مقالة منهجية

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

DOI:

10.3791/55464

⸱

أبريل 17, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, York University, 2The Centre for Research in Mass Spectrometry, York University, 3The Centre for Research on Biomolecular Interactions, York University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المرونة بتكوين تلعب دورا حاسما في وظيفة البروتين. هنا، نحن تصف استخدام تأين بالإرذاذ الإلكتروني مطياف الكتلة وقت حل جانب لصرف الهيدروجين الديوتيريوم للتحقق التغييرات الهيكلية السريعة التي تدفع وظيفة في البروتينات أمر والمختلين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد البروتينات المختلين جوهريا (النازحين) لفترة طويلة تحديا لعلماء الأحياء الهيكلية نظرا لعدم وجود عناصر البنية الثانوية مستقرة. الهيدروجين الديوتيريوم تبادل (HDX) تقاس بمقاييس الوقت السريعة هي مناسبة فريدة للكشف عن الهياكل والشبكات الرابطة الهيدروجينية التي يتم لفترة وجيزة بالسكان، مما يسمح لتوصيف المتشاكلات عابرة في الفرق المحلية. اقتران HDX لقياس الطيف الكتلي يقدم العديد من المزايا الرئيسية، بما في ذلك حساسية عالية، وانخفاض استهلاك عينة وأي قيود على حجم البروتين. وقد تقدمت هذه التقنية بشكل كبير في العقود القليلة الماضية، بما في ذلك القدرة على رصد مرات العلامات HDX على مقياس الوقت ميلي ثانية واحدة. وبالإضافة إلى ذلك، من خلال دمج سير العمل HDX في الصعود إلى منصة ميكروفلويديك السكن وmicroreactor البروتيني الحمضية، ونحن قادرون على توطين الخصائص الحيوية على مستوى الببتيد. في هذه الدراسة، في الوقت حل التأين electrospray الطيف الكتلي (TRESI-MS) يقترن إلى HDX واالصورة المستخدمة لتقديم صورة مفصلة للهيكل المتبقية في بروتين تاو، فضلا عن التحولات بتكوين الناجم على hyperphosphorylation.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى العقود العديدة الماضية، بذلت أوجه التقدم الكبير في تطوير التقنيات التحليلية لقياس بنية البروتين وديناميات 1، 2، 3، 4. في حين تبقى الأشعة السينية البلورات الأداة الرئيسية لتحديد بنية البروتين، وهناك حاجة تركيزات عالية من البروتين ومطلوب الأمثل واسعة لإنتاج بلورات ذات جودة الحيود. البروتينات التي يصعب بلورة مثل البروتينات المرتبطة الغشاء والمختلين جوهريا قد كلاسيكي تمت دراستها عن طريق تبادل الهيدروجين الديوتيريوم (HDX) NMR 5. ومع ذلك، في العقود الأخيرة، واقتران من تأين بالإرذاذ الإلكتروني الطيف الكتلي (ESI-MS) لHDX اكتسبت شعبية بسرعة 6 و 7.

قياس الطيف الكتلي يقدم حلالكثير من القيود التي تفرضها البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي. على وجه الخصوص، MS حساس للغاية (نانومتر لتركيزات ميكرومتر مطلوب)، وليس هناك عمليا أي حد على حجم البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ارتفاع دورة العمل من تحليل MS تتيح إمكانية دراسة البروتينات لأنها تخضع لدوران الأنزيمية، misfolding، complexation وغيرها من العمليات البيولوجية ذات الصلة. وغالبا ما تحدث هذه العمليات على ميلي ثانية واحدة على نطاق والمرة الثانية ويتطلب خلط السريع الكواشف قبل التحليل.

