14 ، 15 . في هذا البروتوكول، ونحن تصف تفاصيل لأداء S تساوي P سورلين كروسلينكد، L إيغاتد، و S المنتخبة H الهجين (سبلاش)، والذي يستخدم السورالين البيروكسيديز لربط كروتينك قاعدة رنا في الجسم الحي ، تليها ربط القرب وارتفاع تسلسل الإنتاجية إلى تحديد الحمض النووي الريبي قاعدة الاقتران الشركاء الجينوم واسعة ( الشكل 1 ) 15 .

في هذه المخطوطة، ونحن تصف الخطوات لأداء سبلاش باستخدام الخلايا الملتصقة مثقف، في هذه الحالة خلايا هيلا. نفس البروتوكول يمكن أن تتكيف بسهولة لخلايا الثدييات تعليق والخميرة والبكتيريا الخلايا. لفترة وجيزة، يتم معالجة الخلايا هيلا مع السورالين البيروكسيديز والأشعة في 365 نانومتر إلى كروسلينك التفاعل أزواج قاعدة الحمض النووي الريبي في الجسم الحي. ثم يتم استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا، مجزأة وإثراء لمناطق تشابك الارتباط باستخدام الخرز ستريبتافيدين. ثم يتم ربط ليغاتد شظايا التفاعل الحمض النووي الريبي معا باستخدام ربط القرب وجعلها إلى مكتبة [كدنا] لتسلسل عميق. عند التسلسل، يتم تعيين رنا الخيميري على ترانسكريبتوم / الجينوم لتحديد المناطق التفاعلية رنا التي يتم إقرانها مع بعضها البعض. لقد استخدمت بنجاح سبلاش لتحديد الآلاف من التفاعلات الحمض النووي الريبي في الجسم الحي في الخميرة والخلايا البشرية المختلفة، بما في ذلك الجزيئات داخل الجزيئات و بينا الجزيئات الاقتران في فئات متنوعة من الحمض النووي الريبي، مثل سنورناس، لكرناس و مرناس، لمحة عن التنظيم الهيكلي وأنماط التفاعل من رنا في الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. علاج خلايا هيلا مع السورالين بيوتينيلاتد واستخراج الحمض النووي الريبي

  1. ثقافة خلايا هيلا في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) تستكمل مع 10٪ مصل بقري الجنين (فبس) و 1٪ البنسلين الستربتومايسين (بس) في لوحة 10 سم.
  2. غسل خلايا هيلا مرتين مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X. استنزاف بس الزائدة تماما من الطبق عن طريق وضع الطبق عموديا لمدة 1 دقيقة.
  3. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 200 ميكرومتر من السورالين البيروكسيديز و 0.01٪ ث / د ديجيتونين، إلى الخلايا بشكل موحد واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. في حين أن السورالين البيروكسيديز يمكن أن يدخل الخلية، نفاذية له هو أعلى بكثير عندما تتعرض الخلايا لكميات قليلة من ديجيتونين (0.01٪) لمدة 5 دقائق
  4. إزالة غطاء لوحة 10 سم تحتوي على خلايا هيلا المعالجة ووضع الطبق شقة على الجليد. إشعاع طبق يحتوي على الخلايا مع 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة على الجليد، على مسافة 3 سم من لمبات الأشعة فوق البنفسجية، وذلك باستخدام كروسلينكر الأشعة فوق البنفسجية.
  5. عزل tرنا أوتل من خلايا هيلا بواسطة غوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-الكلوروفورم استخراج بعد بروتوكول الشركة المصنعة. إضافة 1: 1 حجم الأيزوبروبانول لترسب الحمض النووي الريبي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية في الأيزوبروبانول إلى أجل غير مسمى. لا يمكن أن يؤديها لطخة نقطة في هذه الخطوة للتحقق من أن السورالين البيروكسيديز قد دخلت بنجاح الخلايا ولها رنا كروسلينكد في الجسم الحي ( الشكل 2 ).
  6. الطرد المركزي رنا عجلت في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لاستعادة الحمض النووي الريبي. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول البارد 70٪ إلى بيليه رنا لغسل الحمض النووي الريبي.
  7. الطرد المركزي العينات في 20،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف والهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. إضافة نوكليس خالية من المياه إلى بيليه رنا وتحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية بعد ولاش تجميد في النيتروجين السائل.

