تحديد تسلسل التعريب بلاسموديسمال في البروتينات في بﻻنتا

Summary

الاتصالات بين الخلايا النباتية، plasmodesmata (Pd)، تلعب الأدوار المركزية في مصنع التفاعلات فسيولوجيا ومصنع للفيروسات. يتم فرز الحرجة للنقل Pd الإشارات التي توجه البروتينات للمشتريات. غير معرفتنا في تسلسل هذه لا تزال في مهدها. يصف لنا استراتيجية لتحديد إشارات التعريب Pd في البروتينات المستهدفة Pd.

Abstract

Plasmodesmata (Pd) هي خلية إلى الاتصالات التي تعمل كبوابات تنقل من خلالها الجزيئات الصغيرة والكبيرة بين الخلايا النباتية. بينما النقل Pd من جزيئات صغيرة، مثل الأيونات والماء، المفترض أن يحدث مكتوفي الأيدي، نقل خلية إلى خلية من الجزيئات البيولوجية الكبرى، مثل البروتينات، يحدث على الأرجح عبر إليه نشطة تتضمن إشارات محددة تستهدف في نقل جزيء. ندرة plasmodesmata التي تم تحديدها (Pd) ترجمة الإشارات (PLSs) قد مقيدة بشدة فهم الفرز البروتين مسارات تشارك في زرع خلية إلى خلية الجزيئات النقل والاتصالات. من ثروة النباتات البروتينات الذاتية والفيروسية المعروفة لحركة المرور من خلال Pd، PLSs ثلاثة فقط أبلغ حتى الآن، كل منهم من البروتينات النباتية الذاتية. وبالتالي، من المهم وضع استراتيجية تجريبية موثوقة ومنهجية لتحديد تسلسل الثابتة والمتنقلة فنية، التي ضرورية وكافية لاستهداف Pd، مباشرة في المعيشة الخلايا النباتية. هنا، يمكننا وصف واحد مثل هذه الاستراتيجية كنموذج باستخدام حركة الخلية للخلية البروتين (MP) فيروس تبرقش التبغ (TMV). هذه التجارب، التي حددت ووصفت الأول النباتية الثابتة والمتنقلة الفيروسية، ويمكن تكييفها لاكتشاف تسلسل الثابتة والمتنقلة في البروتينات الأكثر استهدافاً Pd.

Introduction

Plasmodesmata (Pd) تعمل كقنوات لنقل المنظمين مفتاح التنمية النباتية و morphogenesis، بدءاً من عوامل النسخ مرناً وجزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة بين الخلايا. وعلاوة على ذلك، تستخدم هذا قدرة النقل الجزيئات Pd معظم الفيروسات النباتية لانتشارها بين الخلايا أثناء العدوى؛ للانتقال عبر Pd، تطورت فيروسات النباتات البروتينات المتخصصة، ووصف حركة البروتينات (MPs)، التي تستهدف على وجه التحديد إلى Pd^{1،2،3،4،،}من^{56 , 7}-الجزيئية مسارات النقل Pd على الأ....

Protocol

1-مصنع المواد

1. اختيار أنواع النباتات
2. استخدام الأنواع النباتية الأصلية للبروتين من الفائدة، أي، والذي يقوم بترميز هذا البروتين للبروتينات الذاتية أو الذي يمثل المضيفة الطبيعية لمسببات المرض للبروتينات الفيروسية. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون الأنواع النباتية المحددة قابلة للطريقة المختارة للتحول الوراثي عابرة.
   ملاحظة: الدراسات التي تستخدم بشكل روتيني نيكوتيانا بينثاميانا، الذي يمثل مضيفة جيدة تمف وتتحول كفاءة تقنية التحول الجيني بوساطة المتبعة، أي، أجروينفيلتريشن (راجع الخطوة 3). محطات بينثاميانا أ. كما تزرع بسهولة ويترك الكبيرة، التي يتم تطعيمهم بسهولة المتبعة وتحليلها بسهولة بواسطة الفحص المجهري [كنفوكل].

Results

بيانات تمثيلية، إخلاص توضح النتائج المتوقعة من البروتوكولات وصف وتحديد "النائب تمف المتنقلة"، مقتبسة من يوان et al. ²¹-ويوجز الشكل 1A أولاً ثوابت رئيسية معربا عن كامل طول "تمف النائب" (1-268)، تمف النائب الثابتة والمتنقلة (التي تضم بقايا الأحماض الأمينية أول 50 من البروتين، 1-50)، والأنين المسح مشتقات V4A تنصهر فيها الحركة (التي تم إنشاؤها ك ووصف في "الخطوات 2-2"، 5-2 و 6) حين يلخص الشكل 1B ويوضحها توطين هذه البروتينات الم.......

Discussion

هذا البروتوكول له أربعة مكونات أساسية: مفهوم تحديد تسلسل ضروري وكاف لاستهداف Pd، تقسيم منهجي من بروتين الفائدة إلى الشظايا التي تنخفض تدريجيا في الطول، والصمامات تم اختبارها الشظايا إلى بروتين أوتوفلوريسسينت الذي يخدم كعلامة وشحن الجزيئات، والتحليل الوظيفي لاستهداف Pd في المعيشة زرع الأنسجة بعد تعبير عابر من البروتينات الانصهار اختبارها. لاحظ أن التعبير عابر المتبعة بوساطة يولد البيانات خلال فترة قصيرة نسبيا من الزمن، أي، عدة أيام، بالمقارنة مع الأشهر المطلوبة لإنتاج النباتات المعدلة وراثيا التي غالباً ما تستخدم.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر (CLSM)	Zeiss	LSM5	أي CLSM مع قدرات مماثلة هو برنامج Zen مناسب
لتصوير المجهر متحد البؤر	Zeiss	2009	الإصدار يجب أن يكون البرنامج متوافقا مع CLSM المستخدم
Quickchange II مجموعة طفرات الموجهة إلى الموقع	Agilent	200523
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406
MES	Sigma-Aldrich	69892
محاقن بدون إبر	BD	309659
MgCl2< / sub>	FisherScientific	M33-500
Spectinomycin	سيجما ألدريتش	S4014
ريفامبيسين	سيجما ألدريتش	R3501
أمبيسيلين	سيجما ألدريتش	A0166