تطوير وقت حل التأين electrospray (TRESI) من خلال ويلسون وKonermann في عام 2003 ردود فعل سمح التي يتعين رصدها في وقت شبه حقيقي من قبل ESI-MS. الإعداد الخاصة بهم أدرجت خلاط الشعرية مع قابل للتعديل بشكل مستمر رد فعل حجم الغرفة 8. يتكون الجهاز من اثنين من الشعيرات الدموية متحدة المركز، مع الشعرية الداخلي مختومة والشق يقتطع من جانبها السماح لخلط داخل الضيق بين capillarذ الفضاء من الدرجة الأولى لنهاية الشعرية الداخلي (عادة 2 مم). عندما يطبق على التجارب HDX، الشعرية الداخلي يحمل البروتين من الفائدة، والشعرية الخارجي يحمل العلامات D 2 O الحل الذي ثم يخضع لخلط مع البروتين قبل الدخول إلى دائرة رد الفعل قابل للتعديل يسمح HDX وضع العلامات قبل النقل المباشر في ESI مصدر.

لفترة وجيزة، تعتمد على الهيدروجين HDX أميد العمود الفقري تمر التبادل مع ذرات الديوتيريوم في حل 9 و 10. تبادل هو قاعدة المحفز في درجة الحموضة الفسيولوجية، مع حمض الحفز أصبحت سائدة في درجة الحموضة أقل من حوالي 2.6. ويستند سعر الصرف على أربعة عوامل رئيسية هي: درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، وسهولة الوصول المذيبات وضمجزيئي الرابطة الهيدروجينية. كما يتم الاحتفاظ اثنين من العوامل السابقة ثابت في كافة مراحل التجربة، وسعر الصرف، وخاصة في المناصب أميد الببتيد العمود الفقري، هو في المقام الأول dependenر على بنية البروتين 11. مطوية بإحكام المناطق ذات الشبكات الرابطة الهيدروجينية واسعة ومستقرة في α-اللوالب وβ اوراق ستتناول الديوتيريوم في أبطأ بكثير معدلات بالمقارنة مع الحلقات والمناطق المضطربة (وأحيانا لا على الإطلاق) 12. وهذا يسمح للتحليل البروتين العالمي، حيث الاضطرابات في بنية (على سبيل المثال، عند تجميع أو الركيزة ملزمة) تؤدي إلى اختلاف امتصاص الديوتيريوم (الشكل 1).

ويمكن إدراج خلاط الشعرية الحركية إلى منصة ميكروفلويديك تحتوي على غرفة بروتين لتوطين امتصاص الديوتيريوم. يقام هذه القاعة بروتين في انخفاض الرقم الهيدروجيني من أجل إخماد فعالية رد الفعل الصرف، ويتطلب البروتيني حامض يجمد من أجل هضم البروتين في الببتيدات المترجمة (الشكل 2). مراقبة الصرف العمود الفقري في ميلي ثانية واحدة لجداول زمنية ثانية مهم خاصة بالنسبة للتوصيف التغييرات بتكوين ضمن الصعب تميز المناطق حلقة، كريات المنصهرة، والبروتينات المختلين جوهريا (النازحين) 13، 14. بدلا من ذلك، يمكن TRESI-HDX أيضا أن تستخدم لتوصيف البروتينات أنه في الوقت الراهن ليس لدينا التركيب الذري حلها من خلال أساليب البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي، وذلك باستخدام الصرف الديوتريوم إلى جانب لخوارزمية COREX (DX-COREX) نهج 15 و 16. وهذا البروتوكول مفصل تنطبق TRESI-HDX لدراسة تاو، وهو IDP، في كل من انها شكل الأصلي، فضلا عن أنها دولة hyperphosphorylated المسببة للأمراض. بينما تاو الأصلي هو واحد من أكثر النازحين مدروسة، لا يعرف الكثير عن نظيره amyloidogenic 13 منه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى كافة الأوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. الأبخرة الناتجة عن الاستئصال بالليزر من بولي (ميتاكريليت الميثيل) (PMMA) يمكن أن تكون سامة. مما لا شك فيه أن الليزر متصل إلى نظام التهوية العمل. استخدام كل ممارسات السلامة المناسبة عند بناء الجهاز ميكروفلويديك بما في ذلك استخدام الضوابط الهندسية (غطاء الدخان، حاوية الأدوات الحادة)، ومعدات الوقاية الشخصية (نظارات السلامة، قناع الوجه، والقفازات، معطف المختبر، كامل طول السراويل والأحذية المغلقة اصبع القدم). ومن الأهمية بمكان أن استخدام عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) الكواشف الصف كلما أمكن ذلك، مع الوجود كله من ACS الصف أو أعلى لتقليل الملوثات التدخل أثناء التحليل.

1. إعداد الجهاز ميكروفلويديك

  1. بناء ميكروفلويديك منصة PMMA
    1. الحصول على كتلة PMMA قياسي (8.9 X 3.8 X 0.6 سم) الليزر واجتثاث قناة الإدخال لإدخال الكواشف، وPROTEOتحلل الغرفة، وقناة الإخراج باستخدام الليزر 17 و 18.
      ملاحظة: إحفر غرفة التحلل البروتيني في شكل بيضاوي ممدود (30 × 5 × 0.05 مم). قناة المدخلات والمخرجات يجب أن تمتد إلى نهاية كتلة PMMA وأن يكون هناك أكبر من 75 ميكرومتر في كل من العرض والعمق من أجل استيعاب الشعرية 30 الجا.
    2. قطع 30 الجا الفولاذ المقاوم للصدأ المعادن الشعرية إلى قطعتين من حوالي 10 سم لكل منهما باستخدام أداة دوارة مع قرص "قطع سميكة 1/64. استخدام الصنفرة لتسهيل نهايات الشعيرات الدموية (وهذا يمكن أن يتيسر من خلال عرض تحت المجهر الضوئي).
    3. تذوب الشعيرات الدموية في بولي محفورا (ميتاكريليت الميثيل) كتلة باستخدام حام الحديد. وسيتم ربط قناة المدخلات إلى مضخات الحقن الآلي، وسيتم استخدام قناة الناتج عن اقتران في MS.
  2. بناء الحركية خلاط حل الزمني الدفق المستمر
    1. الحصول على تنصهرالسيليكا الشعرية الزجاج (ID: 75 ميكرون، OD: 150 ميكرون) من حوالي 40 سم، وأدخله في 28 الجا الفولاذ المقاوم للصدأ المعادن الشعرية حوالي 15 سم. اعتمادا على وقت رد الفعل المطلوب، واستخدام الشعرية المعدنية يعد الخارجي أو واحد مع معرف أكبر.
      ملاحظة: تحديد "الحقيقي" القطر الداخلي للالشعرية المعدنية أمر بالغ الأهمية للحصول على أوقات رد الفعل دقيقة. ويمكن القيام بذلك عن طريق ربط الشعرية المعدنية إلى HPLC، تتدفق المذيب على الرغم من شعري، وتسجيل الضغط مرة أخرى. A احداهما لحساب القطر الداخلي يمكن إجراء، والقطر الداخلي الحقيقي للالشعرية المعادن تحديدها. ويمكن حساب هذا باستخدام برنامج حاسبة الوزن الجزيئي (ويندوز الإصدار 6.49).
    2. إنتاج الشق 2 مم باستخدام إعدادات الليزر منخفض الطاقة على نهاية واحدة من الزجاج الشعرية الداخلي وختم هذه الغاية من الزجاج الشعرية الداخلي (الشكل 2). بدلا من ذلك، جعل الشق باستخدام capillar الزجاج والسيراميكأداة قطع ذ أو طاحونة دوارة مع شفرة القطع الجميلة.
    3. خط المتابعة الشعرية الزجاج الداخلي مع نهاية الشعرية المعدنية (وهذا يمكن أن تيسره عرض تحت مجهر الضوء).
    4. إرفاق هذا الخلاط الحركية إلى نهاية واحدة من نقطة الإنطلاق خلط (الشكل 2).
    5. إرفاق الشعرية تنصهر فيها الزجاج السيليكا (ID: 75 ميكرون، OD: 150 ميكرون) ما يقرب من 40 سم إلى الطرف الآخر من الخلاط الحركية على نقطة الإنطلاق الاختلاط. هذا وتستخدم لتقديم حمض (حمض الخليك 5٪، ودرجة الحموضة 2.4) لإرواء رد الفعل.
      يتم تزويد كواشف إلى الجهاز مع الحقن مانعة لتسرب الغاز من خلال تترافلوروإيثيلين (PTFE) أنابيب باستخدام مضخات حقن الآلي: ملاحظة.
  3. تنشيط البيبسين
    1. تزن من 20 ملغ من البيبسين من الغشاء المخاطي في المعدة الخنازير وتعليق في 1 مل من العازلة اقتران (الفوسفات 0.1 M الصوديوم، كلوريد الصوديوم 0.15 M، ودرجة الحموضة 6.0).
    2. تزن من 50 ملغ من N -hydroxysuccinimide (NHS) الخرز agarose -activated، إضافة إلى إعادة ياليالبروتيني uspended وتناوب بلطف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    3. تدور باستمرار في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لجمع الراتنج.
    4. نضح البروتيني غير منضم.
    5. احتضان الاغاروز في 1 مل من عازلة تمنع (1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.0) وتناوب بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    6. تدور باستمرار في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لجمع الراتنج.
    7. نضح عازلة تمنع.
    8. احتضان البيبسين-الاغاروز مع حمض الخليك 1 مل من 5٪، ودرجة الحموضة 2.4 لمدة 5 دقائق.
    9. تدور باستمرار في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة لجمع الراتنج.
    10. نضح طاف.
    11. كرر الخطوات من 1.3.8 - 1.3.10 لما مجموعه ثلاثة يغسل.
    12. تخزين حبات في 1 مل حامض الخليك في 4 درجات مئوية لاستخدامها على المدى الطويل.
  4. الجمعية الجهاز
    1. تملأ الغرفة التحلل البروتيني مع الطين لتنشيط الخرز البيبسين-الاغاروز في حامض الخليك 5٪ باستخدام ملعقة معقمة.
    2. وضع المنهاج ميكروفلويديك PMMAم بين كتلتين PMMA فارغة كغطاء لاغلاق الجهاز، واصطف مع المطاط سيليكون لإنشاء ختم ضيق السائل.
    3. استخدام لوحات معدنية لقط إلى الضغط ختم الجهاز.
      ملاحظة: تم المشبك مخصصة لتناسب منصة ميكروفلويديك ويتكون من اثنين من لوحات قياس 10.1 سم × 7.4 سم × 1.2 سم.
    4. تدفق حمض الخليك 5٪، ودرجة الحموضة 2.4 بمعدل 10 ميكرولتر / دقيقة. تدفق 50 ملي العازلة خلات الأمونيوم (درجة الحموضة 6.9) على الرغم من أن خط البروتين بمعدل 1 ميكرولتر / دقيقة.
      ملاحظة: من المهم للغاية أن حمض الخليك تتدفق باستمرار من خلال الجهاز طوال مجمل التجربة. ضمان عدم وجود أي تسرب وأن السائل يتم إنهاء فقط من انتاج قناة، والتي سوف تكون بمثابة مصدر ESI.
    5. زوجان الجهاز على الواجهة الأمامية للرباعي الوقت من الطيران (Q-TOF) مطياف الكتلة تعديلها باستخدام مرحلة معزول للتعديل لتحقيق شروط electrospray المثلى.
      ملاحظة: التبديل الالتفافيةهو عرض من أجل محاكاة وجود مصدر ESI التجاري. 17

2. حل العملات في الوقت التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم

  1. الحصول على البيبسين والبروتين فقط الأطياف
    ويتم اكتساب ESI-MS في وضع ايون ايجابية مع الجهد من 4500-5000، 60-V إمكانية declustering، و 250-V تركز إمكانية: ملاحظة. يتم الحصول على أطياف على مجموعة من 350-1،500 م / ض بمعدل المسح من 1 ق -1.
    1. الحصول على الطيف الوحيد البيبسين. يتم طرح أي قمم الواردة في هذا الطيف مرة واحدة يتم إضافة البروتين.
    2. إدخال 50-100 ميكرومتر تاو / بروتين فوسفاتي-تاو (تنقية وإعداد كما سبق وصفها 13، 19) بمعدل 1 ميكرولتر / دقيقة حيث العازلة خلات الأمونيوم 50 ملي كان يتدفق سابقا.
    3. الحصول على البروتين الطيف فقط.
  2. اكتساب سنقاط و الوقت
    1. بينما البروتين 100 ميكرومتر تاو / الفوسفات-تاو تتدفق في 1 ميكرولتر / دقيقة، وإدخال D 2 O بمعدل 3 ميكرولتر / دقيقة عن طريق موصل تي والسماح للرد في الخلاط الحركي. السماح للنظام لكي تتوازن لمدة 10 دقيقة على الأقل قبل الحصول على الطيف.
      ملاحظة: بعد الصرف، وتطفئ رد فعل العلامات التي تدفق من درجة الحموضة حمض الخليك 2.4 في 10 ميكرولتر / دقيقة والهضم من البروتين المسمى يحدث في غرفة بروتين.
    2. من أجل زيادة الوقت وضع العلامات يدويا سحب موقف الزجاج الشعرية الداخلي لتحقيق خلط مرات من 42 مللي ثانية إلى 8 ق. السماح للنظام لكي تتوازن لمدة 10 دقيقة على الأقل بين كل سحب الظهير.

3. البيانات والتحليل الإحصائي

  1. تحديد الببتيدات وحساب نسبة الديوتيريوم تبادل
    1. أداء MS أطياف تحليل باستخدام البرمجيات mMass، الإصدار 5.5.0 20 .
    2. تحديد الببتيدات باستخدام ملقم البروتين إكسباسي FindPept وتأكيد من قبل الناجم عن الاصطدام التفكك (CID) عند الحاجة 21.
      ملاحظة: هنا، تم قياس التأسيس الديوتيريوم امتصاص باستخدام برنامج FORTRAN في المنزل وضعت لتحليل توزيع النظائر 22، 23.
    3. حساب معدلات الجوهرية النظرية على أساس تسلسل الأساسي باستخدام أداة على شبكة الإنترنت SPHERE 22 و 24.
    4. احتواء البيانات باستخدام واحد الانحدار المتسارع غير الخطية وتطبيع باستخدام الرسوم البيانية والبرامج الإحصائية (على سبيل المثال، SigmaPlot).
      ملاحظة: نسبة ك الباحث / ك التوليد تعطي عامل حماية (PF)، وهو مقياس شبه كمي لدرجة أن يتمحور منطقة معينة ضمن الفرقة بتكوين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت ملامح هضم الأصلي والفوسفات-تاو مماثلة، مما أسفر عن تغطية تسلسل 77.1 و 71.7٪ على التوالي. تم تحديد القيم الديوتيريوم امتصاص كل الببتيد عن طريق تركيب توزيعات النظائر لاحظ مع توزيعات النظرية تم إنشاؤها باستخدام برمجيات FORTRAN في المنزل المتقدمة. وتظهر أفضل التوزيعات المناسب (الشكل 3A) جنبا إلى جنب مع القيم امتصاص الديوتيريوم المرتبطة بها. ثم يتم إنشاء التشكيلات الحركية امتصاص، وكانت وصفت بشكل جيد من قبل تعابير أسية واحدة. (ن = 3...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بينما الأساليب البيولوجيا البنيوية مثل البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي هي مفيدة لأنها توفر الهياكل مفصلة للغاية من البروتينات، وهذه الصور هي في كثير من الأحيان ثابتة. استمر توصيف الأنواع العابرة والمجالات المهيكلة ضعيف أن يكون بعيد المنال عند دراستها من قبل هذه الأساليب التقليدية. ولذلك، من أجل اكتساب رؤى الحيوية على هذه الأنواع من أنظمة فمن المهم للعمل في فترات زمنية سريعة. لقد طبقت بنجاح TRESI-HDX-MS للحصول على رؤى تفصيلية حول التغييرات التي تحدث متعلق بتكوين ضمن IDP...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا ما نكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نعرب عن امتناننا للدكتور ماركوس زويكستيتر لتوفير ملف إحداثيات pdb لمجموعة تاو "الأصلية" التي تم التنبؤ بها من عمله في الرنين المغناطيسي النووي ، مع أدوات التحليل المساهمة التي قدمها الدكتور عدنان سلجوكا. تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل برنامج منحة ENGAGE التابع لمجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة الكندي (NSERC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بولي (ميثيل ميثاكريلات) أو PMMAللبلاستيك الاحترافيSACR.250CCP8.9 سم × 3.8 سم × 0.6 سم
السيليكا المنصهر الشعيرات الدمويةPolymicro Technologies106815-0018ID: 75 & micro ؛ م ، OD: 150 ومايكرو ؛ م
الشعيرات الدموية المعدنيةMcMaster-Carr28 ga & ndash; 89875K97
30 ga  - 89875K99
الإيثيلين البروبيلين المفلور (FEP)IDEX1477
1548		ID: 0.007", OD: 1/16"
ID: 0.020", OD: 1/16"
قاطع أنابيب البوليمر القياسيIDEXA-327ل 1/16 "و 1/8" أنابيب OD
مايكرو ساكنة خلط المحملةIDEXM-540ل 1/16 " أنابيب OD
أو
المحملة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، 0.25   ؛ مم تتحملValco Instruments Co.، Inc. (VICI)ZT1Cل 1/16 " OD أنابيب
نظرة خاطفة المحملة ل 1/16 " OD TubingIDEXP-727
10-32 أنثى إلى أنثى LuerIDEXP-659
10-32 نظرة خاطفة على الجوز مزدوج الأجنحةIDEXF-300
الطويق ل 1/16 " OD أنابيبIDEXF-142
100 سلسلة أداة دوارةDremelF013010001
أقراصJobmate1/64 "سمك
Stereomaster Digital Zoom مجهرفيشر Scientific12-563-411
لحام الحديدMastercraft58-6301-2
VersaLaserUniversal Laser
محاقنهاميلتون81220500  ومايكرو.
مضخات حقنةجهاز هارفارد70-4501
Name< / strong>Company< / strong> Catalog Number< / strong>Comments< / strong>
Recodes< / strong>
NHS AgaroseFisher Scientific26196
البيبسين من خنازير الغشاء المخاطي للمعدةسيجما ألدريتشP6887-250MG
أكسيد الديوتيريومسيجما ألدريتش151882-10X0.6ML
حمض الخليكسيجما ألدريتش695092-100 مل
HPLC الصف المياهفيشر العلميW5-4
أسيتات الأمونيومسيجما ألدريتشA7330-500G
فوسفات الصوديومفيشر العلميS369-500
كلوريد الصوديومفيشر العلميS671-3
<قوي>الاسم<قوي>الشركةCatalog NumberComments
Software/Online Tools
حاسبة
الإصدار 6.49أداة MS مفتوحة المصدر
dingerالإصدار 1.5.0.4
nameCompany Catalog NumberComments
Instruments
QStar Elite Hybrid Q-TOF مطياف الكتلةAB SCIEX
زجاج أنابيب قطع سعة L الوزن الجزيئي CorelDraw X3 Corel mMass الإصدار 5.5.0 أداة MS مفتوحة المصدر ExPASy FindPept المعهد السويسري للمعلوماتية الحيوية SigmaPlot Systat الإصدار 11.0 PyMOL Schr & ouml ؛

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
  2. Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
  3. Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization? Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
  4. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574(2015).
  5. Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
  6. Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
  7. Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
  8. Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
  9. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
  10. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
  11. Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
  12. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
  13. Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416(2015).
  14. Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
  15. Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
  16. Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
  17. Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
  18. Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
  19. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
  20. Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
  21. Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
  22. Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
  23. Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
  24. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
  25. Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
  26. Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
  27. Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development - A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
  28. Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
  29. Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
  30. Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
  31. Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
  32. Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة