عمليات الاستخراج الملح متسلسلة لتحليل الكروماتين الأكبر ربط خصائص لتعديل مجمعات الكروماتين

Summary

استخراج الملح متسلسلة من البروتينات الكروماتين ملزمة أداة مفيدة لتحديد خصائص ربط مجمعات كبيرة من البروتين. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لتقييم دور مفارز الفردية أو المجالات في تقارب شامل بروتين معقدة لمعظم الكروماتين.

Abstract

توضيح خصائص ربط الكروماتين استهداف البروتينات يمكن أن تكون صعبة للغاية بسبب الطبيعة المعقدة الكروماتين والطابع غير المتجانس لمجمعات الكروماتين--تعديل معظم الثدييات. وللتغلب على هذه العقبات، نحن قد تكيفت مقايسة استخراج ملح متسلسلة (SSE) لتقييم الانتماءات ملزم النسبية لمجمعات الكروماتين زمنياً. هذا التحليل سهلة ومباشرة يمكن أن يستخدمها غير الخبراء لتقييم الفرق النسبي في ملزمة تقارب من مجمعين ذات الصلة، والتغييرات في تقارب مجمع عند وحدة فرعية يتم فقدان أو يتم إلغاء تنشيطه مجال فردية، والتغيير في ملزمة تقارب بعد التعديلات للمناظر الطبيعية الكروماتين. بشكل تسلسلي إعادة تعليق الكروماتين الأكبر في زيادة كميات من الملح، نحن قادرون على الشخصية شطف بروتين معين من الكروماتين. استخدام ملفات التعريف هذه، نحن قادرون على تحديد كيف تؤثر التعديلات في مجمع الكروماتين--تعديل أو تعديلات على البيئة الكروماتين على التفاعلات ملزمة. اقتران SSE مع غيرها من فحوصات في المختبر و في فيفو ، يمكننا تحديد أدوار المجالات الفردية والبروتينات في وظائف معقدة في مجموعة متنوعة من البيئات الكروماتين.

Introduction

تنظيم الحمض النووي في الخلايا حقيقية النواة هو نظام معقد ومتطورة هو رقابة مشددة من جانب مجموعة متنوعة بروتينات بتنسيق الاستجابات للمثيرات داخل الخلية وخارج الخلية. الحمض النووي هو الملتفة حول هيستون أوكتاميرس للنموذج نوكليوسوميس، الذي يمكن توزيعها على طول الحمض النووي فضفاضة أو ضغط في اللفات ضيقة¹. ويعرف هذا الترتيب الهيكلي للحمض النووي و histones الكروماتين، الذي تنظمه شبكة بروتينات بالقراءة والكتابة، ومحو التعديلات متعدية الجنسيات (PTM) وظيفة في هيستونيس². تغيير بعض هيستون بتمس، مثل أسيتيلاتيون، المسؤول عن الحمض الأميني تودع، تغيير التفاعلات بين هيستونيس والحمض النووي². هيستون بتمس تخدم أيضا تجنيد المنظمين النسخي، remodelers الكروماتين، وآلية إصلاح تلف الحمض النووي، وآلات النسخ المتماثل الحمض النووي لمناطق محددة من الجينوم³.

معظم طرق لدراسة التفاعلات بين لونين أما التحقيق التفاعلات صغيرة الحجم أو تنطوي على تحليلات المجين على نطاق كبير. كثيرا ما تستخدم في المختبر ملزمة الدراسات الفردية المجالات المؤتلف مع الببتيدات هيستون أو الحمض النووي في فحوصات مثل الببتيد بولدوونس والاستقطاب الأسفار، التفريد التنقل shift فحوصات (أمسا) والقياس المعايرة متحاور. لأن هذه الاختبارات عادة التركيز على مجال البروتينات فردية، تيسير فهم قطعة صغيرة من اللغز، ولكنها لا تسمح لنا بفهم الطبيعة التعاونية للبروتينات متعددة المجالات، ناهيك عن دورها في البروتين المتعددة المجمعات. تتم إضافة طبقة أخرى من المعضلة بتشكيل مجمعات الكروماتين--تعديل معظم الثدييات غير متجانسة. هذا التغاير البروتين، في تركيبة مع الطبيعة الدينامية للمناظر الطبيعية الكروماتين، يجعل من تحدي بإيجاز في فيفو ملزمة تفاعلات البروتينات الكروماتين على الكروماتين في المختبر.

في فيفو الأساليب تقدما كبيرا؛ ومع ذلك، أنها غالباً مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وتحديا من الناحية التقنية. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين متبوعاً بالتسلسل (الرقائق-seq) مفيد جداً لتحديد التعريب من البروتينات والتعديلات هيستون عبر الجينوم، إلا أن ذلك يتطلب التحسين الكبير⁴. غالباً ما تكون البروتينات كروسلينكيد بلونين للحفاظ على التفاعلات؛ ومع ذلك، هذا يمكن أن تنتج التفاعلات مصطنعة، وقد يسبب حانمه إخفاء⁵. وعلاوة على ذلك، تتطلب إيمونوبريسيبيتيشنز (IP) أجسام مضادة محددة للغاية، والتحسين واسعة من قص الحمض النووي وشروط الملكية الفكرية برقاقة--قبكر استخدام موقع ربط معروفة، التي غالباً لا مسبقاًالمتوفرة. بعد تحسين ظروف رقاقة، تجهيز العينات مكلف ويتطلب عدة أسابيع إلى أشهر لتسلسل وتحليل. على الرغم من أن هذا الأسلوب لا تقدر بثمن لتحديد إضفاء الطابع المحلي على الكروماتين ملزمة البروتينات عبر الجينوم، التكلفة والالتزام بالوقت جعله الباهظة لاستخدام هذا الأسلوب لتوليد فرضيات حول كيفية تأثير التغييرات الصغيرة على خصائص الربط العالمي .

في هذه الورقة، ويصف لنا كيف يمكن استخدام مقايسة استخراج ملح متسلسلة (SSE) لفحص ملفات تعريف عالمي ملزم البروتينات المرتبطة الكروماتين وتميز كيف التغييرات في التشكيل جانبي PTM المعقدة، أو العالمية بروتين، يمكن أن يغير التفاعلات. وعلى الرغم من عمليات استخراج الملح تقنية تستخدم عادة، وعلى نطاق واسع، نظهر كيف هذا الأسلوب المتسلسل استنساخه للغاية وتنوعاً. SSE يسمح لنا بوصف كيفية إسهام وحدة فرعية مفردة معقدة أو حتى مجال مفرد إلى التقارب في المجمع العام لمعظم الكروماتين. SSE يمكن استخدامها أيضا لتحديد إذا كان الربط من البروتين تتأثر بالتغيرات في المشهد الكروماتين، وتقديم فرضيات مثيرة للاهتمام لاستهداف مارك هيستون التي يمكن تأكيدها باستخدام رقاقة seq وغيرها من الدراسات على نطاق واسع الجينوم.

ونحن أصلاً تكييف هذا الأسلوب من وو وآخرون، دراسة لوظيفة Polybromo1 (PBRM1) في ربط^6،ريموديلير الكروماتين بباف⁷. باستخدام هذا الأسلوب، تحدد دور PBRM1 لربط الكروماتين داخل الكروماتين بباف يعيد البناء المعقدة وثم تحديد المساهمة النسبية برومودومينس الفردية الستة لهذه الدالة⁷.

هنا ونحن تصف كيفية تحسين هذه الطريقة لاستكشاف ملزمة الكروماتين في أنواع الخلايا المختلفة، لتقييم تقارب ملزم النسبية من الكروماتين مماثلة تعديل المجمعات، وأن ينظر في تشريد البروتين من الكروماتين مثبط كيميائية، و لتحديد آثار ملزمة الكروماتين بعد التعديلات للمناظر الطبيعية الكروماتين.

Protocol

1-الاستعدادات

السكروز

1. تحضير 100 مل من محلول ناقص التوتر "المخزن المؤقت ج:" 0.3 متر، 60 ملم بوكل، 60 ملم تريس pH 8.0، 2 مم يدتا، و 0.5% NP-40. تخزين في درجة مئوية 4-
   ملاحظة: بعض خطوط الخلايا، مثل HEK293T، تتطلب الظروف ليسينج أقل صرامة. إذا نوى بسهولة، استخدام تعديل المخزن المؤقت ج: 25 مم هيبيس درجة الحموضة 7.6، 25 مم بوكل، 5 مم مجكل ₂، يدتا 0.05 مم، والغليسيرول NP-40، و 10% 0.1%-
2. تعد حلاً أسهم 250 مل من 2 x mRIPA الحل: 100 مم تريس pH 8.0، ديوكسيتشولاتي الصوديوم NP-40، و 0.5% 2%-
3. تعد حلاً أسهم 100 مل من كلوريد الصوديوم م 5-
4. باستخدام x mRIPA وحلول كلوريد الصوديوم م 5، 2 إعداد 50 مل من 1 x mRIPA حل لكل من تركيزات الملح ستة: 0، 100 مم، 200 مم، 300 مم، مم 400، و 500 ملم كلوريد الصوديوم. قبل البدء بالتجربة، بارد جميع الحلول على مدت
5. تنمو الخلية خطوط تحت الظروف المرجوة.
   ملاحظة: عند تحديد الآثار المترتبة على إسقاط بروتين، يجب مقارنة SSE للسطر ضربة قاضية للخلايا wildtype. يجب إجراء هذه SSE جنبا إلى جنب. للحصول على أمثلة استخدام مثبطات الكيميائية أو المحفزات، الرجوع إلى الأقسام 3-5-

2. استخراج الملح متسلسلة الأساسية

الخلايا

1. الحصاد 8 مليون لكل شرط ويغسل مرتين مع 5 مل من الجليد الباردة PBS.
   ملاحظة: من المهم لعدد متساو من الخلايا بتركيزات البروتين تعادل. العدد الدقيق للخلايا قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل لخطوط الخلايا الفردية أو بروتينات معينة. من المهم أن لا يكون كثيرة جداً، كما أن الزيادة في تركيزات البروتين سيمنع المراقبة منحنى شطف، الذي يعتمد على الربط التوازن. ومع ذلك، مع عدد قليل جداً من الخلايا قد لا يكون هناك ما يكفي من البروتين للكشف عن المنحنى، وبيليه الكروماتين أصعب لعزل ويمكن أن تضيع بين الكسور.
2. تعليق إعادة الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت A + مثبطات البروتياز، نقل إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الصغرى، وتدوير أعلى على القاع في درجة 4 مئوية للحد الأدنى 10
عزل
3. الأنوية باستخدام الطرد المركزي في 6000 x ز لمدة 5 دقائق في درجة مئوية 4-
   ملاحظة: بعد هذه الخطوة المغلف النووي ينبغي أن يظل سليما. إذا كان المغلف النووية سليمة، بيليه إعادة ستعلق تماما؛ ومع ذلك، عندما يتم تفكيك المغلف ويطلق الكروماتين، بيليه سوف لا إعادة تعليق. إذا لم يكن المغلف النووية سليمة بعد المخزن المؤقت بالحضانة، استخدم "تعديل المخزن المؤقت ألف"
مثبطات
4. إضافة 200 ميليلتر مريبا 0 ملم كلوريد الصوديوم + مبطلات لكل بيليه نوى قبل إعادة تعليق بيليه. مجانسة كل عينة من بيبيتينج 15 مرة مع ماصة 1 مل. وينبغي إعادة تعليق بيليه بسهولة، ومع ذلك، سوف الأنوية هو بيبيتيد، وسوف تصبح العينة سميكة ولزجة ويصعب على "الماصة؛".
   1. من أجل وضع بيليه في التلميح، والاستفادة من نهاية طرف ماصة ضد الجزء السفلي من الأنبوب الطرد المركزي. بيليه لا تذوب تماما بمجرد الإفراج عن الحمض النووي من النواة، ولكن سيتم كسرها بيبيتينج المكياج.
5. عند الجميع قد تم تجانس العينات، احتضان جميع العينات في الثلج للحد الأدنى 3
   ملاحظة: قد تحتاج فترة حضانة الأمثل اعتماداً على بروتين الفائدة.
6. بيليه عزل الكروماتين سينتريفوجينج عينات لمدة 3 دقيقة في 6500 س ز على 4 درجة مئوية.
أنبوب
7. نقل المادة طافية للطرد مركزي نظيفة 1.5 مل. وسوف يكون هذا الكسر 0 ملم. هذا الحل مريبا 0 ملم يمكن أن تتصرف كخطوة غسيل لتحلل الأنوية وإزالة أي البروتينات فضفاضة لا ترتبط مع الكروماتين.
مثبطات
8. إضافة 200 ميليلتر مريبا 100 ملم كلوريد الصوديوم + مبطلات لكل بيليه الكروماتين قبل إعادة تعليق بيليه. تفكيك بيليه الكروماتين بيبيتينج بيليه صعودا وهبوطاً مرات 15-
   ملاحظة: من المهم أن تكون متسقة مع عدد مرات بيبيتيد بيليه في.
9. إينكوباتي على الجليد لمدة 3 دقائق. تسمح هذه الخطوة حضانة جميع العينات للوصول إلى حالة توازن، الذي يكتسي أهمية خاصة عندما تكون هناك نماذج متعددة-
10. الطرد المركزي في 6500 س ز لمدة 3 دقيقة 4 درجة مئوية ونقل طافية إلى أنبوب نظيفة 1.5 مل.
كرر
11. 2.6-2.10 لتركيزات الملح المتبقي.
    ملاحظة: بعد 400 مم كلوريد الصوديوم، ينبغي أن يكون واضحا وجلوبي مريبا بيليه ولن تبقى في الجزء السفلي من الأنبوب. يمكن وضع بيليه في غطاء أنبوب الطرد المركزي بينما المادة طافية معزولة.
12. ميليلتر 70 إضافة 4 × تحميل البروتين صبغ لكل جزء وتحميل 30 ميليلتر من كل جزء إلى هلام اكريلاميد الحزب الديمقراطي الصربي لتحليل لطخة غربية-
    ملاحظة: لتحديد الشخصية الملزمة من البروتين، من الأهمية بمكان تحميل وحدات تخزين ما يعادل تركيزات البروتين تساوي ليستي، بدلاً من تحميل-
13. القيام بوصمة عار غربية قياسية بنقل على غشاء واستخدام الأجسام المضادة الأساسي للبروتينات للفائدة-
14. إلى قوانتيتاتي البروتين الوتيد من الكروماتين، احتضان وصمة عار في الأسفار الأشعة تحت الحمراء إيرديي الأجسام المضادة الثانوية ووصمة عار الصورة مع تصوير. بينما يمكن استخدام أساليب أخرى للتنمية، نوصي fluorescence أو التصوير بالأشعة تحت الحمراء، كما أنها أكبر كمية في الطبيعة-
15. "استخدام إيماجيج" أو برامج مماثلة لحساب الكثافة للبروتين الوتيد في كل تركيز الملح. يمكن تحديد نمط شطف من البروتين الخاص بك للاهتمام بالرسوم البيانية كثافة الفرقة ضد تركيز الملح،.

3. استخراج الملح متسلسلة في حضور كل من " القارئ " مثبط

1. حصاد مجموعتين من الخلايا (4 مليون)، وعزل الأنوية كما هو الحال في SSE قياسية.
2. إعادة تعليق كلتا المجموعتين في 200 ميليلتر من مريبا 0 ملم كلوريد الصوديوم، واحتضان لمدة 3 دقائق. سيسمح هذا لإزالة أي البروتين حرة في الأنوية.
3. إضافة 200 ميليلتر مريبا 0 ملم كلوريد الصوديوم لكل بيليه. إضافة مثبط (2 ميليلتر من 1 ملم (+) JQ1) إلى واحد من العينة و [دمس] إلى مجموعة مراقبة-
4. أجيتاتي بيليه بيبيتينج 15 مرة، واحتضان على الجليد للحد الأدنى 5
5. الطرد المركزي في 6500 س ز لمدة 3 دقيقة 4 درجة مئوية ونقل طافية إلى أنبوب نظيفة 1.5 مل.
6. كرر 3، 3-4 من أجل كل تركيزات الملح وأداء وصمة عار غربية قياسية.

4. استخراج الملح متسلسلة في حضور كل من " الكاتب " مثبط

1. علاج الخلايا مع المانع (10 ميكرومتر ساها) أو [دمس] حاء 3
2. حصاد الخلايا 4 مليون لكل معاملة.
3. أداء SSE قياسية للعينات مع المانع إضافة إلى كافة المخازن المؤقتة.

5. متسلسلة "الملح استخراج الحمض النووي الأضرار التالية"

1. علاج الخلايا مع 1 ميكرومتر ميتوتريكسات حاء – 1
2. تغيير الوسائط في الخلايا وتسمح لهم باسترداد 3 ﻫ.
3. حصاد الخلايا 8 مليون وأداء SSE الأساسية-

6. استخراج الملح عدم متسلسلة

1. حصاد الخلايا 12 مليون وتغسل مع برنامج تلفزيوني.
2. الفجوة الخلايا حيث أن هناك 2 مليون من خلايا كل أنبوبة الطرد المركزي الصغير-
3. إعادة تعليق في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت A واحتضانها للحد الأدنى 10
4. عزل الأنوية باستخدام الطرد المركزي في 6000 x زاي
5. إعادة تعليق الكريات في ميليلتر 200 لكل من مخازن مريبا + كلوريد الصوديوم.
6. مجانسة كل عينة من بيبيتينج 15 مرة مع تلميح ماصة 1 مل.
7. إينكوباتي على الجليد للحد الأدنى 3
عزل في الكروماتين بالطرد المركزي في 6500 س ز
8. ونقل المادة طافية لتنظيف الأنابيب. إضافة ميليلتر 70 من تحميل صبغ وتشغيل 30 ميليلتر في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة لتحليل لطخة غربية-

Results

في هذه الورقة، ونظهر بمزايا وتطبيقات أسلوب استخراج الملح متسلسلة استخداماً (SSE) التي كنا قد تكيفت من الأدب⁶. في الشكل 1، قارنا إمكانية تكرار نتائج لمشاريع الأعمال الصغيرة لاستخراج البروتينات غير التتابع عن طريق الكشف عن أنماط شطف ARID1a و PBRM1. ونلاحظ دائماً أن ARID1a، وحدة فرعية BAF، الوتيس في المقام الأول 200 ملم كلوريد الصوديوم، و PBRM1، فرعية بباف حصري، الوتيس في المقام الأول 300 ملم كلوريد الصوديوم. ويبين ال...

Discussion

وصف التفاعلات بين البروتينات والكروماتين من خلال عمليات استخراج الملح هو أسلوب شائع التي استخدمت لعقود^14،15؛ بيد أنه قد لا تم بشكل منهجي الأمثل قبل الكشف عن فائدته بالكامل. علينا أن نظهر كيف يوفر هذا الأسلوب المتسلسل بطريقة سريعة وغير مكلفة لتمييز التغييرات في ربط الكروماتين عندما يتم تغيير البروتين أو البيئة. SSE قابلة للتكيف للغاية ويمكن تحسينه للأمثل، والأهم من ذلك أنها بسيطة من الناحية التقنية ويتطلب أي معدات متخصصة. الجوانب الرئيسية التي تحتاج إلى أن يكون ال...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
كلوريد الصوديوم ، كريستال 2.5 كجم AR (ACS)	أفانتور / ماكرون	7581-06
سكروز ، كريستال 500 جم AR & uml ؛ (ACS)	أفانتور / ماكرون	8360-04
كلوريد البوتاسيوم ، حبيبي 500 جم AR & (ACS)	أفانتور / ماكرون	6858-04
قاعدة Trizma (R) ، المعيار الأساسي والمخزن المؤقت ، > = 99.9٪ (المعايرة بالتحليل الحجمي) ، البلوري	Sigma-Aldrich	T1503-1kg
EDTA (Ethylenedinitrilo) حمض Tetraacetic ، ملح ثنائي الصوديوم ، ثنائي الهيدرات 125 جم AR (ACS)	أفانتور / ماكرون	4931-02
NONIDET P-40 الركيزة ، 100 مل UN3082	Amresco	E109-100ML
HEPES Buffer محلول (1M)	Gibco	15630-080
كلوريد المغنيسيوم ، 6-هيدرات ، كريستال 500 جم AR & uml ؛ (ACS)	أفانتور / ماكرون	5958-04
جلسرين ، 1 لتر	أمريسكو	0854-1 لتر
ملح الصوديوم حمض ديوكسيكوليك ، 100 جرام	أمريسكو	0613-100 جرام
إيبندورف ريسيرش بلس ماصة	فيشر سيانتيفيك	13-690-032
إيبندورف 5424 R أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المبردة	إيبندورف	5424 R
الماوس الثانوي IgG HRP المرتبط	إشارات الخلية	7076
إشارات الخلية المرتبطة بالأرنب الثانوي IgG HRP		7074
BMI-1 الجسم المضاد	Millipore
PBRM1 الجسم المضاد	Bethyl	A301-591A
ARID1a الجسم المضاد	سانتا كروز	sc-32761
BRD4 الجسم المضاد	Bethyl	A301-9852a
(+) JQ1	شركة كايمان للكيماويات	11187
شركة ساها	كايمان للكيماويات	10009929
دوكسوروبيسين	AK Scientific	25316-40-9
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)	ماكرون	4948-02
ميني ترانس بلب سيل	بيوراد	1703930
ميني جل تانك	ثيرموفيشر	A25977
الألبومين ، الأبقار (BSA)	Amresco	0332-100g	يستخدم كحل 5٪ في PBS-T كحل حجب للبقع الغربية
Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)	Life Technologies	B0001
Bolt LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	B0007
PageRuler Plus سلم البروتين الملون ، 10 إلى 250 كيلو دالتون	ThermoFisher	26619
ميثيل كحول ،	ماكرون	3041-10
تربسين كيدتا ، 1X	سيلجرو	25-053-CI
أزيد الصوديوم ، 250 جرام UN1687	أمريسكو	0639-250 جرام
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) 500 جرام UN1325	Amresco	0227-500G
جلايسين ، للرحلان الكهربائي ، > = 99٪	سيجما ألدريتش	G8898-1 كجم
بيج توب أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، البولي بروبيلين	VWR	20170-333
1000 & L Pipet Tips	VWR	83007-382
NuPAGE Bis-Tris المواد الهلامية مسبقة الصب 4-12٪	Invitrogen	NW04125BOX
Leupeptin Hemisulfate ، 5 MG	RPI Research Products	22035-0.005	تستخدم لمحلول مثبط البروتين.
APROTININ ، 10 مجم	منتجات أبحاث RPI	20550-0.01	تستخدم لمحلول مثبطات البروتينات.
الببستاتين أ ، 5 مجم	منتجات أبحاث RPI	30100-0.005	تستخدم لمحلول مثبطات الإنزيم البروتيني.
OVCA429 الخلايا	هدية من كارين كاودن دال دكتوراه
HEK293T	ATCC	CRL-3216
خلايا HeLa	ATCC	CCL-2
McCoy's 5A media	Corning Mediatech	10-050-CV
DMEM	Corning Mediatech	10-013-CV
الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) ، مسحوق	Corning Mediatech	50-011-PC
MEM NEAA (100X) الأحماض الأمينية غير الأساسية	Gibco	11140-050
FB-11: مصل الأبقار الجنينية ، مصدر أمريكي	أوميغا Scientific	FB-11
Penicillin-Streptomycin Solution	Life Technologies	15140-122
Glutamax	Life Technologies	35050-061
بيروفات الصوديوم	Life	11360070
VWR Power المصدر:	VWR	13-690-032