نصف المقايسات المتقطعة الحساسة القائمة على الهلام لفحص حركية بدء الخيوط المتأخرة باستخدام بروتينات النسخ المتماثل للعاثية T7.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نقدم هنا بروتوكولات للفحص الحركي لتخليق الحمض النووي المتأخر في المختبر بواسطة بروتينات النسخ المتماثل للعاثية T7. يعد T7 replisome أحد أبسط أنظمة النسخ المتماثل المعروفة ، ويتكون من أربعة بروتينات فقط ، وهي ميزة جذابة للتجارب الكيميائية الحيوية. يتم التركيز بشكل خاص على تخليق بادئات الريبونوكليوتيدات بواسطة T7 primase-helicase ، والتي يستخدمها بوليميراز الحمض النووي لبدء تخليق الحمض النووي. نظرا لأن آليات تكرار الحمض النووي محفوظة عبر التطور ، يجب أن تكون هذه البروتوكولات قابلة للتطبيق ، أو مفيدة كنقطة انطلاق مفاهيمية ، للمحققين الذين يستخدمون أنظمة نموذجية أخرى. البروتوكولات الموضحة هنا حساسة للغاية ويمكن للمحقق المتمرس إجراء هذه التجارب والحصول على بيانات لتحليلها في غضون يوم تقريبا. القطعة المتخصصة الوحيدة من المعدات المطلوبة هي أداة تدفق سريع التبريد ، ولكن هذه القطعة من المعدات شائعة نسبيا ومتاحة من مصادر تجارية مختلفة. ومع ذلك ، فإن العيوب الرئيسية لهذه المقايسات تشمل استخدام النشاط الإشعاعي والإنتاجية المنخفضة نسبيا.
المقدمة
تكرار الحمض النووي هو ميزة الحفظ لجميع أشكال الحياة الخلوية. في حين هوية وعدد من مكونات النسخ المتماثل تختلف على نطاق واسع، ويشارك في الآليات العامة عبر تطور 1. هنا، نحن تصف والتجارب الحركية متقطعة القائم على هلام، وذلك باستخدام ركائز المشعة، التي تهدف إلى فهم حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا في المختبر عن طريق مكونات جسيم مكرر T7. آلية تكرار T7 عاثية بسيطة جدا، تتكون من البروتينات أربعة فقط (بوليميريز الحمض النووي، GP5، وعامل processivity لها، كولاي thioredoxin، وGP4-بريميز هيليكاز bifunctional، وبروتين DNA واحد الذين تقطعت بهم السبل ملزم، GP2. 5) 2. هذه الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: اتبع جميع الأنظمة المؤسسية بشأن الاستخدام الآمن والتخلص من المواد المشعة، بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر، واستخدام معدات الوقاية الشخصية، مثل القفازات، ونظارات السلامة، معطف المختبر، والدروع الاكريليك المناسبة.
ملاحظة: يتكون عازلة معيار من 40 ملي HEPES-كوه، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي الغلوتامات البوتاسيوم، 5 ملي DTT و 0.1 ملي EDTA (ومسبقة الصنع هذا المخزن المؤقت عند تركيز 5X) و 0.3 ملم من كل dNTP. ويتم تنقية البروتينات تكرار T7 كما هو موضح 8 و 9 و 10. الحمض ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وقد تم الحصول على النتائج الموضحة في الشكل 1A كما هو موضح في الخطوة 1 من البروتوكول، أي عن طريق أخذ عينات رد فعل التوليف التمهيدي يحفزه GP4 في ظل ظروف متعددة دوران يدويا. هنا، مجموعة واسعة من المنتجات بعد الكهربائي للهلام يمكن ملاحظتها باستخدام CTP المسمى مع 32 P في α موقف في تفاعلات التخليق التمهيدي (الشكل 1A). مقدمة المسمى، CTP، يظهر أعلى التنقل ويهاجر باتجاه الجزء السفلي من ه.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
العامل الأكثر أهمية في أداء هذه التجارب هو توافر انزيم المنقى نشطة للغاية. خلال عملنا مع GP4، على سبيل المثال، وجدنا أن تخزين الإنزيم المنقى في المخزن (20 ملي فوسفات البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.4، 0.1 ملي EDTA، 1 ملم DTT) التي تحتوي على 50٪ الجلسرين في -20 درجة مئوية يؤدي إلى انخفاض في النشاط المحدد لإعداد أكثر من بضعة أشهر. لذلك نحن الآن فلاش تجميد قسامات صغيرة من GP4 النقي في 25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA، 1 ملم TCEP، و 1.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر أعضاء مختبر C.C.R. على التعليقات و S. Moskowitz على إعداد الشكل. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية F32GM101761 (A.J.H.) و GM54397 (C.C.R.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| بلورات تريس محددة مسبقا درجة الحموضة 7.5 | SIGMA | T4128 | |
| قاعدة تريس | SIGMA | 93362 | |
| L-حمض الجلوتاميك ملح البوتاسيوم أحادي الهيدرات | SIGMA | G1501 ؛ | |
| كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدرات | Mallinckrodt للكيماويات | 5958-04 | |
| 1،4-Dithiothreitol | J.T. بيكر | F780-02 | |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) حمض Tetraacetic ، ملح ثنائي الصوديوم ، ثنائي هيدرات | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [&alpha ؛ -32< / sup>P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | مشعة ، واتخاذ تدابير وقائية |
| [&gamma ؛ - 32 < / sup> P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | مشع ، واتخاذ تدابير وقائية |
| 100 mM dATP ، dCTP ، dGTP ، dTTP ؛ | Affymetrix | 77100 | أربعة dNTPs جزء من مجموعة |
| 100 ملي مولار ATP و CTP | Epicenter | RN02825 | جزء من مجموعة NTP |
| يبني ssDNA | تقنيات الحمض النووي المتكاملة | N / A | تسلسلات مخصصة ؛ |
| الميثانول | ماكرون فاين كيماويات | 3017-08 | |
| فورماميد | ثيرمو سيانتيفيك | 17899 | |
| بروموفينول أزرق | SIGMA | B8026 ؛ | |
| سيلين زيانول | SIGMA | X4126 | |
| أكريلاميد | SIGMA | A9099 | سامة |
| < م > N ، N & Prime ؛ < / م > - ميثيلين بيساكريلاميد | SIGMA | M7279 ؛ | سام |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| حمض البوريك | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| أداة إخماد التدفق السريع | Kintek | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | غير متاح | |
| Kaleidagraph | برنامج Synergy | غير متاح |
المراجع
- Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