2. تجزئة الحمض النووي الريبي

  1. سخن 15 ميكرولتر من 2X رنا العازلة تجزئة و 10 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي (1 ميكروغرام / ميكرولتر) بشكل فردي في أنابيب 0.2 مل ير، في 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. مزيج 10 ميكرولتر من ساخنة 2X رنا العازلة تجزئة مع 10 ميكرولتر عينة الحمض النووي الريبي التي بيبتينغ صعودا وهبوطا. احتضان العينة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وقف رد فعل من قبل المفاجئة تبريد رد فعل على الجليد.
  2. نقل وتجميع ردود الفعل 2 تجزئة إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. إضافة 40 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس إلى رد فعل، 10 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم، 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 300 ميكرولتر من الايثانول 100٪ إلى رد فعل تجزئة. احتضان الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل لترسيب الحمض النووي الريبي.
  3. الطرد المركزي رنا عجلت في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة، وإزالة طاف وغسل الحمض النووي الريبي باستخدام 1 مل من الايثانول 70٪.
  4. الطرد المركزي رنا في 20،000 زغ لمدة 15 دقيقة، ريمفوق طاف وحل رنا في 20 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس.

3. الحمض النووي الريبي حجم اختيار وشطف

  1. إضافة 20 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تحميل صبغ إلى الحمض النووي الريبي المستردة في أنبوب ميكروفوج. تسخين الحمض النووي الريبي مع صبغ تحميل الحمض النووي الريبي في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ووضعه على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  2. إضافة 3 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تحميل صبغ إلى 0.25 ميكرولتر من 10 نت سلم الحمض النووي في أنبوب ميكروفوج. تسخين السلم في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ووضعه على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  3. تحميل سلم التشويه والتحريف على 8.6 سم × 6.8 سم 6٪ تب اليوريا هلام وحجم تجزئ بواسطة الكهربائي لمدة 40 دقيقة في 180 V. وصمة عار هلام في 10 مل من العازلة تب تحتوي على 1: 10،000 من حمض هلام وصمة عار لمدة 5 دقيقة في الظلام.
  4. ثقب نظيفة 0.6 مل أنبوب ميكروفوج في الجزء السفلي باستخدام إبرة 24 G ووضعه في أنبوب ميكروفوج 2 مل.
  5. تصور العصابات على هلام ما بعد الملون باستخدام ترانزيلوميناتور وقطع شريحة هلام المقابلة ل 90-110 نت. نقل شريحة هلام في أنبوب مثقب 0.6 مل ميكروفوج في أنبوب ميكروفوج 2 مل. يتم تنفيذ هذا التحديد حجم للسماح للشظايا الخيميري أن يكون الحد الأدنى لطول لخريطة ل ترانسكريبتوم والتمييز بين المنتجات ليغاتد القرب مقابل المنتجات أونليغاتد في الخطوات اختيار حجم المصب.
  6. أجهزة الطرد المركزي شرائح هلام في 12000 زغ في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة لتمزيق شريحة هلام وجمعه في أنبوب ميكروفوج 2 مل. تجاهل فارغة 0.6 مل ميكروفوج أنبوب. إضافة 700 ميكرولتر من العازلة شطف لشريحة هلام تمزيقه في أنبوب ميكروفوج 2 مل واحتضان عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع دوران مستمر، للسماح نشر العينات في المخزن المؤقت.
  7. نقل شرائح هلام والعازلة شطف لتصفية أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 20،000 x ج لمدة 2 دقيقة. سيتم حبس شرائح هلام في الجزء العلوي من مرشح. تجاهل شرائح هلام وأعلى المقصورة.
  8. إضافة 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 700 ميكرولتر من الأيزوبروبانول 100٪ إلى الترشيح في أنبوب ميكروفوج وترسب الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو بين عشية وضحاها.
    نقطة وقفة: يمكن أن يعجل الحمض النووي الريبي في الأيزوبروبانول إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية.
  9. الطرد المركزي رنا عجلت في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لاستعادة الحمض النووي الريبي. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول البارد 70٪ لغسل بيليه رنا. الطرد المركزي بيليه غسلها في 20،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  10. إزالة غسل العازلة وإضافة 20 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس ل ريسوسبيند رنا. كوانتيتات تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية بعد تجميد فلاش في النيتروجين السائل.

