مقالة منهجية

تبخر تخفيض الشرط الثقافة يزيد من القدرة على التكاثر من متعددة الخلايا كروي التشكيل في صفيحة معايرة دقيقة

DOI:

10.3791/55403

⸱

مارس 7, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University in Olomouc

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فقدان متفاوتة من متوسطة من صفيحة معايرة دقيقة يؤثر على استنساخ تشكيل الورم كروي متعددة الخلايا موحد. تحسين ظروف التربية للحد من فقدان المتوسطة هامة من شأنها تحسين استنساخ تشكيل كروي ونتائج فحوصات على أساس كروي باستخدام تقنية السائل تراكب.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نماذج الورم التي تشبه عن كثب في ظروف المجراة تزداد شعبية في اكتشاف وتطوير الأدوية لفحص المخدرات المحتملة المضادة للسرطان. الكروية ورم الخلايا (MCTSes) تحاكي بشكل فعال الظروف الفسيولوجية من الأورام الصلبة، مما يجعلها ممتازة نماذج في المختبر لتعظيم الاستفادة الرصاص والتحقق من صحة الهدف. من مختلف التقنيات المتاحة للثقافة MCTS، طريقة السائل تراكب على الاغاروز هي واحدة من أكثر الطرق غير مكلفة لتوليد المراكز. ومع ذلك، فإن نقل موثوق بها من الثقافات المراكز باستخدام السائل تراكب لفحص عالية الإنتاجية يجوز المساس بها عدد من القيود، بما في ذلك طلاء صفيحة معايرة دقيقة (النواب) مع الاغاروز وirreproducibility من تشكيل المراكز موحد عبر الآبار. نواب عرضة بشكل كبير إلى حافة الآثار التي تنتج عن تبخر الزائد من المتوسط ​​من الخارج من لوحة، ومنع استخدام لوحة كاملة لمكافحة المخدراتالاختبارات. توفر هذه المخطوطة التحسينات الفنية التفصيلية لأسلوب السائل تراكب لزيادة قابلية واستنساخ تشكيل المراكز موحد. بالإضافة إلى ذلك، وتفاصيل عن بسيط، وأداة البرمجيات شبه التلقائي، وقابلة للتطبيق عالميا لتقييم المراكز ميزات بعد عرض العلاج من تعاطي المخدرات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم ترتيب الخلايا السرطانية في الأورام من الناحية الفسيولوجية في بنية معقدة، 3 الأبعاد (3D) وتحيط بها المصفوفة خارج الخلية والخلايا التفاعل. ان ما يقرب من جميع الخلايا في الأنسجة الموجودة في بيئة 3D، أدى الحاجة إلى أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية في نماذج ورم في المختبر التي تحاكي صفات الورم في تطوير العديد من التقنيات ثقافة 3D 1، 2، 3. هذه النماذج أصبحت الآن أدوات البحث الأساسية لدراسة دور المكروية ورم خبيث في الخلايا وردا على العلاجات في 3D 2. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع 2-الأبعاد الثقافات (2D) خلية 4، 3D نماذج تسمح لفهم أفضل للتفاعلات ورم سدى، والتي تؤثر على خلية مسارات الإشارات.

وكثيرا ما تستخدم الكروية ورم الخلايا (MCTSes) من خطوط الخلايا السرطانية في 3D الخلية جنماذج ulture بسبب القرب النسبي لفي الجسم الحي الأورام. للخروج من العديد من التقنيات في الاستخدام، وقد اكتسب تقنية السائل تراكب (الكثير) من الجيل المراكز على لوحات المغلفة الاغاروز اهتماما كبيرا للرصاص الأمثل والهدف التحقق من صحة 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11. وهذا واضح من الدراسات الحديثة التي استطاعت بنجاح لتشغيل شاشات التجريبية من المكتبات مجمع في الثقافات المراكز باستخدام الكثير 6 و 7. ومع ذلك، وتقلب جيدا لجيدا في المراكز التشكل والنمو بسبب فقدان الناجم عن تبخر متفاوتة من متوسطة عقبات المشتركة التي تصاحب الكثير باستخدام صفيحة معايرة دقيقة (النواب). ونتيجة لذلك، وتشكيل غير موحدة MCTSes يؤثر سلبا على أهمية وجدوىبيانات من فحوصات الدوائية 8 و 12 و 13. بالإضافة إلى قضايا استنساخ، مشكلة عملية أخرى تؤثر على أساس LOT-فحوصات عالية الإنتاجية هي طلاء النواب مع الاغاروز عند استخدام السائل التلقائي وحدات الاستغناء. على الرغم من أن وحدة الاستغناء يمكن أن تظل ساخنة لمنع التبلور من الاغاروز، وانسداد الكاسيت صرفها والأنابيب هو مصدر قلق محتمل لأنظمة روبوتية 6.

