Method Article

عمليات الاستخراج الملح متسلسلة لتحليل الكروماتين الأكبر ربط خصائص لتعديل مجمعات الكروماتين

DOI:

10.3791/55369

⸱

October 2nd, 2017

 ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخراج الملح متسلسلة من البروتينات الكروماتين ملزمة أداة مفيدة لتحديد خصائص ربط مجمعات كبيرة من البروتين. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لتقييم دور مفارز الفردية أو المجالات في تقارب شامل بروتين معقدة لمعظم الكروماتين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضيح خصائص ربط الكروماتين استهداف البروتينات يمكن أن تكون صعبة للغاية بسبب الطبيعة المعقدة الكروماتين والطابع غير المتجانس لمجمعات الكروماتين--تعديل معظم الثدييات. وللتغلب على هذه العقبات، نحن قد تكيفت مقايسة استخراج ملح متسلسلة (SSE) لتقييم الانتماءات ملزم النسبية لمجمعات الكروماتين زمنياً. هذا التحليل سهلة ومباشرة يمكن أن يستخدمها غير الخبراء لتقييم الفرق النسبي في ملزمة تقارب من مجمعين ذات الصلة، والتغييرات في تقارب مجمع عند وحدة فرعية يتم فقدان أو يتم إلغاء تنشيطه مجال فردية، والتغيير في ملزمة تقارب بعد التعديلات للمناظر الطبيعية الكروماتين. بشكل تسلسلي إعادة تعليق الكروماتين الأكبر في زيادة كميات من الملح، نحن قادرون على الشخصية شطف بروتين معين من الكروماتين. استخدام ملفات التعريف هذه، نحن قادرون على تحديد كيف تؤثر التعديلات في مجمع الكروماتين--تعديل أو تعديلات على البيئة الكروماتين على التفاعلات ملزمة. اقتران SSE مع غيرها من فحوصات في المختبر و في فيفو ، يمكننا تحديد أدوار المجالات الفردية والبروتينات في وظائف معقدة في مجموعة متنوعة من البيئات الكروماتين.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنظيم الحمض النووي في الخلايا حقيقية النواة هو نظام معقد ومتطورة هو رقابة مشددة من جانب مجموعة متنوعة بروتينات بتنسيق الاستجابات للمثيرات داخل الخلية وخارج الخلية. الحمض النووي هو الملتفة حول هيستون أوكتاميرس للنموذج نوكليوسوميس، الذي يمكن توزيعها على طول الحمض النووي فضفاضة أو ضغط في اللفات ضيقة1. ويعرف هذا الترتيب الهيكلي للحمض النووي و histones الكروماتين، الذي تنظمه شبكة بروتينات بالقراءة والكتابة، ومحو التعديلات متعدية الجنسيات (PTM) وظيفة في هيستونيس2. تغيير بعض هيستون بتمس، مثل أسيتيلاتيون، المسؤول عن الحمض الأميني تودع، تغيير التفاعلات بين هيستونيس والحمض النووي2. هيستون بتمس تخدم أيضا تجن....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-الاستعدادات

السكروز
  1. تحضير 100 مل من محلول ناقص التوتر "المخزن المؤقت ج:" 0.3 متر، 60 ملم بوكل، 60 ملم تريس pH 8.0، 2 مم يدتا، و 0.5% NP-40. تخزين في درجة مئوية 4-
    ملاحظة: بعض خطوط الخلايا، مثل HEK293T، تتطلب الظروف ليسينج أقل صرامة. إذا نوى بسهولة، استخدام تعديل المخزن المؤقت ج: 25 مم هيبيس درجة الحموضة 7.6، 25 مم بوكل، 5 مم مجكل 2، يدتا 0.05 مم، والغليسيرول NP-40، و 10% 0.1%-
  2. تعد حلاً أسهم 250 مل من 2 x mRIPA الحل: 100 مم تريس pH 8.0، ديوكسيتشولاتي الصوديوم NP-40، و 0.5% 2%-
  3. تعد حلاً أسهم 100 مل من كلوريد الصوديوم م 5-
  4. باستخدام x mRIPA وحلول كلوريد الصوديوم م 5، 2 إعداد 50 مل من 1 x mRIPA حل لكل من تركيزات ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الورقة، ونظهر بمزايا وتطبيقات أسلوب استخراج الملح متسلسلة استخداماً (SSE) التي كنا قد تكيفت من الأدب6. في الشكل 1، قارنا إمكانية تكرار نتائج لمشاريع الأعمال الصغيرة لاستخراج البروتينات غير التتابع عن طريق الكشف عن أنماط شطف ARID1a و PBRM1. ونلاحظ دائماً أن ARID1a، وحدة فرعية BAF، الوتيس في المقام الأول 200 ملم كلوريد الصوديوم، و PBRM1، فرعية بباف حصري، الوتيس في المقام الأول 300 ملم كلوريد الصوديوم. ويبين ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصف التفاعلات بين البروتينات والكروماتين من خلال عمليات استخراج الملح هو أسلوب شائع التي استخدمت لعقود14،15؛ بيد أنه قد لا تم بشكل منهجي الأمثل قبل الكشف عن فائدته بالكامل. علينا أن نظهر كيف يوفر هذا الأسلوب المتسلسل بطريقة سريعة وغير مكلفة لتمييز التغييرات في ربط الكروماتين عندما يتم تغيير البروتين أو البيئة. SSE قابلة للتكيف للغاية ويمكن تحسينه للأمثل، والأهم من ذلك أنها بسيطة من الناحية التقنية ويتطلب أي معدات متخصصة. الجوانب الرئيسية التي تحتاج إلى أن يكون ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفين قد لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل على جائزة باحث الخامس (V2014-004) وباحث الخامس بالإضافة إلى جائزة (D2016-030) من مؤسسة الخامس "بحوث السرطان"، وأمريكا سرطان المجتمع المؤسسية منحة بحثية (ACS سيبحث المنحة 58-006-53) إلى مركز جامعة بوردو عن السرطان البحث. أ وأيد "منح الهبات بورتش الدراسات العليا" إلى إدارة الصيدلة الجزيئية والكيمياء الدوائية جامعة بوردو ب. غ..

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
كلوريد الصوديوم ، كريستال 2.5 كجم AR (ACS)أفانتور / ماكرون7581-06
سكروز ، كريستال 500 جم AR & uml ؛ (ACS)أفانتور / ماكرون8360-04
كلوريد البوتاسيوم ، حبيبي 500 جم AR & (ACS)أفانتور / ماكرون6858-04
قاعدة Trizma (R) ، المعيار الأساسي والمخزن المؤقت ، > = 99.9٪ (المعايرة بالتحليل الحجمي) ، البلوريSigma-AldrichT1503-1kg
EDTA (Ethylenedinitrilo) حمض Tetraacetic ، ملح ثنائي الصوديوم ، ثنائي الهيدرات 125 جم AR (ACS)أفانتور / ماكرون4931-02
NONIDET P-40 الركيزة ، 100 مل UN3082AmrescoE109-100ML
HEPES Buffer محلول (1M)Gibco15630-080
كلوريد المغنيسيوم ، 6-هيدرات ، كريستال 500 جم AR & uml ؛ (ACS)أفانتور / ماكرون5958-04
جلسرين ، 1 لترأمريسكو0854-1 لتر
ملح الصوديوم حمض ديوكسيكوليك ، 100 جرامأمريسكو0613-100 جرام
إيبندورف ريسيرش بلس ماصةفيشر سيانتيفيك13-690-032
إيبندورف 5424 R أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المبردةإيبندورف5424 R
الماوس الثانوي IgG HRP المرتبطإشارات الخلية7076
إشارات الخلية المرتبطة بالأرنب الثانوي IgG HRP7074
BMI-1 الجسم المضادMillipore
PBRM1 الجسم المضادBethylA301-591A
ARID1a الجسم المضادسانتا كروزsc-32761
BRD4 الجسم المضادBethylA301-9852a
(+) JQ1شركة كايمان للكيماويات11187
شركة ساهاكايمان للكيماويات10009929
دوكسوروبيسينAK Scientific25316-40-9
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)ماكرون4948-02
ميني ترانس بلب سيلبيوراد1703930
ميني جل تانكثيرموفيشرA25977
الألبومين ، الأبقار (BSA)Amresco0332-100gيستخدم كحل 5٪ في PBS-T كحل حجب للبقع الغربية
Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)Life TechnologiesB0001
Bolt LDS Sample Buffer (4x)Life TechnologiesB0007
PageRuler Plus سلم البروتين الملون ، 10 إلى 250 كيلو دالتونThermoFisher26619
ميثيل كحول ،ماكرون3041-10
تربسين كيدتا ، 1Xسيلجرو25-053-CI
أزيد الصوديوم ، 250 جرام UN1687أمريسكو0639-250 جرام
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) 500 جرام UN1325Amresco0227-500G
جلايسين ، للرحلان الكهربائي ، > = 99٪سيجما ألدريتشG8898-1 كجم
بيج توب أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، البولي بروبيلينVWR20170-333
1000 & L Pipet TipsVWR83007-382
NuPAGE Bis-Tris المواد الهلامية مسبقة الصب 4-12٪InvitrogenNW04125BOX
Leupeptin Hemisulfate ، 5 MGRPI Research Products22035-0.005تستخدم لمحلول مثبط البروتين.
APROTININ ، 10 مجممنتجات أبحاث RPI20550-0.01تستخدم لمحلول مثبطات البروتينات.
الببستاتين أ ، 5 مجممنتجات أبحاث RPI30100-0.005تستخدم لمحلول مثبطات الإنزيم البروتيني.
OVCA429 الخلاياهدية من كارين كاودن دال دكتوراه
HEK293TATCCCRL-3216
خلايا HeLaATCCCCL-2
McCoy's 5A mediaCorning Mediatech10-050-CV
DMEMCorning Mediatech10-013-CV
الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) ، مسحوقCorning Mediatech50-011-PC
MEM NEAA (100X) الأحماض الأمينية غير الأساسيةGibco11140-050
FB-11: مصل الأبقار الجنينية ، مصدر أمريكيأوميغا ScientificFB-11
Penicillin-Streptomycin SolutionLife Technologies15140-122
GlutamaxLife Technologies35050-061
بيروفات الصوديومLife11360070
VWR Power المصدر:VWR13-690-032
لامائي تقنيات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
  2. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
  3. Musselm....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sequential Salt ExtractionChromatin BindingProtein ElutionSalt ConcentrationWestern BlotSDS PAGE GelHypotonic BufferModified RIPAProtein Loading DyeImage Analysis

Related Articles