يصف هذا البروتوكول إعادة تشكيل جسيم نووي يحتوي على تفاضلي الهستونات شقيقة المسمى النظير. وفي الوقت نفسه، جسيم نووي تعديل غير متماثلة بعد translationally يمكن أن تتولد بعد استخدام نسخة هيستون premodified. هذه الاستعدادات يمكن استخدامها بسهولة لدراسة آليات التعديل المتبادل، في وقت واحد في كل من الهستونات الشقيقة، وذلك باستخدام عالية الدقة الرنين المغناطيسي الطيفي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعادة تشكيل جسيم نووي مع الهستونات الأخت المسمى النظائر-تفاضلي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
جسيم نووي تعديل غير متماثلة يحتوي على نسختين من هيستون (الهستونات شقيقة) مزينة مجموعات متميزة من التعديلات بعد متعدية (PTMs). يتم التعرف عليهم حديثا أنواع وسائل غير معروفة من إنشاء والآثار الوظيفية. الأساليب التحليلية الحالية غير كافية للكشف عن حدوث-نسخة محددة من PTMs على الهستونات شقيقة nucleosomal. ويعرض هذا البروتوكول طريقة الكيمياء الحيوية لإعادة في المختبر من جسيم نووي يحتوي على تفاضلي الهستونات شقيقة المسمى النظير. مجمع الناتجة يمكن أن يكون أيضا تعديل غير متماثلة، بعد بما في ذلك حمام هيستون premodified خلال refolding من subcomplexes هيستون. ويمكن لهذه الاستعدادات جسيم نووي غير المتماثلة يكون بسهولة كان رد فعل مع إنزيمات تعديل هيستون لدراسة الآليات عبر الحديث التعديل الذي فرضته PTM غير متماثلة قبل إدراجها باستخدام التحليل الطيفي النووي بالرنين المغناطيسي (NMR). بشكل خاص، ردود فعل التعديل فيفي الوقت الحقيقي يمكن تعيين بشكل مستقل على اثنين من الهستونات الشقيقة عن طريق إجراء أنواع مختلفة من التجارب علاقة الرنين النووي المغناطيسي، مصممة خصيصا لنوع النظير منها. توفر هذه المنهجية وسيلة لدراسة آليات الحديث المتبادل التي تساهم في تشكيل وانتشار أنماط PTM غير المتماثلة على المجمعات nucleosomal.
المقدمة
وتعبئتها الحمض النووي حقيقية النواة بإحكام داخل نواة الخلية إلى لونين. لبنة أساسية من لونين هو الجسيمات الأساسية جسيم نووي يحتوي على ~ 147 شركة بريتيش بتروليوم من الحمض النووي ملفوفة حول مجمع octameric تتكون من نسختين لكل من histones الأساسية الأربعة (H3، H4، H2A، H2B). البروتينات هيستون تؤوي مجموعة كبيرة من التعديلات بعد متعدية (PTMs). هذه التبديلات التساهمية تحفز تغييرات في هيكل الكروماتين، سواء بصورة مباشرة أو عن طريق التأثير على الكيمياء الفيزيائية للنظام وبشكل غير مباشر من خلال تجنيد أنشطة إعادة عرض لونين 1، 2، 3. من خلال هذه الوس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعادة تشكيل جسيم نووي مع تفاضلي النظائر المسمى (والتعديل غير متماثلة) الأخت الهستونات
ملاحظة: يصف البروتوكول الحالي إعادة تشكيل جسيم نووي مع تفاضلي المسمى النظير هيستون H3. ولهذه الغاية، تم استخدام اثنين من حمامات من H3 هيستون. كان واحدا 15 N-وصفت وتحتوي على 6xHis العلامة في N-محطة والثانية 13 C-وصفت والواردة الببتيد بكتيريا (WSHPQFEK) تنصهر في N-محطة. تم فصل كل من العلامات من تسلسل H3 الأصلي مع التبغ إحفر فيروس (TEV) الموقع الاعتراف البروتيني. لإعداد جسيم نووي إضافي تعديل غير متماثلة، واحد من اثنين من حمامات H3 يتم تضمينها في شكل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم عزل الأنواع octameric refolded بشكل صحيح بعد سلسلة من الخليط إعادة من خلال عمود هلام الترشيح (الشكل 2). يتعرض تجمع أعيد octameric تحتوي على ثلاثة أنواع مختلفة من octamers إلى مخطط جنبا إلى جنب تنقية تقارب. يتم جمع عينات من جميع الخطوات وتحليلها بواسطة SDS-PAGE، وبعد ذلك البنك الدولي. ويتحقق التحقق من تنفيذ الصحيح من البروتوكول الذي يؤدي إلى العزلة من الأنواع غير المتماثلة باتباع وجود علامات تقارب اثنين (أصول أمريكية لاتينية وSt.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لإعادة جسيم نووي، البروتوكول الحالي يستخدم 165 نقطة أساس القالب الحمض النووي طويلة تحتوي على 601 ويدوم المواقع جسيم نووي تسلسل 20، ولكن من المتوقع أداء مماثل باستخدام أطوال مختلفة من قوالب الحمض النووي. تم تصميم بروتوكول ويعمل باستخدام أنواع غير المتماثلة من H3 هيستون. مع المبدأ نفسه، يمكن تطبيق الطريقة أيضا لhistones الأساسية الأخرى، وبالإضافة إلى ذلك يمكن استخدامها لإعادة بناء مجمعات تقل اثنين من histones الأساسية متميزة مع العلامات النظائر المختلفة. بروت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلف ليس لديه ما يفصح عنه.
شكر وتقدير
بفضل مؤلف الدكتور فيليب Selenko (FMP-برلين) لتوفير مساحة الرطب مختبر والبنية التحتية لإجراء تجارب والألمانية للبحوث (DFG) لتمويل العمل من خلال منحة بحثية (LI 2402 / 2-1).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | استخدام جودة عالية Gu-HCl |
| Tris & nbsp ؛ | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR الكيميائية | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2H2PO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| الجسم المضاد للمسبار | الخاص به سانتا كروز | sc-8036 | |
| Strep-tactin مترافق HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| تحميل مرحبا 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6 - 8 كيلو دالتون غشاء غسيل الكلى | Spectrumlabs | أطياف / بور 1 ، 132650 | |
| 50 كيلو دالتون غشاء غسيل الكلى | Spectrumlabs | أطياف / بور 7 ، 132129 | |
| 10 كيلو دالتون وحدة الترشيح المركزي | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30 كيلو دالتون مرشح مركزي وحدة | Merck Millipore | UFC903024 | |
| مطياف الرنين المغناطيسي النووي للحالة الحل | تردد تشغيل لا يقل عن 500 ميجاهرتز ، مزود بمسبار تبريد ثلاثي الرنين | ||
| < قوي > اسم عازل < / قوي > | <قوي > مكون < / قوي > | ||
| مفتوح عازلة | 7 م Guanidinium HCl | ||
| 20 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 7.5 | |||
| 10 ملي مولار DTT | |||
| عازلة قابلة للطي | 10 ملم تريس ، درجة الحموضة 7.5 | ||
| 2 م كلوريد | |||
| 1 ملي مولار EDTA | |||
| 2 ملي مولار مخزن فحص DTT | |||
| 25 ملي مولار Na2< / sub>H2< / sub>PO4< / sub> ، درجة الحموضة 6.8 | |||
| 25 ملي كلوريد | |||
| 2 ملي مولار DTT |
المراجع
- Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The Biology of Chromatin Remodeling Co....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