للتغلب على بعض من هذه التحديات، ونحن قد وضعت مؤخرا بعض التعديلات في الكثير من أجل الثقافة MCTS 8. وتستند هذه التعديلات أساسا على السبل الممكنة لمنع فقدان المتوسطة متفاوتة من النواب باستخدام الأدوات التي توجد عادة في المختبرات فحص عالية الإنتاجية. إجراء مفصل من الكثير المعدلة لتوليد MCTSes الحجم بشكل موحد واستنساخه عبر 3وقدم لوحات 84-جيدا (WPS) هنا. يعرض المخطوطة أيضا روتين مؤتمتة شبه لتقييم حجم المراكز، لا سيما في MCTSes تفككت جزئيا، المعالجة المخدرات التي ليس لها حدود واضحة المعالم لقياس مساحة المقطع العرضي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد لوحات مغلفة الاغاروز-

  1. تزن 0.75 غرام من ذوبان منخفضة نقطة الاغاروز وإضافته إلى 100 مل من المتوسط ​​5A مكوي و(مع أو بدون أحمر الفينول) دون المصل. الحرارة الحل في الميكروويف وعباب كل 1-2 دقيقة إلى حل تماما الاغاروز. الأوتوكلاف الحل لتعقيمها.
  2. تبريد تعقيمها الاغاروز إلى حوالي 70 درجة مئوية وتصفية عليه من خلال 500 مل، 0.22 ميكرون فلتر أعلى عن طريق الترشيح فراغ في مربع تدفق الصفحي. قسامة 0.75٪ تصفيتها حل الاغاروز (FAS) في أحجام أصغر إذا لم تكن تستخدم الحل كله في وقت واحد. تخزين هذا الاستخدام على استعداد الاغاروز حل جو معقم و مطهر في غرفة باردة أو 4 درجات مئوية الثلاجة لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
  3. نعلق أنبوب صغير مع plastic- أو كاسيت ذات الرؤوس المعدنية الاستغناء عن لموزع كاشف كومبي ورئيس الكاسيت مع 70٪ من الإيثانول (ETOH) ثم العقيمة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في مربع التدفق.
  4. قبل الاستخدام، وتسخين قسامة المخزنة من FAS ط ن الميكروويف لتذوب فيه. رئيس الكاسيت الاستغناء عن حل الاغاروز ومعطف 384 بشكل جيد، زراعة الأنسجة (TC) المعالجة بالإثير "خاص" microplates مع 15 ميكرولتر من FAS. السماح للالاغاروز في لوحة لتبرد لمدة 15-20 دقيقة قبل البذر الخلايا. تخزين لوحات المغلفة الاغاروز جو معقم و مطهر، ملفوفة في كيس البولي ايثيلين في غرفة باردة أو عند 4 درجات مئوية، وبعيدا عن الضوء المباشر.
    ملاحظة: تجنب التدفئة المتكررة من 0.75٪ FAS لمنع حدوث تغيير في تركيز الاغاروز في المحلول. لوحات المغلفة الاغاروز يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 2 أسابيع عند تخزينها وفقا للشروط المذكورة أعلاه. وFAS لا يتطلب التدفئة خلال طلاء لوحات.
  5. تنظيف كاسيت الاستغناء بواسطة فتيلة مع 70-80 درجة مئوية الماء المعقم لإزالة أي الاغاروز المتبقية في نصائح الكاسيت والأنابيب.

2. خلية الثقافة والمراكز تشكيل

  1. ثقافة الخلايا HCT116 سرطان القولون والمستقيم الإنسان، كما هو موضح سابقامعشوقة = "XREF"> 8.
  2. إزالة العدد المطلوب من المغلفة الاغاروز، 384 جيدا، TC المعاملة microplates من التخزين البارد ويوازن بينها إلى درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة.
  3. إعداد موزع كاشف كومبي بذر الخلية فتيلة الكاسيت أنبوب صرف القياسية مع 70٪ ETOH وبرنامج تلفزيوني العقيمة. ضبط مستوى الصوت البذر إلى ميكرولتر المطلوب وسرعة صرفها والمتوسطة باستخدام أزرار الضبط اليدوي على موزع.
    ملاحظة: يتم تنفيذ عملية الخلية البذر بأكملها تحت ظروف معقمة وفي مربع تدفق الصفحي.
  4. فصل الخلايا الملتصقة من قارورة زراعة الأنسجة باستخدام انزيم خلية التفكك المؤتلف. جعل مخزون تعليق خلية في دورق العقيمة مع خلايا البذور في مناطق ذات كثافة من 2.5 × 10 4 خلية / مل لكل بئر في 50 ميكرولتر من متوسط النمو الكامل. عندما بذر أكثر من 384-WP، وإثارة الخلايا باستخدام محرك مغناطيسي لمنعهم من الاستقرار إلى الجزء السفلي من الكأس.
  5. السماح لللوحات للراحة لمدة 30 دقيقة في RT ثم الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة على 4 ز س.
  6. وفي الوقت نفسه، أخذ غطاء البيئي الحد من التبخر، وملء مع 8 مل من H 2 O معقمة أو 5٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في الجانبين قصيرة (اليسار واليمين) باستخدام 5 مل ماصة (الشكل 1A). أولا، الاستغناء عن 4 مل من ملء السائل في الحوض الصغير في الجانب الأيسر عن طريق تجتاح طرف ماصة ببطء صعودا وهبوطا. كرر هذه الخطوة مع أدنى مستوى في الجانب الأيمن.
    ملاحظة: تأكد من أن السائل يضاف إلى أحواض الجانب لا دمج في وسط غطاء، وترك فجوة لتبادل الغازات (الشكل 1A). إضافة كميات زائدة من H 2 O النتائج في تسرب H 2 O إلى السطح الخارجي للغطاء، وبعد ذلك في الآبار الخارجي لوحات TC 384 أيضا.
  7. ملء خزان السائل من لوحة TC 384 بشكل جيد مع H 2 O معقمة واستبدال أغطية لوحة منتظمة مع الأغطية البيئية مليئة السائل (الشكل 2A).
  8. وضع لوحات في حاضنة 37 درجة مئوية دوارة مع الرطوبة 95٪، 5٪ CO 2، و 20٪ O 2، وتسمح للخلايا لتجميع في MCTSes لمدة 4 أيام. تجنب فتح باب الحاضنة لفترة طويلة جدا في الأيام اللاحقة من أجل منع مستوى الرطوبة من التسرب فجأة.

3. متوسط ​​الصرف باستخدام نظام الروبوتية

  1. في يوم 4 التالية تشكيل المراكز، إضافة 30 ميكرولتر من المتوسط ​​قبل تحسنت لكل بئر باستخدام الآلي موزع صفيحة الغسالة. السماح للMCTSes لتنمو لمدة 3 أيام إضافية. استبدال المتوسطة بانتظام كل 3 أيام، حتى بلوغهم الحجم المطلوب للتجريب.
  2. لنضح حجم محدد من المتوسط من كل جانب، وضبط تجريبيا ض -height من مشعب غسالة. نضح 30 ميكرولتر من المتوسطة لكل بئر واستبدالها مع 30 ميكرولتر من الطازجة والمتوسطة قبل تحسنت.
    ملاحظة: تعيين سرعة صرفها والسرعة التي مشعب غسالة يسافر باستمرارفي الآبار في أدنى معدل للحد من الاضطرابات في الآبار.

