يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تنقية عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من البياض الدقيقي لونغ-مقروءة التسلسل

11.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55463

⸱

مارس 31, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California Berkeley, 2John Innes Centre, Norwich Research Park, 3Department of Plant and Microbial Biology, University of Zürich, 4USDA-ARS Sunflower and Plant Biology Research Unit

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

الموصوفة هنا هي طريقة لاستخراج وتنقية ومراقبة جودة الحمض النووي الجيني من العامل الممرض الفطري الغذائي الحيوي الإلزامي ، البياض الدقيقي ، لاستخدامه في تسلسل الجينوم طويل القراءة.

الملخص

الفطريات البياض الدقيقي هي مجموعة من مسببات الأمراض الهامة اقتصاديا النبات الفطرية. لا يعرف إلا القليل نسبيا عن علم الأحياء وعلم الوراثة من هذه الجراثيم الجزيئي، ويرجع ذلك جزئيا إلى نقص الموارد الوراثية والجينوم متطورة. هذه الكائنات الحية لديها كبيرة، الجينوم المتكررة، التي جعلت تسلسل الجينوم والتجمع الصعب باهظة. هنا، نحن تصف أساليب لجمع واستخراج وتنقية ومراقبة الجودة تقييم عالية الوزن الجزيئي الجيني DNA من أنواع البياض الدقيقي واحد، Golovinomyces cichoracearum. ويتضمن بروتوكول صفها اضطراب الميكانيكي للجراثيم تليها الأمثل الفينول / الكلوروفورم استخراج الحمض النووي الجيني. وكان العائد نموذجي 7 DNA ميكروغرام لكل 150 غبيرات ملغ. الحمض النووي الجيني أن يتم عزل باستخدام هذا الإجراء هو مناسبة لتسلسل قراءة طويلة (أي> 48.5 KBP). تدابير مراقبة الجودة لضمان حجم، والغلة، ونقاء من الحمض النووي الجيني أيضاووصف في هذا الأسلوب. وتسلسل الحمض النووي الجيني نوعية الموصوفة هنا تسمح لتجميع ومقارنة الجينوم متعددة البياض الدقيقي، والتي بدورها سوف تؤدي إلى فهم أفضل وتحسين السيطرة على هذا الممرض الزراعي.

المقدمة

بياض دقيقي هي مجموعة من إلزام مصنع الفطرية biotrophic مسببات الأمراض التي، عندما تؤخذ معا، هي أكبر سبب للأمراض النبات في جميع أنحاء العالم 1. وهناك أكثر من 900 نوع وصفها البياض الدقيقي، والتي تم تجميعها تصنيفيا إلى خمس قبائل داخل الأسرة Erisyphaceae 2. بسبب على حد سواء لأهميتها الاقتصادية والعلاقة الحميمة أن تتطور مع مضيفيهم، كانت أمراض البياض الدقيقي موضوع البحث ل> 100 سنة. على العدوى، بياض دقيقي تثير تغييرات جذرية في بنية الخلية، والتمثيل الغذائي والبيولوجيا الجزيئية من مضيفيهم، للاستفادة هذا الممرض. ومع ذلك، فإن دراسة بياض دقيقي هي تحديا من نوع خاص أسلوب حياتهم تلزم، ولم يتم بعد وصف نمو الفطريات في ثقافة نقية 3 و 4 و 5 نظرا ل،"XREF"> 6 و 7 و 8. كما لم يتم حتى الآن إنجاز موثوق بها، التحول الجيني مستقر للبياض دقيقي، على الرغم من التحول عابرة وقد ورد في بعض الأنواع 9 و 10.

وقد ثبت أن تسلسل الجينوم وتجميع البياض الدقيقي الصعب يرجع ذلك إلى عدد من الميزات الموجودة في الجينوم نفسه. الجينوم البياض الدقيقي كبيرة (120-180 م ب ب) بالنسبة إلى العوامل الوراثية الفطرية الأخرى، وتتكون من 60-90٪ موزعة بالتساوي العناصر المتكررة 11. وتشمل هذه العناصر يكرر الطرفية غير طويلة، فضلا عن العناصر المتكررة غير مصنف. اثنين speciales formae من نوع البياض الدقيقي واحدة، Blumeria graminis و. س. hordei وو. س. الحنطة (محكمة العدل الاتحادية وبغت، على التوالي)، وكذلك العنب البياض الدقيقي الفقاقة الفتاكة، يكون النحلالتسلسل ن، وقد تم الانتهاء من مشروع الجينوم للعديد من الآخرين 12 و 13 و 14. وقد جعلت الطبيعة التكرارية للجينومات الصعب التجمع، وتجميعها في محكمة العدل الاتحادية الجينوم الانتهاء في 6989 supercontigs مع L50 من 2 ميجا بايت 12.

وعلى الرغم من الجينوم كبير، تظهر بياض دقيقي لديها عدد قليل من البروتين الجينات الترميز، مع 5845 و6540 الجينات وتوقع في محكمة العدل الاتحادية وبغت، على التوالي. يظهر بياض دقيقي متسلسلة أيضا تفتقر إلى لا يقل عن 99 الجينات الأساسية التي لا غنى عنها في الفطريات الأخرى، وهو ما يتسق مع الاعتماد على الفطريات على النبات المضيف من أجل البقاء على قيد الحياة 11، 12، 13، 14.

تسلسل المتكررة قرب تيلومرات، القسيم، RN الريباسيوالمصفوفات والمناطق المخصب في جين قافز الجين يتم تجميعها بشكل سيئ من استراتيجيات التسلسل قراءة قصيرة وغالبا ما تكون ممثلة تمثيلا ناقصا في المجالس الجينوم 15. ويعتقد أن هذه المناطق لتكون مسؤولة عن العديد من الثغرات التي تحدث في تسلسل الجينوم، وهذا ينطبق على بياض دقيقي مع التوسع واسعة من العناصر المتكررة 16. غاية غالبا ما توجد مناطق الجينوم البلاستيكية في تلك المناطق المتكررة 3. وهي بمثابة موقع لإعادة ترتيب الكروموسومات، وغالبا ما ترميز الجينات تحت ضغط انتقائي قوي، مثل الجينات ترميز البروتينات المستجيب والجينات التي تكود إنزيمات الأيض الثانوية. التقدم في جزيء واحد تقنيات التسلسل قراءة طويلة توفر حلا ممكنا لتسلسل عبر المناطق المتكررة من الجينوم 15. على سبيل المثال، Faino وآخرون. (2015) وجدت أن بما في ذلك سلسلة طويلة قراءة التقنيات وم البصريةيسمح apping لهم لإنتاج تسلسل الجينوم الفجوة أقل للسلالتين من نبات فطري الممرض الداليا الكبكوبية، ثلاثة أضعاف نسبة تسلسل الحمض النووي المتكررة في الجينوم، وزيادة عدد من الشروح الجين (وخفض عدد جزئية أو مفقودة شروح الجين ) والجينوم يكشف إعادة ترتيب 17.

لاستخدام هذه التقنيات التسلسل قراءة طويلة، على تركيزات عالية من جودة عالية الحمض النووي الجيني، مع أحجام الحد الأدنى> 20 KBP، وهناك حاجة. نحن هنا وصف الأساليب لدينا لجمع بوغي، وتنقية عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي من غبيرات وتقييمنا لمراقبة الجودة باستخدام cichoracearum الأنواع البياض الدقيقي Golovinomyces نمت على الخيار 18. ويستند هذا البروتوكول على بروتوكول المتقدمة في المجموعة مختبر B. كيلر (جامعة زيورخ، سويسرا) 13، 19ويشمل العديد من التعديلات التي أدت إلى زيادة الغلة DNA ونسبة أعلى من DNA> 48.5 KBP في الحجم. ويتضمن البروتوكول أيضا خطوات لمراقبة الجودة بناء على توصيات من وزارة الطاقة الأمريكية المشتركة الجينوم معهد 20 و 21 و 22.

وظيفة كل كاشف المدرجة في تحلل العازلة، والأساس المنطقي لكل خطوة التنقية، وكما هو موضح في هنري (2008) 23. تم التشاور البروتوكولات المنشورة المتاحة لعزل عالية الوزن الجزيئي الجيني DNA من الأنسجة النباتية والجراثيم أيضا خلال تصميم هذا البروتوكول 24، 25، 26، 27، 28.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الفطرية المواد

  1. تزايد البياض الدقيقي
    1. تنمو النباتات في غرف النمو فقا للشروط التالية: 22 ° C اليوم درجة الحرارة 20 درجة مئوية درجة الحرارة ليلا، و 80٪ الرطوبة النسبية، 14 ساعة يوم طول وشدة الضوء من 125 μE / م 2 / ث (المقدمة من الإضاءة الفلورسنت ).
    2. تصيب نباتات الخيار (كوكوميس البركة متنوعة بوش بطل) مع Golovinomyces cichoracearum UCSC1 سلالة كما هو موضح 18، 29.
  2. حصاد البياض الدقيقي غبيرات
    1. حصاد غبيرات من النباتات المصابة في 7-10 أيام بعد التلقيح باستخدام فراغ صغير مع مرشح في الخط (11 ميكرون) التي وغبيرات تتراكم. تطبيق ضغط لطيف، قم بتشغيل فوهة فراغ على سطح ورقة لجمع غبيرات.
      ملاحظة: متوسط العائد من G. cichoracearum هي 20 ملغ من غبيرات من infe بشدةالمديرية رقة الخيار ما يقرب من 130 سم 2 في المنطقة.
    2. فرشاة حوالي 150 ملغ من غبيرات (حوالي 375 حجم ميكرولتر، أو غبيرات 7-8 يترك الخيار المصابة) من مرشح على ورقة نظيفة. من هنا، ونقل غبيرات إلى 2 مل cryovials مع اثنين من 5/32 بوصة قطر قبل المبردة (في النيتروجين السائل) كرات الصلب طحن. العودة فورا إلى أنابيب النيتروجين السائل. أنابيب مخزن في -80 ° C.
  3. كسر المفتوحة غبيرات بواسطة طحن الكرة
    1. فلاش تجميد لوحات الألومنيوم من مطحنة الكرة في النيتروجين السائل. تحميل cryovials إلى رف الكرة مطحنة. هزة بقوة في cryovials مع غبيرات وكرات الصلب في طاحونة الكرة لمدة 30 ثانية في 30 دورة / ق (في درجة حرارة الغرفة). على الفور اعادة تجميد cryovials في النيتروجين السائل.
      ملاحظة: في البداية، والوصول إلى عينة من غبيرات بواسطة المجهر في التكبير 100X لكفاءة تمزق جدار الخلية خلال طحن. إذا لزم الأمر، وطحن لمزيد من 1-2 جولات من 30 ثانية لمدة 30 دورات / ث، بالتحرير إبقاء عدد من الجولات إلى أدنى حد ممكن. التقييم الروتيني الكسر بوغي بواسطة المجهر في هذه المرحلة لا لزوم لها مرة واحدة وضعت الظروف المثلى.

2. الجينوم DNA تنقية

  1. غبيرات تحلل
    1. العمل بسرعة لتجنب ذوبان غبيرات، وإزالة كرات الصلب من cryovials مع المغناطيس. إضافة 700 ميكرولتر 65 ° C العازلة تحلل (الجدول 1) ودوامة 5-10 الصورة حتى يتم تشكيل الطين.
    2. إضافة 300 ميكرولتر قبل حرارة (65 درجة مئوية) 5٪ (ت / ت) sarcosyl وعكس بلطف لمزج (1 انقلاب في 3 ق) خمس مرات. احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية. عكس بلطف 3 مرات في 10 و 20 و 30 دقيقة. استخدام على نطاق تتحمل ماصة، ونقل الحل بأكمله إلى 2 الجديدة أنبوب مل microcentrifuge. في جميع الخطوات اللاحقة، مزيج من قبل طيف، قلب بطيئة ونقل الحلول التي تحتوي على الحمض النووي مع نصائح ماصة واسعة تتحمل.
  2. استخراج الحمض النووي I
    1. إضافة 1 حجم كلوروالنموذج: الكحول أيزو أميلي (24: 1 ت / ت) إلى حل تحلل وبلطف عكس لخلط خمس مرات. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، عكس بلطف لمزج خمس مرات عند نقطة في منتصف الطريق، ومرة ​​أخرى في نهاية الحضانة. أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في 14000 ز س. استخدام على نطاق تتحمل ماصة، ونقل بعناية الطبقة المائية إلى 2 الجديدة أنبوب مل microcentrifuge. تجنب بما في ذلك المواد من واجهة.
  3. DNA الهطول I
    1. إضافة 1 حجم درجة حرارة الغرفة 100٪ الأيزوبروبانول (حوالي 750 ميكرولتر) وعكس بلطف لمزج ست مرات. أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في 14000 ز س. إزالة بعناية طاف وتجاهل.
    2. إضافة 450 ميكرولتر قبل المبردة (-20 ° C) 70٪ من الإيثانول. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في 14000 ز س. إزالة بعناية طاف وتجاهل. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 3 ثوان، وإزالة بعناية طاف مع طرف ماصة على ما يرام وتجاهل. الهواء الجاف وبيليه لمدة 15 دقيقة لتي درجة حرارة الغرفة. لا تجف لمدة أطول من 15 دقيقة.
    3. إعادة تعليق بيليه في 300 ميكرولتر TE (10 ملي تريس الكلورين، 1 ملم الاثيلين ديامين رباعي حمض الخل، ودرجة الحموضة 8.0). احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. نفض الغبار برفق لإعادة تعليق أي مادة المتبقية التي لم تذهب إلى الحل.
  4. لإزالة التلوث RNA، إضافة 10 ميكرولتر ريبونوكلياز A (10 ملغ / مل). عكس بلطف لمزج ثلاث مرات. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 3 ثوان. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  5. استخراج الحمض النووي II
    1. إضافة 300 ميكرولتر الفينول: كلوروفورم: كحول أيزو أميلي (25: 24: 1 ت / ت) وعكس بلطف لمزج خمس مرات. احتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، عكس بلطف لمزج خمس مرات في منتصف الطريق، ومرة ​​أخرى في نهاية الحضانة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في 14000 ز س. استخدام على نطاق تتحمل ماصة، طاف لنقل جديد أنبوب 1.5 مل microcentrifuge.
  6. DNA الهطول II
    1. إضافة 0.01 حجم 3 M خلات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 5.2 (approximatelص 3 ميكرولتر)، عكس بلطف لمزج خمس مرات. إضافة 2.5 مجلدات قبل المبردة (-20 ° C) الإيثانول بنسبة 100٪ (حوالي 750 ميكرولتر). عكس بلطف لمزج خمس مرات. احتضان بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.
    2. الطرد المركزي 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في 14000 ز س. إزالة بعناية طاف وتجاهل.
    3. إضافة 450 ميكرولتر قبل المبردة (-20 ° C) 70٪ من الإيثانول. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في 14000 ز س. إزالة بعناية طاف وتجاهل. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 3 ثوان. إزالة بعناية طاف مع طرف ماصة على ما يرام وتجاهل.
    4. الهواء الجاف وبيليه لمدة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إعادة تعليق بيليه في 27.5 ميكرولتر TE. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. نفض الغبار برفق لإعادة تعليق أي مادة المتبقية التي لم تذهب إلى الحل.
    5. قسامة 2.5 ميكرولتر إلى 22.5 ميكرولتر TE (الحجم النهائي 25 ميكرولتر) لاختبارات مراقبة الجودة (انظر أدناه). عينات من الحمض النووي مخزن في 4 درجات مئوية حتى تقديم لتسلسل. للتخزين، وعينات تخزين على المدى الطويلفي -80 ° C وتقليل تجميد أذاب دورات لمنع القص.
      ملاحظة: خذ الحذر عند pipetting لفي هذه الخطوة باعتبارها عالية الوزن الجزيئي الجيني DNA يمكن أن يكون من الصعب ماصة بشكل صحيح، وأنه من المهم لضمان أن "QC قسامة" هو تمثيل دقيق لعينة DNA الجينومية.

3. مراقبة الجودة

  1. الطهارة عينة
    1. باستخدام TE فارغة، تقييم نقاء عينة من الحمض النووي عن طريق تحميل 1 ميكرولتر من QC قسامة على معمل صغيرة الحجم. سجل A260 / A280 A260 و/ A230 القراءات. سوف DNA النقي لديهم نسبة A260 / A280 من حوالي 1.8 و A260 / A230 النسبة بين 1.8 و 2.2.
  2. الكمي من الحمض النووي الجيني
    1. أداء الكمي لQC قسامة باستخدام المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الكمي عدة فحص التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  3. DNA تقييم جودة I
    1. تحميل ما يقرب من 60 نانوغرام الحمض النووي الجيني وسلم DNA على هلام الاغاروز 0.7٪ في 1X TAE (40 ملي تريس، 20 ملم حمض الخليك، و1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8.0). جهاز هلام تشغيل في 70 V ل40 - 45 دقيقة حتى العصابات DNA الجينومية ما يقرب من 2 سم من الفصل بشكل جيد والفرقة في سلم هو واضح. قد تحتاج إلى تعديل بناء على الجهاز الكهربائي للهلام المتاحة في هذه الظروف.
  4. DNA تقييم جودة II
    1. تحميل ما يقرب من 60 نانوغرام الحمض النووي الجيني والجزيئي عالية سلم الوزن DNA (مناسبة للهلام الكهربائي حقل نابض) على هلام الاغاروز 1٪ في TBE 0.5X (44.5 ملي تريس، 44.5 ملم حمض البوريك، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8.3) و تشغيل في 0.5X TBE العازلة تشغيل باستخدام 5-80 KBP الموجي حقل نابض بروتوكول هلام الكهربائي لمدة 16 ساعة.
  5. تقييم البكتيرية، الفطرية، والملوثات النبات
    1. أداء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لتضخيم الفواصل كتب الداخلية المناسبة (ITS) مناطق الجينات الريباسي باستخدام بادئات والشروط التضخيم قائمةإد في الجدول 2. تحميل 10 ميكرولتر من رد الفعل الناتج عن مادة هلامية.
      ملاحظة: الفرقة التي تمثل البياض الدقيقي يجب تضخيم المنطقة ITS مع ITS الاشعال الفطرية. يجب أن تكون متسلسلة DNA من هذه amplicon وأي amplicon ولدت مع، أو الاشعال النبات البكتيرية لتحديد مصدر التلوث. البياض الدقيقي الوحيد ينبغي إيجاد تسلسل ITS في amplicon الفطرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

cichoracearum تشغيل مثال ممثل 60ng الحمض النووي الجيني النقي من G. على هلام الاغاروز باستخدام هلام الكهربائي واستخدام حقل نابض هلام الكهربائي وترد في أرقام 1 و 2 على التوالي. وتمثل الاستعدادات DNA الجينومية أن تمر، هامشي تمر وتفشل مراقبة الجودة. الاستعدادات DNA الجينومية التي تمر بالكامل مراقبة الجودة مثالية لتسلسل باستخدام نهج تسلسل الجينوم قراءة منذ فترة طويلة. الاستعدادات التي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

من أجل الحصول على النقي، وارتفاع الوزن الجزيئي الجيني DNA من تلزم biotrophic فطريات البياض الدقيقي، وقد تم تطوير نسخة معدلة من الأساليب المذكورة سابقا 30. ومتوسط ​​العائد باستخدام هذا البروتوكول الأمثل هو 7 DNA ميكروغرام لكل 150 ملغ غبيرات، مضاعفة الغلة التي تم الحصول عليها مع بروتوكول مسبق. كما ارتفع متوسط ​​حجم من حوالي 20 KBP إلى أكثر من 48.5 KBP. وكان محسن هذا البروتوكول في النظام cichoracearum G. cucumber-. من أجل الحصول على أفضل جودة وأعلى نق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم تطوير هذا البروتوكول لدعم مشروع تسلسل مشترك بين معهد الجينوم والمجتمع (# 1657). تم دعم العمل جزئيا من قبل مؤسسة فيلوماتيا والمؤسسة الوطنية للعلوم (# 0929226) ومعهد العلوم الحيوية للطاقة إلى S. Somerville. ومن قبل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (# 310030_163260) إلى ب. كيلر. نود أن نشكر زملائنا ، M. Figureroa و M. Miller (جامعة مينيسوتا) ، R. Panstruga (جامعة RWTH Aachen) ، C. Pedersen (جامعة كوبنهاغن) ، P. Spanu (إمبريال كوليدج) ، J. Taneja (جامعة كاليفورنيا بيركلي) ، M. Wildermuth (جامعة كاليفورنيا بيركلي) ، R. Wise (جامعة ولاية أيوا) و S. Xiao (جامعة ماريلاند) على نصائحهم السخية والتطوع ببروتوكولاتهم أثناء قيامنا بتطوير البروتوكول الموضح هنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
MM400 مطحنة الكرةRetsch20.745.0001أو ما يعادلها من مطحنة الكرة
2 مل أنابيب لطحن الكرةSarstedt & nbsp ؛72.694.007
5/32 "كرات طحن الفولاذ المقاوم للصدأ OPSDiagnosticsGBSS 165-5000-01
المعالجات الدقيقة التي يتم التحكم فيها 280 سلسلة حمام مائي مسبقا إلى 65 درجة ؛ ج Thermo Fisher Scientific2825أو ما يعادله حمام مائي
يتم التحكم فيه 280 سلسلة حمام مائي مضبوطة مسبقا إلى 37 درجة ؛ CThermo Fisher Scientific2825أو ما يعادلها حمام مائي
Eppendorf 5417R جهاز طرد مركزي دقيقمبرد Krakeler Scientific  38-022621807أو ما يعادلها من أجهزة الطرد المركزي
الدقيقة Chlorform: IAA (24: 1 v / v)Sigma-Aldrich   ؛C0549خطير في حالة ملامسة الجلد أو استنشاقه. ارتد قفازات النتريل والنظارات الواقية ومعطف المختبر واعمل في غطاء المحرك الكيميائي
الفينول: الكلوروفورم: IAA
(25:24: 1 v / v)		15593031 Thermo Fisher Scientificخطير في حالة ملامسة الجلد أو استنشاقه. ارتداء قفازات النتريل والنظارات الواقية ومعطف المختبر والعمل في غطاء المحرك الكيميائي
100٪ الأيزوبروبانولسيجما ألدريتش & nbsp ؛W292907
100٪ إيثانولسيجما ألدريتش   ؛34923البرد إلى -20 درجة ؛ C الاستخدام المسبق
أسيتات الصوديومسيجما-ألدريتش  S2889
رناز ، خالي من الدناس (10 مجم / مل) ثيرموفيشر العلميEN0531
ميتابيسلفيت البوتاسيومسيجما ألدريتش   ؛P2522
الصوديوم لوريل ساكرويناتسيجما ألدريتش   ؛L9150
قاعدة تريسسيجما ألدريتش   ؛10708976001
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)سيجما ألدريتش   ؛EDS
كلوريد الصوديوم (NaCl)سيجما-ألدريتش   ؛S9888
سيتيل تريميثيل بروميد الأمونيوم (CTAB)سيجما ألدريتش   ؛H6269
Uvex من Honeywell Futura Goggles S345C ، UvextremeStaples423263أو ما يعادلها من
نظارات High Five COBALT Nitrile ، LARGENeta ScientificHFG-N193أو ما يعادلها
حمض نووي أحمر صبغة 10،000x في الماءBiotium41003
Ethidium Bromide 10 مجم / ملBiotium40042خطير في حالة ملامسة الجلد. ارتد قفازات النتريل والنظارات الواقية
Agarose Ultrapure BioreagentVWR International LLCJT4063
GeneRuler 1 kb Plus DNA LadderThermo Fisher ScientificFERSM1332
8 - 48 kb معايير حجم الحمض النووي CHEFBio-Rad170-3707
Pippin PrepLife Technologies Corporation4472172أو ما يعادلها من هلام مجال النبض aparatus
ورق الترشيح النوعي Whatman ، الصف 1Sigma-Aldrich   ؛WHA1001042أو ما يعادلها من غرفة النمو
Percival GrowthPercivalAR66LXC9
NanoDrop 8000 UV-Vis مقياس الطيفالحراري فيشر العلميND-8000-GLأو ما يعادله مقياس الطيف
الضوئي Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher ScientificP11496
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50x)Thermo Fisher ScientificB49تمييع 1/50 بالماء قبل الاستخدام (إلى 1x)
TE BufferThermo Fisher Scientific12090015 
Tris-Borate-EDTA ، محلول 10x (الرحلان الكهربائي) BP13334Thermo Fisher Scientificيخفف 1/10 بالماء قبل الاستخدام (إلى 1x)
نيتروجينسائل نيتروجين سائل (-196 درجة ؛ ج) هو خطر التجمد. سوف يتوسع أيضا بسرعة عند الاحترار ويجب ألا يحفظ في حاوية مغلقة بإحكام
جل Chamber الضوئي

المراجع

  1. Agrios, G. N. Plant Pathology. , 4th, Academic Press. (1969).
  2. Braun, U., Cook, R. T. Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews). , CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre Utrecht. The Netherlands. (2012).
  3. Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D. Gene expression profiles of Blumeria graminis indicate dynamic changes to primary metabolism during development of an obligate biotrophic pathogen. Plant Cell. 17 (7), 2107-2122 (2005).
  4. Glawe, D. A. The powdery mildews: A review of the world's most familiar (yet poorly known) plant pathogens. Annu Rev Phytopathol. 46, 27-51 (2008).
  5. Fabro, G., et al. Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation. Plant Physiol. 146 (3), 1421-1439 (2008).
  6. Hückelhoven, R., Panstruga, R. Cell biology of the plant-powdery mildew interaction. Curr Opin Plant Biol. 14 (6), 738-746 (2011).
  7. Micali, C. O., Neumann, U., Grunewald, D., Panstruga, R., O'Connell, R. Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cell internalization of Golovinomyces orontii haustoria. Cell Microbiol. 13 (2), 210-226 (2011).
  8. Chandran, D., Inada, N., Hather, G., Kleindt, C. K., Wildermuth, M. C. Laser microdissection of Arabidopsis cells at the powdery mildew infection site reveals site-specific processes and regulators. Proc Natl Acad Sci. 107 (1), 460-465 (2010).
  9. Spanu, P. D., Panstruga, R. Powdery mildew genomes in the crosshairs. New Phytol. 195 (1), 20-22 (2012).
  10. Vela-Corcía, D., Romero, D., Torés, J. A., De Vicente, A., Pérez-García, A. Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia. BMC Microbiol. 15 (20), (2015).
  11. Hacquard, S. Advances in Botanical Research. Francis, M. M. 70, Academic Press. 109-142 (2014).
  12. Spanu, P. D., et al. Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism. Science. 330 (6010), 1543-1546 (2010).
  13. Wicker, T., et al. The wheat powdery mildew genome shows the unique evolution of an obligate biotroph. Nat Genet. 45 (9), 1092(2013).
  14. Jones, L., et al. Adaptive genomic structural variation in the grape powdery mildew pathogen, Erysiphe necator. BMC Genomics. 15, 1081(2014).
  15. Thomma, B. P. H. J., et al. Mind the gap; seven reasons to close fragmented genome assemblies. Fungal Genet Biol. 90, 24-30 (2016).
  16. Parlange, F., et al. A major invasion of transposable elements accounts for the large size of the Blumeria graminis f.sp. tritici genome. Funct Integr Genomics. 11, 671-677 (2011).
  17. Faino, L., et al. Single-molecule real-time sequencing combined with optical mapping yields completely finished fungal genome. mBio. 6, (2015).
  18. Adam, L., et al. Comparison of Erysiphe cichoracearum and E. cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaliana accessions for resistance to these two powdery mildew pathogens. Mol Plant Microbe In. 12 (12), 1031-1043 (1999).
  19. Bourras, S., et al. Multiple avirulence loci and allele-specific effector recognition control the PM3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew. Plant Cell. 27 (10), 2991-3012 (2015).
  20. Joint Genome Institute DNA sample submission guidelines. , http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/DNA-Preparation-Requirements-1.pdf (2016).
  21. Chovatia, M., Sharma, A. Genomic DNA sample QC version 4.0. , http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2013/11/Genomic-DNA-Sample-QC.pdf (2014).
  22. Daum, C. iTag sample amplification QC version 1.3. , http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/iTag-Sample-Amplification-QC-v1.3.pdf (2016).
  23. Plant genotyping II: SNP technology. Henry, R. J. , CABI. Oxfordshire, UK. (2008).
  24. Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R. J. Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species. Plant Methods. 10 (21), (2014).
  25. Fang, G., Hammar, S., Grumet, R. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. Biotechniques. 13 (1), 52-54 (1992).
  26. Jordon-Thaden, I. E., Chanderbali, A. S., Gitzendanner, M. A., Soltis, D. E. Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta. Appl Plant Sci. 3 (5), 1400105(2015).
  27. Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 8 (19), 4321-4325 (1980).
  28. Greco, M., Sáez, C. A., Brown, M. T., Bitonti, M. B. A simple and effective method for high quality co-extraction of genomic DNA and total RNA from low biomass Ectocarpus siliculosus, the model brown alga. PLoS One. 9 (5), e96470(2014).
  29. Wilson, I. W., Schiff, C. L., Hughes, D. E., Somerville, S. C. Quantitative trait loci analysis of powdery mildew disease resistance in the Arabidopsis thaliana accession Kashmir-1. Genetics. 158 (3), 1301-1309 (2001).
  30. User Manual: Pippin Pulse Electrophoresis Power Supply. , Sage Science. http://www.sagescience.com/wp-content/uploads/2014/01/Pippin-Pulse-User-Manual-RevH.pdf (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تنقية عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من البياض الدقيقي لونغ-مقروءة التسلسل
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.