4. إثراء المناطق المتشابكة رنا

  1. دوامة ستريبتافيدين المغلفة الخرز المغناطيسي بقوة ل ريسوسبيند الخرز متجانسة في الأنبوب. نقل 100 ميكرولتر من الخرز إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل ووضعه على المغناطيسإيك الوقوف لمدة 1 دقيقة للسماح الخرز التمسك الجانب المغناطيسي من الأنبوب. إزالة المخزن المؤقت التخزين من الخرز بعناية واتخاذ أنبوب من موقف المغناطيس.
  2. إضافة 1 مل تحلل العازلة إلى الخرز في أنبوب ميكروفوج وماصة صعودا وهبوطا. وضع الخرز ميكروفوج التي تحتوي على موقف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة لفصل الخرز من غسل العازلة. كرر هذا لما مجموعه 3 يغسل.
  3. إزالة غسل العازلة من الخرز عن طريق وضع الخرز ميكروفوج تحتوي على موقف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة. إضافة المانع ريبونوكلياز (1: 200) إلى العازلة تحلل وإضافة 100 ميكرولتر من العازلة تحلل إلى الخرز غسلها في أنبوب ميكروفوج.
  4. إضافة 2 مل من العازلة التهجين الطازجة، 1 مل من العازلة تحلل تستكمل، 1.5 ميكروغرام من حجم رنا مجزأة و 100 ميكرولتر من الخرز معلق إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطية. دوامة الأنبوب بلطف.
  5. احتضان أنبوب الطرد المركزي المخروطية 15 مل في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع نهاية إلى نهاية التناوب.قبل الحارة غسل العازلة عند 37 درجة مئوية.
  6. وضع 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية على موقف المغناطيسي لمدة 15 مل أنابيب لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من المخزن المؤقت. ماصة العازلة بعناية من الأنبوب وتجاهل ذلك.
  7. إضافة 1 مل من قبل غسلها العازلة غسل إلى الخرز، ماصة صعودا وهبوطا ونقل الخرز إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. احتضان في الخرز عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، مع نهاية إلى نهاية التناوب.
  8. طرد مركزي لفترة وجيزة أسفل محتويات أنبوب ميكروفوج. وضع 1.5 مل غسلها الخرز في أنابيب ميكروفوج على موقف المغناطيسي لمدة 2 مل أنابيب لمدة 1 دقيقة، لفصل الخرز من غسل العازلة. إزالة المخزن المؤقت من الخرز عن طريق بيبتينغ بلطف المخزن المؤقت للخروج من أنبوب ميكروفوج.
  9. إضافة 1 مل من قبل غسلها العازلة غسل إلى الخرز وماصة صعودا وهبوطا لتكرار غسل. إجراء ما مجموعه 5 يغسل. في نهاية غسل ال 5، إزالة العازلة غسل عن طريق وضع الخرز ميكروفوج التي تحتوي على موقف المغناطيس ل1 دقيقة.

5. ربط القرب

  1. إضافة 1 مل من الباردة T4 بولينوكليوتيد كيناز (بنك) العازلة إلى الخرز غسلها واحتضان الخرز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، مع نهاية إلى نهاية التناوب. وضع أنبوب ميكروفوج تحتوي على الخرز على الشريط المغناطيسي لمدة 1 دقيقة وإزالة بلطف العازلة T4 بنك. كرر هذه الخطوة لما مجموعه 2 يغسل وإزالة العازلة T4 بنك بعد غسل الماضي.
  2. إضافة المخازن المؤقتة إلى الخرز، وفقا للجدول 1 . لتمكين 3 'ينتهي من جزء رنا ليغاتد إلى 3' محولات أدناه، احتضان الخرز في المخزن المؤقت في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات مع التحريض المستمر لتحويل 3 'مجموعة الفوسفات الحلقية في نهاية الحمض النووي الريبي إلى 3 'أوه.
  3. إضافة المخازن المؤقتة إلى رد الفعل السابق، وفقا للجدول 2 . لتمكين 5 'نهاية شظايا الحمض النووي الريبي لتكون ربط المختصة، احتضان رد فعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع التحريض المستمر في وجود أتب، لتحويل 5 'أوه على الحمض النووي الريبي إلى 5' الفوسفات.
  4. إضافة المخزن المؤقت إلى رد الفعل السابق لأداء ربط القرب، وفقا للجدول 3 . احتضان رد فعل في 16 درجة مئوية لمدة 16 ساعة، مع التحريض المستمر،
  5. وضع ميكروفوج تحتوي على رنا ليغاتد على موقف المغناطيس لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف بعناية وإضافة 1 مل من الغرفة درجة حرارة غسل العازلة إلى الخرز. ريسوسبيند التي كتبها بيبتينغ صعودا وهبوطا.
  6. وضع أنبوب ميكروفوج على موقف المغناطيس لمدة 1 دقيقة وإزالة العازلة غسل بعناية. إجراء ما مجموعه 2 يغسل، وإزالة العازلة غسل من الخرز في نهاية الغسيل الثاني.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من رنا بيكاي العازلة إلى الخرز و ريسوسبيند التي بيبتينغ صعودا وهبوطا. تسخين العينات في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على كتلة الحرارة.
  8. البرد العينة على الجليد لمدة 1 دقيقة وإضافة 500 ميكرولتر من غوانيدينيوم ثيوسيانات الفينول الكلوروفورم إلى العينة. مزيج بواسطة فورتيكسينغ بقوة لمدة 10 ثانية. احتضان ميكستوإعادة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في غوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-الكلوروفورم في -80 درجة مئوية لبضعة أشهر.
  9. إضافة 100 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى غوانيدينيوم ثيوسيانات الفينول الكلوروفورم العينات المستخرجة. دوامة بقوة لمدة 10 ثانية. الطرد المركزي العينات في 20،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  10. نقل 400 ميكرولتر من طبقة مائي إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل جديد. إضافة 800 ميكرولتر (2 مجلدات) من الايثانول بنسبة 100٪ وتخلط بيبتينغ صعودا وهبوطا.
  11. نقل حل الحمض النووي الريبي لأعمدة تنظيف الحمض النووي الريبي واستعادة رنا تعليمات الشركة المصنعة التالية، وضمان أن يتم الاحتفاظ حتى رنا صغيرة. أزل الحمض النووي الريبي في 100 ميكرولتر من نوكليس خالية من المياه.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية بعد تجميد فلاش في النيتروجين السائل.

6. عكس كروسلينكينغ من السورالين البيروكسيديز

  1. نقل 100 ميكرولتر من عينات إلوتد في بئر من 24 بل جيداأكل. إزالة الغطاء وإشعاع العينة تحت الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر، لمدة 5 دقائق على الجليد.
  2. نقل عينة كروسلينكد العكسي إلى أنبوب ميكروفوج نظيفة. إضافة 10 ميكرولتر من خلات الصوديوم، 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 300 ميكرولتر من الايثانول 100٪ ويعجل الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو بين عشية وضحاها.
    نقطة وقفة: يمكن أن يعجل الحمض النووي الريبي في الإيثانول إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية.
  3. الطرد المركزي رنا عجلت في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لاستعادة الحمض النووي الريبي. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول البارد 70٪ لغسل بيليه رنا.
  4. الطرد المركزي بيليه غسلها في 20،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة العازلة غسل وإضافة 4.25 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس ل ريسوسبيند رنا. نقل الحمض النووي الريبي إلى أنبوب 0.2 مل ير.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية بعد تجميد فلاش في النيتروجين السائل.

7. النسخ العكسي و [كدنا] التعميم

  1. إضافة 0.75 ميكرولترمن رنا رابط (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى العينة معلق في أنبوب ير والحرارة في 80 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. وضع العينة على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  2. إضافة المخازن المؤقتة إلى العينة التشويه والتحريف ل 3 'ربط محول، وفقا للجدول 4 . احتضان رد فعل عند 25 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة.
  3. نقل رد فعل إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. إضافة 90 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس إلى رد فعل، تليها 10 ميكرولتر من خلات الصوديوم، 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. يعجل الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو بين عشية وضحاها.
    نقطة وقفة: يمكن أن يعجل الحمض النووي الريبي في الإيثانول إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية.
  4. الطرد المركزي رنا عجلت في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لاستعادة الحمض النووي الريبي. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول البارد 70٪ لغسل بيليه رنا.
  5. الطرد المركزي بيليه غسلها في 20،000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة غسل ريسوسبيند العازلة بيليه في 5 ميكرولتر من نوكليس مجانا ثالعاطر.
  6. إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تحميل صبغ إلى الحمض النووي الريبي المستردة في أنبوب ميكروفوج. تسخين الحمض النووي الريبي مع صبغ تحميل الحمض النووي الريبي في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ووضعه على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  7. إضافة 3 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تحميل صبغ إلى 0.25 ميكرولتر من 10 نت سلم الحمض النووي في أنبوب ميكروفوج. تسخين السلم في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ووضعه على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  8. أداء تجزئة حجم باستخدام 8.6 سم × 6.8 سم 6٪ تب اليوريا هلام كما في الخطوات 3.3 و 3.4.
  9. تصور هلام ملطخة مع وصمة عار حمض النووي باستخدام ترانزيلوميناتور وقطع شريحة هلام المقابلة ل 110-140 نت على سلم. نقل شريحة هلام في أنبوب ثقب 0.6 مل ميكروفوج في أنبوب ميكروفوج 2 مل واتبع بروتوكول من الخطوات 3.6- 3.9.
  10. إضافة 5 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس ل ريسوسبيند بيليه الحمض النووي الريبي. نقل الحمض النووي الريبي إلى أنبوب 0.2 مل ير.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية بعد تجميد فلاش في النيتروجين السائل.
  11. إضافة 1 ميكرولتر من التمهيدي رت في 1.2581؛ M إلى الحمض النووي الريبي في أنبوب ير والحرارة في 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. وضع العينة على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  12. إضافة المخازن المؤقتة للنسخ العكسي وفقا للجدول 5 . احتضان رد فعل عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  13. إضافة 1.1 ميكرولتر من 1 N هيدروكسيد الصوديوم إلى التفاعل والحرارة في 98 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. وضع رد فعل على الجليد.
  14. نقل رد فعل إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. إضافة 90 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس إلى رد فعل، تليها 10 ميكرولتر من خلات الصوديوم، 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. يعجل الحمض النووي في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو بين عشية وضحاها.
    نقطة وقفة: الحمض النووي يمكن عجلت في الإيثانول إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية.
  15. الطرد المركزي الحمض النووي عجلت في 20،000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لاستعادة الحمض النووي. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول البارد 70٪ لغسل بيليه الحمض النووي. الطرد المركزي بيليه غسلها في 20،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة غسل ريسوسبيند العازلة بيلواسمحوا في 5 ميكرولتر من نوكليس المياه مجانا.
  16. أداء تجزئة حجم باستخدام 8.6 سم × 6.8 سم 6٪ تب اليوريا هلام كما في الخطوات 3.3 و 3.4.
  17. تصور هلام ما بعد الملون باستخدام ترانزيلوميناتور وقطع شريحة هلام المقابلة ل 200-240 نت على سلم. و كدنا المكتوبة العكسية الآن 96 قواعد أطول من جزء رنا بسبب إضافة 96 قاعدة رت التمهيدي. نقل شريحة هلام في أنبوب مثقب 0.6 مل ميكروفوج في أنبوب ميكروفوج 2 مل.
  18. أجهزة الطرد المركزي شرائح هلام في 12000 زغ في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة لتمزيق شريحة هلام وجمعه في أنبوب ميكروفوج 2 مل. تجاهل فارغة 0.6 مل ميكروفوج أنبوب.
  19. إضافة 700 ميكرولتر من العازلة شطف لشريحة هلام تمزيقه في أنبوب ميكروفوج 2 مل واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع دوران مستمر. اتبع البروتوكول كما هو موضح في الخطوات 3.7- 3.8.
  20. إضافة 6 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس ل ريسوسبيند بيليه الحمض النووي. نقل الحمض النووي إلى أنبوب 0.2 مل ير.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي في -80 درجة مئوية بعد تجميد فلاش في النيتروجين السائل.
  21. إضافة المخازن المؤقتة إلى رد فعل لتعميم [كدنا]، وفقا للجدول 6 . احتضان رد فعل في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة والحرارة في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتعطيل التفاعل.
  22. نقل رد فعل إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. تنقية كدنا دائرية باستخدام عمود تنظيف الحمض النووي التالية تعليمات الشركة الصانعة. إضافة 20 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس إلى العمود إلى أزل كدنا المنقى.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية لبضعة أشهر.

8. ير التضخيم (مقياس صغير ير)

  1. إضافة المخازن المؤقتة إلى رد فعل وفقا للجدول 7 ل ير التضخيم لاختبار الحد الأدنى من دورات تحتاج إلى تضخيم المكتبة.
  2. إعداد ظروف الدراجات ير وفقا للجدول 8 . وقفة رد فعل ونقل 5 ميكرولتر منتفاعل ير في 10 و 15 و 20 دورات، في أنابيب 1.5 مل ميكروفوج منفصلة.
  3. إضافة 1 ميكرولتر من 6X دنا هلام صبغ التحميل لكل من 5 ميكرولتر تفاعل ير في دورات مختلفة. أداء الكهربائي هلام على هلام الاغاروز 3٪، في 120 V، لمدة 1 ساعة لتصور المنتجات ير.
    1. استخدام أقل عدد من دورات ير (Y) التي تظهر التضخيم في حوالي 250 قواعد (في الشكل 3 ، هناك فرقة قوية في 15 دورات من التضخيم وحزمة خافتة في 10 دورات.من المرجح أن دورات 12 من التضخيم ير يرتكز على توليد ما يكفي من المواد لتسلسل عميق كما كمية من [كدنا] المستخدمة هو 10 أضعاف ذلك على نطاق صغير ير التضخيم).

9. ير التضخيم (ير مقياس كبير) وتنقية

  1. إضافة المخازن المؤقتة إلى رد فعل وفقا للجدول 9 ل ير التضخيم ل ير على نطاق واسع.
  2. إعداد ظروف الدراجات ير وفقا لالجدول 10 .
  3. إضافة 5 ميكرولتر من 6X دنا هلام صبغ التحميل إلى 25 ميكرولتر من تفاعل ير وتحميلها في بئر من هلام الاغاروز 3٪. تحميل 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النووي في بئر منفصل. أداء الكهربائي هلام في 100 V، لمدة 1.5 ساعة.
  4. تصور هلام الانتهاء باستخدام الأشعة فوق البنفسجية ترانزيلوميناتور.
  5. حجم استخراج شريحة هلام تحتوي على المنتجات ير من 200-300 قواعد ونقل هلام إلى نظيفة 2 مل أنبوب ميكروفوج.
  6. إضافة 1 مل من العازلة للذوبان هلام، من مجموعة استخراج هلام الحمض النووي، إلى شريحة هلام واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، أو حتى هلام يذوب، مع التحريض المستمر.
  7. إضافة 200 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى هلام المذاب وتخلط جيدا عن طريق بيبتينغ. نقل 700 ميكرولتر من العينة إلى الحمض النووي استخراج هلام تنظيف العمود وأجهزة الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 30 ثانية. إبقاء نقل العينة المذابة إلى العمود حتى يتم تحميل كل من العينة على العمود.
  8. إضافة 500 ميكرولتر العازلة للذوبان هلام،تليها 700 ميكرولتر من العازلة غسل العمود، إلى العمود، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. إضافة 12 ميكرولتر من نوكليس خالية من المياه إلى وسط العمود لاستباق الحمض النووي. نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
  9. كوانتيتات تركيز الحمض النووي باستخدام القياس الكمي فلوروميتريك. إذا تم إنشاء مكتبات متعددة وتجميعها معا للتسلسل، إضافة كمية متساوية من كل عينة إلى التجمع، لارتفاع تسلسل الإنتاجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشكل 1 يصور التخطيطي لسير العمل سبلاش. على إضافة السورالين البيروكسيديز في وجود 0.01٪ ديجيتونين، والأشعة فوق البنفسجية يشابك، يتم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا ويتم تنفيذ نقطة لطخة لضمان أن يشابك من البيروكسيديز إلى الحمض النووي الريبي قد حدث بكفاءة ( الشكل 2 ). نحن نستخدم أوليغوس قاعدة البيروكسيديز 20 كما ضوابط إيجابية ل معايرة كمية من السورالين البيروكسيديز إلى أن تضاف إل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن تصف بالتفصيل سير العمل التجريبي والحسابي ل سبلاش، وهي الطريقة التي تسمح لنا لتحديد التفاعلات الحمض النووي الريبي الزوجين الحكمة في طريقة الجينوم واسعة. لقد استخدمنا بنجاح سبلاش في الثقافات البكتيرية والخميرة والثقافات البشرية، وتوقع أن الاستراتيجية يمكن تطبيقها على نطاق واسع على الكائنات الحية المختلفة في حالات الخلوية المختلفة. واحدة من الخطوات الحاسمة في البروتوكول هو أن تبدأ مع ما لا يقل عن 20 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي كروسلينكد أن يكون المواد الكافية لعمليات ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر أعضاء مختبر وان ومختبر ناغاراجان للمناقشات بالمعلومات. ويدعم N.Nagarajan بتمويل من A * ستار. يتم دعم Y.Wan بتمويل من A * ستار والمجتمع في العلوم-برانكو فايس الزمالة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد



قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النوويتقنيات الحياة القابضة بي تي إي المحدودة10787026سلم الحمض النووي
10 نقطة أساس سلم الحمض النوويلايف تكنولوجيز القابضة بي تي إي المحدودة10821-015سلم الحمض النووي
20٪ حل SDSالأول BASEBUF-2052-1L    
20x SSCأول قاعدةBUF-3050-20X1L
3.0 M محلول أسيتات الصوديومالأول BASEBUF-1151-1L-pH5.2   مطلوب لترسيب الحمض النووي
40٪ محلول أكريلاميد / مكرر ، 19: 1Bio-Rad1610145TBE مكون هلام اليوريا
Ambion Buffer KitLife Technologies Holdings Pte LtdAM9010
بيرسلفات الأمونيوم ، الصف الجزيئي   ؛  بروميجاV3131 مكون جل اليوريا TBE
بروموفينول الأزرقسيجما ألدريتشB0126-25G
كلوروفورمميرك1.02445.1000استخراج الحمض النووي
حيط واحد الحمض النووي ليغازمركز الزلزالCL9025KCircLigase II ssDNA Ligase
مرشحات أنبوب الطرد المركزيSigma-AldrichCLS8160-96EAمرشحات أنبوب الطرد المركزي Costar Spin-X
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINEسيجما ألدريتشD5628-1Gلعلاج الخلايا
قارئ الظلام Transilluminator  كلير للأبحاث الكيميائيةالقارئ المظلم DR89X Transilluminatorالأزرق Transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6x)Life Technologies Holdings Pte LtdR0611مطلوب للتثقيب الكهربائي لجل الاغاروز
Dulbecco's Modified Eagle MediumPan BioTechP04-03500لثقافة خلايا Hela
الخرز المغناطيسي StreptavidinLife Technologies Holdings Pte Ltd65002Dynabeads MyOne Streptavidin C1  
حامل مغناطيسي ل 15   ؛ مل أنابيبالحياة تقنيات القابضة بي تي إي المحدودة12301DDynaMag-15
حامل مغناطيسي ل 15 & nbsp; مل أنابيبLife Technologies Holdings Pte Ltd12321DDynaMag-2
ThermoMixerEppendorf5382 000.015Eppendorf ThermoMixer  C
البيوتينيل السورالينلايف تكنولوجيز القابضة بي تي إي المحدودة29986EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5 / BL & nbsp ؛هيتاشيF8T5/BL 365 نانومتر لمبة الأشعة فوق البنفسجية
مصل الجنينتقنيات الحياة القابضة بي تي إي المحدودة10270106   مكونات وسط هيلا
فورماميدبروميجاH5052   المكون في المخزن المؤقت للتهجين
G8T5Sankyo-DenkiG8T5254 نانومتر لمبة الأشعة فوق البنفسجية
GlycogenLife Technologies Holdings Pte Ltd10814010مطلوبة لترسيب الأحماض
NanodropLife Technologies Holdings Pte LtdNanodrop 2000مقياس الطيف الضوئي لقياس الحمض النووي الخالي
من الماء   ؛أول قاعدةBUF-1180-500ml   
البنسلين ستربتومايسين   لايف تكنولوجيز القابضة بي تي إي المحدودة15140122   مكونات وسط هيلا
بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة (2x)Life Technologies Holdings Pte LtdF531L فوسيون عالي الدقة PCR ماستر ميكس مع عازلة HF (2x)
مجموعة الاشعال 1نيو إنجلاند BiolabsE7335L & nbsp ؛بادئات PCR
طقم استخراج هلام الحمض النوويQIAgen28106QIAquick Gel Extraction
طقم القياس الكمي الفلورومتريLife Technologies Holdings Pte LtdQ32854Qubit dsDNA HS Assay
Kit طقم تنظيف الحمض النووي الريبيQiagen74106RNeasy Mini Kit عمود غشاء السيليكا
Rnase InhibitorLife Technologies Holdings Pte LtdAM2696SUPERase In
النسخ العكسيLife Technologies Holdings Pte Ltd18080400SuperScript III أول حبلا تخليق SuperMix
هلام الحمض النووي StainLife Technologies Holdings Pte LtdS11494SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide KinaseNew England BiolabsM0201Lإنزيم الإصلاح
النهائي T4 RNA Ligase 1New England BiolabsM0204Lإنزيم ل ربط القرب
T4 RNA Ligase 2 ، مبتورة KQNew England BiolabsM0373LEnzyme لربط المحول
TemedBio-Rad1610801TBE مكون هلام اليوريا
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroformLife Technologies Holdings Pte Ltd15596018TRIzol & reg ؛ كاشف لاستخراج الحمض النووي الريبي
اليوريافيرست BASEBIO-2070-5kg   
الأشعة فوق البنفسجية المتشابكةستراتاجين400072الأشعة فوق البنفسجية ستراتالينكر 1800
الأشعة فوق البنفسجية TransilluminatorUVP95-0417-01لتصور العصابات
زيلين سيانول FFسيجما-ألدريتشX4126-10G
تنظيف الحمض النووي ZymoResearch   ؛D4004مكثف الحمض النووي Zymo-5   ؛
<قوي>قائمة البرامج المطلوبة< / قوي>
برنامج FastQC0.11.4http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
برنامج SeqPrep1.0.7https://github.com/jstjohn/SeqPrep
برنامج BWA0.7.12http://bio-bwa.sourceforge.net/
برنامج SAMTOOLS1.2.1http://www.htslib.org/
برنامج PULLSEQ1.0.2https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR2.5.0chttps://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py برنامج PYTHON النصيPYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py برنامج PYTHONPYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK البرنامج النصيAWK GNU 4.1.2https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
<قوي>تكوين العازلة
<قوي> العازلة الميزوة
0.3 M أسيتات
< قوي > Lysis Buffer < / قوي >
50 ملي مولار Tris-Cl درجة الحموضة 7.0
10 ملي مولار EDTA
1٪ SDS
أضف دائما Superase-in طازجا قبل الاستخدام إلا عند غسل الخرز
< قوي > Proteinase K Buffer   ؛ < / قوي>
100 ملي كلوريد
10 ملي مولار Tris-Cl درجة الحموضة 7.0
1 ملي مولار EDTA
0.5٪ SDS
<قوي> عازلة تهجين< قوية>
750 ملي كلوريد
1٪ SDS
50 ملي مولار Tris-Cl درجة الحموضة 7.0
1 ملي مولار EDTA
15٪ فورماميد (يحفظ في الظلام عند 4 درجات ؛ ج)
أضف دائما Superase-in طازجا قبل الاستخدام
<قوي >2x SSC Wash Buffer< / قوي >
2x كلوريد الصوديوم وسيترات الصوديوم (SSC) (مخفف من 20x SSC Invitrogen) 0.5
٪ SDS
<قوي >2x مخزن تجزئة RNA < قوي>
18 ملي مولار MgCl2< / sub>
450 مللي مولار KCl
300 ملي مولار Tris-Cl درجة الحموضة 8.3
<قوي>2x RNA تحميل صبغة< / قوي>
95٪ فورماميد
0.02٪ SDS
0.02٪ بروموفينول أزرق
0.01٪ زيلين سيانول
1 ملي مولار EDTA
الريبي الضوء الأبقار النووية Kit النصي الصوديومالصوديومالصوديوم < td colspan = "4" >3 "تسلسل محول الحمض النووي الريبي: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT / 3ddC< td colspan = "4" >RT تسلسل التمهيدي: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCGGGGTCGGTCGGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
  2. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
  3. Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
  4. Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
  5. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
  6. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
  7. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
  8. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  9. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  10. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  11. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  12. Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
  13. Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
  14. Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
  15. Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SPLASH

مقالات ذات صلة