التصوير 4. عالية المحتوى من المراكز وشبه الآلي تحليل الصور

  1. صورة MCTS في نظام التصوير الآلي عالية المحتوى باستخدام الهدف الهواء 4X (NA 16).
  2. تعيين وقت التعرض إلى 11 مللي وbinning إلى 4 × 4. ضبط عدد وتباعد -stacks ض وbinning بكسل النحو المرغوب فيه للتجربة لالتقاط MCTS كامل لكل بئر.
  3. معالجة متدرج الصور، كما هو موضح في "التمهيدي"، باستخدام الروتين في المنزل مكتوب في لغة البرمجة.
    كما تتوفر ملفات التعليمات البرمجية التكميلية (الشكل 1B) رمز. م والتمهيدي. TXT الملفات: ملاحظة. التدابير الروتينية المنطقة MCTS، المحاور الرئيسية والثانوية، محيط، وصلابة من الصور 2D.

figure-protocol-1
شكل 1:إعداد الأغطية البيئية ومخطط من روتين شبه التلقائي. (أ) صورة من الغطاء البيئي الحد من تبخر مليئة الصحيح (يسار) والفائض (يمين) مقدار ملء السائل (هنا، 5٪ DMSO). يشير السهم إلى أدنى مستوى في الجانب القصير لإضافة السائل. تظهر النجمة الفجوة في منتصف الغطاء بعد إضافة وحدة التخزين الصحيحة من DMSO. (ب) سير عمل تبين الخطوات المتبعة في روتين مؤتمتة شبه تحليل الصور. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فقدان متفاوتة من المتوسط، ولا سيما من الآبار المحيطة، هي قضية كثيرا ما تصادف في البرلمان مع وحدات التخزين ثقافة الصغيرة. تحسن كبير في الظروف والثقافة، مثل حاضنات مع أنظمة تسيطر عليها بشكل جيد للحرارة / الترطيب والنواب الحد من التبخر وأغطية لوحة، والحد من خسائر كبيرة في المتوسط عبر الآبار 8. لقياس التبخر النسبي، وأضيفت كميات متساوية من البرتقال G (خطأ في مرماه) إلى كل بئر، وكانت قد سجلت التغيير في OG الامتصاصية على مدى 3 أيام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طلاء 384 حسنا لوحات TC مع المصفاة الاغاروز

الممارسة القياسية في الكثير هو استخدام 1-1.5٪ منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز لمعطف لوحات، الأمر الذي يتطلب الاغاروز و / أو وحدة الاستغناء أن تبقى ساخنة لمنع التبلور من الاغاروز 6. في التبلور من الاغاروز يشكل مصدر قلق محتمل بينما كان يستعد لوحات متعددة باستخدام أشرطة الاستغناء السائل مع فتحات الأنابيب الصغيرة التي تتراوح بين 0.2 و 0.4 مم في القطر. للتغلب ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من وزارة التشيك التربية والتعليم والشباب والرياضة (LO1304) والوكالة التكنولوجية للجمهورية التشيكية (TE01020028). فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور اكشمان فاراناسي لأخذ الصور الثابتة من الأغطية البيئية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AgaroseSigma-AldrichA9414
McCOY's 5A متوسطسيجما-ألدريتشM8403
" سريع" مرشح FiltermaxTPP995050.22 & م ، 500 مل
Multidrop & Trade ؛ موزع كاشف كومبي Thermo Fisher Scientific5840300
كاسيت الاستغناء عن الأنبوب الصغير Thermo Fisher Scientific24073295طرف معدني 
384-بئر TC لوحة لوحة 6057308PerkinElmer- كاسيت
الاستغناء عن الأنبوب القياسيCellCarrier Thermo Fisher Scientific24072670
MicroClime غطاء بيئيLabcyteLLS-0310
DMSOSigmaD4540
حاضنة دوارة (SteriStore)HighRes Biosolutions23641الرقم التسلسلي: D00384
موزع غسالة Microplate نموذجBioTek غيرالمحدد: EL406   ؛
نظام التصوير عالي المحتوى (CellVoyager) شركةيوكوجاوا الكهربائيةغير محدد: CV7000
Orange GNew England BiolabsB7022S
TrypLE & trade ؛ كاشف تفكك الخلايا المؤتلف السريعThermo Fisher Scientific12604021Phenol Red
نوع نموذج Free

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  2. Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
  3. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
  4. Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
  5. Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895(2015).
  6. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
  7. Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
  8. Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
  9. Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751(2014).
  10. Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
  11. Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
  12. Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
  13. Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
  14. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103(2016).
  15. Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
  16. Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
  17. Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة