حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

ملخص

هنا نقدم بروتوكولات لتنقية تقارب من المجمعات البروتين وفصلهم من قبل PAGE الأم الزرقاء، تليها البروتين ارتباط التنميط باستخدام التسمية مجانا الكمي مطياف الكتلة. هذه الطريقة مفيدة لحل interactomes إلى مجمعات البروتين متميزة.

الملخص

تعمل معظم البروتينات بالاشتراك مع البروتينات الأخرى ؛ وبالتالي ، من الأهمية بمكان توصيف هذه الوحدات الوظيفية من أجل فهم العمليات البيولوجية بشكل كامل. أصبح تنقية التقارب المقترن بقياس الطيف الكتلي (AP-MS) الطريقة المفضلة لتحديد تفاعلات البروتين والبروتين. ومع ذلك ، توفر دراسات AP-MS التقليدية معلومات عن تفاعلات البروتين ، ولكن يتم فقدان المعلومات التنظيمية. لمعالجة هذه المشكلة ، قمنا بتطوير استراتيجية لكشف التجميعات الوظيفية المتميزة التي قد يشارك فيها البروتين ، من خلال حل مجمعات البروتين المنقى بالتقارب قبل توصيفها بواسطة قياس الطيف الكتلي. يتم فصل مجمعات البروتين المعزولة من خلال تنقية تقارب بروتين الطعم باستخدام علامة الحاتمة والشطف التنافسي من خلال الرحلان الكهربائي الأصلي الأزرق. تسمح مقارنة ملامح هجرة البروتين من خلال التنميط المرتبط باستخدام قياس الطيف الكتلي الكمي بتعيين البروتينات المتفاعلة للكيانات الجزيئية المتميزة. هذه الطريقة قادرة على حل مجمعات البروتين ذات الأوزان الجزيئية القريبة التي قد لا يتم حلها بواسطة التقنيات الكروماتوغرافية التقليدية مثل ترشيح الجل. مع القليل من العمل أكثر من AP-GELC-MS / MS التقليدي ، نوضح أن هذه الإستراتيجية قد تكون كافية في كثير من الحالات للحصول على معلومات طوبولوجية معقدة للبروتين بالتزامن مع تحديد تفاعلات البروتين.

المقدمة

في الخلايا، فإن معظم البروتينات أداء مهامهم من خلال تفاعلات البروتين البروتين عابرة أو من خلال تشكيل مجالس البروتين مستقرة. تميز تفاعلات البروتين المهم لعمليات الخلوية فهم تماما. تنقية التقارب في تركيبة مع الطيف الكتلي (AP-MS) هي واحدة من الاستراتيجيات المطبقة الأكثر شيوعا لتحديد تفاعلات البروتين الأم. وقد أدخلت تحسينات كبيرة في قدرات الأدوات التي تحققت في العقد الماضي هذا النهج قوية للغاية. ومن المهم أن نلاحظ أن التفاعلات التي تم تحديدها من خلال التجارب AP-MS وتشمل خليطا من الجمعيات المباشرة وغير المباشرة بين الطعم ويفترس. وبالإضافة إلى ذلك، في كثير من الأحيان البروتينات تشارك في العديد من المجمعات المختلفة داخل نفس السياق الخلوية، والتي قد يكون لها دور البيولوجية المختلفة، وبالتالي فإن interactors التي يتم تحديدها من قبل AP-MS قد تمثل مزيجا من المجالس البروتين متميزة أو الكيانات الوظيفية. وليس من الممكن لاستخلاصهذه المعلومات الطوبوغرافية مسبقا من القوائم أحادية الأبعاد للبروتينات التي تولدها التجارب AP-MS بسيطة. ومع ذلك، فإن تقنية يمكن زيادة استغلالها لتحديد بنية البروتين المجمعات من خلال الجمع بين ذلك مع أساليب واحد أو أكثر لحل هذه التجمعات.

من أجل حل طوبولوجيا من التفاعلات البروتينية التي تم تحديدها من خلال AP-MS، وقد تم تطبيق عدة استراتيجيات. نهج واحد هو لأداء متكررة التجارب AP-MS باستخدام يفترس التي تم تحديدها في الجولة السابقة من التجارب كما الطعوم ^1. وعلى الرغم من المفيد جدا، وهذا هو تماما مهمة كثيفة العمالة على حد سواء بالتجربة وتحليلي. ويتزايد استخدام البروتين عبر ربط بالاشتراك مع مطياف الكتلة لاستخلاص المعلومات الطوبوغرافية على بروتين المجمعات ^{2، 3، 4، 5.} ومع ذلك، computatioتحليل نال من الببتيدات عبر ربط لا يزال مهمة صعبة، وبالتالي هو عنق الزجاجة في سير العمل. ظهور الكواشف ربط عبر MS-شطورة أن يسهل رسم الخرائط من بقايا الأحماض الأمينية التي هي على مقربة في التفاعل البروتينات ^{6 و 7.} وثمة بديل آخر يتمثل في الجمع بين تنقية تقارب مع تقنيات الفصل المتعامدة السابقة ^{8 و 9.} وأيضا في الآونة الأخيرة تم استخدام تجزئة الكروماتوغرافي عن طريق الترشيح هلام أو التبادل الأيوني، أو السكروز تجزئة التدرج في تركيبة مع الطيفي الكمي لوصف المجمعات multiprotein في مستوى المنظومة، من خلال تمرير العزلة خطوة معقدة ^{10، 11، 12، 13.} الأزرق هلام بولي أكريلاميد الأصلي الكهربائي (BN-PAGE) تم تطبيق على نطاق واسعالتحقيق في التفاعلات البروتينية الأم، وعادة تلك التي تنطوي على مجمعات البروتين غشاء الميتوكوندريا ^14. كما كانت تستخدم هذه التقنية الانفصال مؤخرا بالاشتراك مع التسمية خالية الكمي البروتين والتنميط الارتباط، ليس فقط على المجمعات الميتوكوندريا ^{15، 16، 17،} ولكن أيضا للكشف بروتين المجمعات الأخرى من الخلايا الكاملة ^{18 و 19.} افترضنا أن الجمع بين تنقية تقارب مع نهج تجزئة الأم اللاحقة وMS الكمي ينبغي أن توفر استراتيجية مفيدة للحل المجالس البروتين متعددة تحتوي على بروتين معين.

نحن هنا وصف الأسلوب الذي يجمع بين العامة على أساس حاتمة تنقية تقارب مع الأزرق الأصلي الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد من المجمعات معزولة، تليها س كتلة الكميectrometry والبروتين ارتباط التنميط، من أجل حل المجالس متعددة قد يكون متورطا بروتين في. نحن توظيف الماوس الجنينية الخلايا الجذعية حيث يتم التعبير عن بروتين من الفائدة تنصهر علامة حاتمة من موضع الذاتية لتحقيق مقربة من وفرة الفسيولوجية وضمان مواليد كفاءة العزلة معقدة. هذا النهج كشف النقاب عن التفاعلات متعددة بروتين يشارك في وحل لهم في مجالس مختلفة تعتمد على ملامح علاقة بهم، في حين لا تتطلب المزيد من العمل من التقليدية أنصار الكنيسة الألمانية-MS ^20.

البروتوكول

1. عزل البروتين المجمعات الأم التي FLAG تقارب تنقية

1. استعدادات
   1. انشاء 37 ° C حمام الماء لذوبان بيليه الخلية.
   2. تهدئة في microcentrifuge ل4 ° C.
   3. وضع عدة أنابيب microcentrifuge بأحجام مختلفة (1.5 مل، 15 مل) والخالط في الجليد.
   4. إعداد 10 مل من تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.1٪ Nonidet P-40، 1 ملم EDTA) والحفاظ على الجليد. فقط قبل استخدام العازلة، إضافة 10 ميكرولتر من 1 M DTT وقرص المجروش مثبطات الأنزيم البروتيني خالية من EDTA.
2. إعداد حبات مرتبطة الأجسام المضادة
   ملاحظة: المغلفة الخرز الأجسام المضادة يمكن أن تكون مستعدة تصل إلى أسبوع مقدما والاحتفاظ بها في الثلاجة لحين الحاجة إليها. بروتين G لديها تقارب أعلى من البروتين وبالنسبة لمعظم الأنواع المناعي فرعية، باستثناء مفتش أرنب، والتي البروتين A ديها أعلى النسب.
   1. يغسل 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي بروتين G المغلفة: نقل 50 &# 956؛ L حبة الطين إلى أنبوب microcentrifuge، ووضع أنبوب في مغناطيس لجمع حبات على جانب الأنبوب وإزالة السائل. إعادة تعليق الخرز في 0.5 مل من برنامج تلفزيوني، 0.01٪ توين-20.
   2. وضع أنبوب في مغناطيس لجمع حبات على جانب الأنبوب وإزالة السائل. إعادة تعليق الخرز في 40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، 0.01٪ توين-20. إضافة 10 ميكروغرام (10 ميكرولتر من 1 ملغ / مل حل الأسهم) من M2 مكافحة FLAG الأجسام المضادة. احتضان مع التناوب لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   3. وضع أنبوب في مغناطيس لجمع حبات على جانب الأنبوب وإزالة السائل. تغسل حبات مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني، 0.01٪ توين-20.
   4. لعبر ربط الأجسام المضادة إلى الخرز، وتغسل حبات مرتين مع 1 مل من 0.2 M ثلاثي إيثانول أمين الرقم الهيدروجيني 8.2. ثم، إعادة تعليق الخرز في 1 مل من 20 ملي DMP (ميثيل pimelimidate) في 0.2 M ثلاثي إيثانول أمين درجة الحموضة 8.2 (حل DMP ينبغي إعداد الطازجة مباشرة قبل الاستعمال). احتضان مع التناوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. لى>
   5. وضع أنبوب في المغناطيس. إزالة طاف و resuspend حبات في 0.5 مل من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة. احتضان مع التناوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
   6. تغسل حبات 3 مرات مع 0.5 مل من PBS 0.1٪ توين-20. ترك حبات في غسل الماضي لحين الحاجة إليها.
3. تنقية تقارب القائم على FLAG
   ملاحظة: العناية في عدم ترك حبات دون عازلة لفترة طويلة من الزمن. يجب أن تبقى جميع المخازن والأنابيب في الجليد في جميع الأوقات. هو الأمثل لبروتوكول التالية لتنقية البروتين المجمعات 2-5 × 10 ⁸ خلايا (10-20 ملغ من البروتين المحللة) معربا عن مستويات الذاتية ل-FLAG الموسومة البروتين ^20.
   1. ذوبان الجليد بيليه خلية في حمام مائي عند 37 ° C حتى يبدأ في الذوبان. خذ أنبوب للخروج من الحمام، ودوامة برفق حتى يتم إذابة بيليه تماما، والمكان على الفور الأنبوب الذي يحتوي على تعليق خلية على الجليد.
   2. إضافة 5 مل من تحلل العازلة الجليد الباردة(التي تحتوي على DTT ومثبطات الأنزيم البروتيني) إلى تعليق خلية ودوامة لخلط. احتضان في الثلج لمدة 10 دقيقة.
   3. نقل المحللة إلى الخالط Dounce البارد. ليز مع 20-30 السكتات الدماغية باستخدام مدقة ضيقة (حتى لا يبقى اللزوجة ملحوظة). نقل جناسة لأنابيب microcentrifuge الباردة.
   4. أجهزة الطرد المركزي في 18000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
   5. نقل المحللة مسح لأنبوب الباردة نظيفة. ترك 50 ميكرولتر من المحللة وراء. اتخاذ قسامة 35 ميكرولتر من المحللة لقياس تركيز البروتين ورصد تنقية.
   6. إزالة PBS 0.1٪ توين 20 من الخرز. إعادة تعليق الخرز مع 1 مل من المحللة وتخلط مع بقية المحللة. احتضان الخليط في عجلة دوارة في 4 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
   7. جمع حبات على جانب الأنبوب مع المغناطيس. جمع قسامة 30 ميكرولتر من طاف وتجاهل بقية طاف. إعادة تعليق الخرز في 0.5 مل من IPP150 العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8 و 150 مم كلوريد الصوديوم، 1MM EDTA، 0.1٪ NP-40) قبل pipetting 4-6 مرات. نقل إلى أنبوب البارد 1.5 مل.
   8. كرر يغسل مع 0.5 مل من IPP150 عازلة مرتين أخريين.
   9. تغسل حبات ثلاث مرات مع 0.5 مل من FLAG شطف العازلة الأصلي (20 ملي مكرر تريس الرقم الهيدروجيني 7، 20 مم كلوريد الصوديوم، 0.02٪ Nonidet P-40، 1 ملم EDTA، حمض 200 ملي ε أمينوكابرويك). مع غسل الماضي، ونقل الخرز لأنبوب البارد الجديد. إزالة عازلة تماما.
   10. إعادة تعليق الخرز في 100 ميليلتر من 200 ميكروغرام / مل 3X FLAG الببتيد العازلة في شطف الأصلي. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة مع دوران طيف.
   11. جمع حبات مع المغناطيس ونقل طاف لأنبوب جديد البارد.
   12. كرر الخطوات من 1.3.10-1.3.11 مرتين. تجميع كل eluates.
   13. تركيز شطافة وصولا الى 25 ميكرولتر في وحدة تصفية الطرد المركزي (10 كيلو دالتون الاسمي حد الوزن الجزيئي قطع، PES) بواسطة الطرد المركزي في 10000 x ج في 4 درجات مئوية. نقل شطافة تتركز إلى أنبوب بارد جديد وإضافة 50٪ glyceرول لتركيز النهائي من 5٪. يمكن أن تظل شطافة تتركز في 4 درجات مئوية خلال الليل إذا لزم الأمر.

2. الأزرق الأصلية PAGE

1. استعدادات
   1. إعداد 1 لتر من 1X PAGE الأم الأنود العازلة، 1X PAGE الأم أزرق داكن القطب السالب العازلة و1X PAGE الأم أزرق فاتح القطب السالب العازلة.
   2. إزالة المشط من 3-12٪ هلام PAGE الأم الجاهزة ويغسل الآبار مرتين مع 1X PAGE الأم أزرق داكن القطب السالب العازلة. ملء الآبار مع 1X PAGE الأم أزرق داكن القطب السالب العازلة. إعداد هلام في خزان تشغيل ولكن لا تقم بإضافة أزرق داكن القطب السالب العازلة إلى (داخل) غرفة الكاثود.
2. المدى الكهربي
   1. تحضير العينة: إلى 25 ميكرولتر تتركز شطافة إضافة حجم مناسب من 4X عينة العازلة تحميل الأصلي وقدره 0.5٪ G-250 عينة مضافة لتركيزات النهائي من 1X و 0.005٪ على التوالي.
   2. تحميل العينة والأم علامات الوزن الجزيئي ترك بئر فارغة بين هذا وذاكN لهم. الحمل 10-20 ميكرولتر من 1X العازلة تحميل عينة المحلية في جميع الآبار فارغة.
   3. ملء القطب السالب (داخل) غرفة مع 200 مل من 1X PAGE الأم أزرق داكن القطب السالب العازلة بعناية حتى لا تعكر صفو العينات. تملأ الغرفة الأنود (خارج) مع 550 مل من 1X PAGE الأم الأنود العازلة.
   4. تشغيل هلام في 150 V لمدة 30 دقيقة. وقف تشغيل، وإزالة أزرق داكن القطب السالب العازلة مع ماصة المصلية واستبدالها مع 1X أزرق فاتح القطب السالب العازلة. مواصلة المدى لمدة 60 دقيقة. يمكن تشغيل هلام في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية. قد يكون درجة الحرارة لها تأثير على بروتين بنية معقدة.
3. جل تلطيخ
   1. فتح كاسيت جل وتجاهل واحدة من لوحات كاسيت. هلام لا تزال تعلق على لوحة كاسيت الأخرى. نقل جل في علبة أو وعاء يحتوي على حل ما يكفي من تثبيتي (40٪ الميثانول، وحمض الخليك 2٪) لتغطية جل واحتضان لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز لطيف.
   2. إزالة solut تثبيتيايون وإضافة ما يكفي من المياه لتغطية هلام. هلام يمكن مسحها للرجوع إليها في المستقبل.

تحليل 3. الطيف الكتلي

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في غطاء تدفق الصفحي إذا أمكن لضمان نظافتها من العينات. وينبغي إعداد جميع الحلول بالماء HPLC الصف. مناقشة هذا البروتوكول مع المختبر الطيف الكتلي من شأنها أن إجراء التحليل.

1. استعدادات
   1. وضع المخروطية أسفل لوحة 96-جيدا على أعلى لوحة 96-جيدا أخرى لجمع النفايات. بيرس الجزء السفلي من الآبار من أسفل لوحة 96-جيدا المخروطية مع إبرة 21 G.
   2. غسل آبار مثقوبة لوحة 96-جيدا.
      1. إضافة 200 ميكرولتر من 50٪ حمض الفورميك أسيتونيتريل 0.25٪ إلى آبار لوحة مثقوبة. احتضان كومة وحة في شاكر لمدة 10 دقيقة.
      2. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 1 دقيقة بحيث يتدفق السائل من خلال ثقوب في لوحة جمع النفايات. تجاهل ثASTE السائل.
      3. كرر الخطوات 3.1.2.1-3.1.2.2 مرتين أخريين.
      4. ملء الآبار للاخترقت وحة 96-جيدا مع 150 ميكرولتر من 50 ملي بيكربونات الأمونيوم (تقدم طازجة).
   3. غسل الآبار ترشيح الطرد المركزي لوحة 96-جيدا.
      1. وضع العادية لوحة 96-جيدا تحت صفيحة الترشيح الطرد المركزي لجمع النفايات. إضافة 200 ميكرولتر من 50٪ حمض الفورميك أسيتونيتريل 0.25٪ لتصل إلى كل بئر من لوحة الترشيح الطرد المركزي.
      2. أجهزة الطرد المركزي في كومة وحة في 200 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل النفايات.
      3. كرر الخطوات 3.1.3.1-3.1.3.2 مرتين أخريين.
2. الختان جل وفي جل الهضم
   ملاحظة: في حين استئصال هلام، وتحديد وتقديم مذكرة من شريحة هلام تتماشى مع كل المعايير البروتين. معايير البروتين يمكن أن تستخدم لتقدير الأوزان الجزيئية التقريبية لجميع شرائح هلام.
   1. وضع الجل مع لوحة زجاجية على سطح نظيف. شريحة حارة تحتوي علىجي العينة إلى 48 شرائح متطابقة (1.5 مم × 5 مم). قطع كل شريحة إلى 2-3 قطع صغيرة (باستثناء شرائح الخمس الماضية في الجزء العلوي من هلام) ووضع كل بالتتابع شريحة في بئر واحدة من اخترقت وغسلها لوحة 96-جيدا.
   2. إضافة 50 ميكرولتر من أسيتونتريل إلى كل بئر. احتضان لوحة مع اهتزاز لمدة 30-60 دقيقة. إزالة السائل بواسطة الطرد المركزي كما في الخطوة 3.1.2.2.
   3. إضافة 200 ميكرولتر من 2 مم TCEP في 50 بيكربونات الأمونيوم ملم إلى كل بئر. احتضان لوحة مع اهتزاز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة السائل بواسطة الطرد المركزي كما في الخطوة 3.1.2.2.
   4. إضافة 200 ميكرولتر من 4 مم iodoacetamide في 50 بيكربونات الأمونيوم ملم إلى كل بئر. احتضان لوحة مع اهتزاز لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام. إزالة السائل بواسطة الطرد المركزي كما في الخطوة 3.1.2.2.
   5. إضافة 150 ميكرولتر من 50 ملي بيكربونات الأمونيوم بالإضافة إلى 50 ميكرولتر من أسيتونتريل واحتضان لوحة مع اهتزاز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة غسلمرات عديدة كما هو مطلوب حتى تتم إزالة كل لون الأزرق من القطع هلام.
   6. يذوى القطع هلام بإضافة 200 ميكرولتر من أسيتونيتريل النقي واحتضان مع اهتزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة حتى القطع جل بيضاء ومبهمة. إزالة أسيتونيتريل.
   7. إضافة 150 ميكرولتر من 0.001 ملغ / مل من التربسين (تسلسل الصف) في الباردة 50 ملي بيكربونات الأمونيوم إلى كل بئر. احتضان لوحة مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. بعد 1 ساعة، وتأكد من أن تتم تغطية القطع هلام مع السائل. إذا لم تكن هذه هي الحالة، إضافة 50-100 ميكرولتر آخر 50 بيكربونات الأمونيوم مم. بعد 2 ساعة عند 37 ° C، ومواصلة عملية الهضم عند 25 درجة مئوية خلال الليل.
   8. وضع لوحة أسفل المخروطية نظيفة تحت صفيحة تحتوي على هلام، وضمان التوجه الصحيح لوحات. جمع السائل الذي يحتوي على الببتيدات بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 1 دقيقة.
   9. وضع لوحة الببتيدات التي تحتوي في المبخر الطرد المركزي ويتبخر السائل في حين يؤدون رانه الخطوة التالية.
   10. إضافة 150 ميكرولتر من 50٪ حمض الفورميك أسيتونيتريل 0.25٪ لقطع هلام. احتضان مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   11. جمع السائل في لوحة المجففة جزئيا من الخطوة 3.2.9 بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 1 دقيقة. تواصل تبخير لوحة الببتيدات التي تحتوي على حين تنفيذ الخطوة التالية.
   12. كرر الخطوات من 3.2.10-3.2.11.
   13. إضافة 200 ميكرولتر من أسيتونيتريل النقي إلى كل بئر من لوحة تحتوي على قطع هلام. احتضان مع اهتزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
   14. جمع السائل في لوحة الببتيدات التي تحتوي بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 1 دقيقة.
   15. تأكد من أن تركيز النهائي من أسيتونيتريل في جميع الآبار فوق 55٪. إذا لزم الأمر، إضافة أسيتونيتريل النقي إضافية.
   16. نقل الحلول الببتيد لوحة الترشيح الطرد المركزي غسلها. وضع لوحة أسفل المخروطية نظيفة تحته لجمع الببتيدات. أجهزة الطرد المركزي في كومة وحة في 200 x ج لمدة 1 دقيقة.
   17. Evaporأكل السائل في لوحة أسفل المخروطية حتى آبار جافة تماما. لوحة يمكن تغطيتها بغطاء سيليكون وتخزينها في -20 ° C في هذه المرحلة.
   18. إعادة حل الببتيدات في 32 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.5٪ مع قوية تهز لمدة 15 دقيقة. إضافة 8 ميكرولتر من 400 ملي بيكربونات الأمونيوم واحتضان مع قوية تهز لمدة 15 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 200 x ج لمدة 1 دقيقة. تغطية مع غطاء سيليكون وتخزين لوحة عند -20 درجة مئوية حتى تحليل الطيف الكتلي.
3. قياس الطيف الكتلي
   ملاحظة: تحليل الببتيدات على مطياف الكتلة عالية الدقة باستخدام أساليب متوافقة مع البروتينات طلقات نارية. اكتساب يعتمد البيانات هي الأكثر شيوعا LC، جنبا إلى جنب انشاء MS لهذا النوع من التحليل وينبغي أن يكون الأمثل لتحديد الببتيد كفاءة، والتقليل من التسلسل زائدة عن الحاجة واختيار المرشحين على الضوضاء في الخلفية. يجب أن تسجل أطياف الشامل في الفحص تحليل المرحلة الأولى كتلة (MS1) في وضع الشخصي. فمن نوصيإد لتحديد تفضيلي أيونات مشحونة على نحو مضاعف وثلاثة أسباب لتحليل مرحلة كتلة الثاني (MS2). مجموعة كتلة م / ض 400-1،600 هو مناسب لتحديد معظم الببتيدات بين 8-30 مجموعة الأحماض الأمينية. هنا، يتم توفير بروتوكول للتحليل باستخدام مطياف الكتلة Orbitrap.
   1. ضخ 20 ميكرولتر من العينة في تحليل باستخدام السيارات العينات من نظام nanoLC-MS / MS. تحلية والتركيز الببتيدات على عكس المرحلة العمود C18 (100 ميكرون الهوية، 2 سم).
   2. الببتيدات منفصلة على عمود C18 التحليلي (75 ميكرون الهوية، 15 سم) باستخدام 30 دقيقة الخطي التدرج من 4-28٪ حمض الفورميك أسيتونيتريل / 0.1٪ في 300 NL / دقيقة.
   3. تحليل الببتيدات في مطياف الكتلة مع كبار طريقة الشراء 10 البيانات تعتمد مع المعلمات التالية: م / ض نطاق 380-1،600، القرار 30000 في م / ض 400، عرض عزلة 2 ث والإقصاء الديناميكي في ± 10 جزء في المليون لمدة 45 ق التلقائي السيطرة المستهدفة في 1 × 10 ⁶ لMS و 5000 لMS / MS، الحد الأقصى للوقت حقن 150 مللي ثانية لMS و100 مللي ثانية لMS / MS.

تحليل 4. البيانات

1. تحديد البروتين النوعي والكمي باستخدام MaxQuant
   1. استخدام البرنامج MaxQuant متاح مجانا لتحديد وقياس البروتينات في كل جزء من هلام البيانات الخام مطياف الكتلة.
      ملاحظة: MaxQuant يعمل على البيانات التي تم إنشاؤها من قبل اقتناء بندقية النهج البروتينات التي تعتمد على البيانات. وينبغي تحليل البيانات MS من الزرقاء الكسور جل الأم دفعة واحدة كما تجارب منفصلة وليس أجزاء من تجربة الجمع بين جميع شرائح هلام. ضع علامة في المربع قيمة iBAQ لتنفيذ العمليات الحسابية رياضيات الكيمياء. ووصف بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لتقدير البحث في قاعدة البيانات والبروتين باستخدام MaxQuant في ^{21 و 22.}
2. تحليل الشخصية من البروتين باستخدام الغول
   1. استخدام البرمجيات متاحة بحرية بيرسيوس لعرض ملامح الهجرة من البروتينات التي تم تحديدها ومقارنتها باستخدامتحليل احصائي.
      ملاحظة: وثائق عامة عن كيفية استخدام رأس الغول يتوفر في http://www.coxdocs.org/doku.php؟id=perseus:user:tutorials. A بيانات العينة هو متاح في البيانات الإضافية.
   2. تحميل الملف proteingroups.txt إرجاعها بواسطة تحليل MaxQuant التي تحتوي على البروتين هويات والقيم الكميات لجميع أجزاء هلام. نشر قيم كثافة في المربع الرئيسي (الشكل 1). ستظهر مصفوفة تحتوي على جميع الهويات البروتين في الصفوف، مع الكسور جل كأعمدة.
   3. إزالة الإدخالات المقابلة لعكس يضرب، والبروتينات التي تم تحديدها فقط من خلال الموقع والملوثات المحتملة عن طريق تحديد صفوف تصفية على أساس عمود القاطع في القائمة المنسدلة تصفية الصفوف (الشكل 2).
   4. تطبيع كثافة جزء من كل من البروتين في جميع أنحاء الشخصي مقابل مجموع كثافة البروتين عن طريق تحديد الفجوة في القائمة المنسدلة تطبيع، ثم مبلغ (الشكل 3). A م جديديبدو ATRIX.
   5. عرض الملف الشخصي المؤامرات الهجرة من جميع البروتينات عن طريق اختيار قطعة أرض الملف في القائمة المنسدلة التصور (الشكل 4).
   6. الصفوف حدد تصفية على أساس القيم الصالحة في القائمة المنسدلة تصفية الصفوف. أدخل 1 في عدد من القيم الصالحة المطلوبة.
   7. أداء المجموعات الهرمية من البروتينات التي تم تحديدها في جميع أجزاء هلام الأم الزرقاء عن طريق اختيار التجميع الهرمي في / القائمة المنسدلة PCA التجميع. قم بإلغاء تحديد مربع الأعمدة شجرة (الشكل 5). وتصور الكتل في خريطة الحرارة في علامة التبويب تجميع بجانب المصفوفة (الشكل 6).
   8. تحديد الكتلة التي تحتوي على البروتين الطعم في dendrogram. المكونات الأخرى من الكتلة تمثل البروتينات المشارك المهاجرة مع الطعم، وبالتالي فهي المحتملة البروتينات التفاعل / مفارز من نفس المجمع.

ص /> الشكل 1. لقطة من نافذة تحميل البيانات الغول. ويوضح الشكل الخطوات لتحميل تحديد البروتين والبيانات الكمي في رأس الغول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. لقطة بيرسيوس نافذة للتصفية من الإدخالات المقابلة للملوثات، عكس الزيارات والبروتينات التي تم تحديدها من قبل الموقع. اختيار تصفية الصفوف عمود القاطع يفتح نافذة جديدة لاختيار أنواع من إدخالات البروتين ليتم القضاء على من ورقة العمل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

/55498fig3.jpg "/>
الرقم 3. لقطة من نافذة التطبيع الغول. اختيار الفجوة في القائمة التطبيع يفتح نافذة جديدة، مع خيارات مختلفة. اختيار مبلغ يقسم قيمة كثافة البروتين في كل جزء من شدة الإجمالية لهذا البروتين في جميع الكسور. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. لقطة الغول إظهار مؤامرات الشخصي الهجرة. البروتينات يمكن تحديد في المصفوفة أدناه الأوضاع لتسليط الضوء على الشخصية يناظرها. شريط الأدوات يمكن استخدامها لتعديل وتصدير ملفات التعريف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المحافظة على together.within صفحة = "دائما">
الرقم 5. قطة بيرسيوس نافذة المجموعات الهرمية. ويوضح الشكل إعدادات المجموعات الهرمية للبروتينات باستخدام مانهاتن (L1) مسافة متري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6. لقطة بيرسيوس تظهر dendrogram وشدة البروتين خريطة التمثيل اللوني. سير العمل على الجانب الأيمن من لوحة رئيسية يبين كل خطوة المتخذة وما ينتج عنه من مصفوفة، ويمكن استخدامها لالتراجع عن أي خطوة. يمكن أن سير العمل أيضا تتفرع من أي مصفوفة المتوسطة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا وigure.

3. حساب العناصر المتفاعلة النسبي
   1. حدد مفارز من مجمع البروتين على أساس زملائهم في تجمع مع البروتين الطعم وترسيم ذروة الملف (الصورة) حيث تظهر.
   2. استخدام القيم iBAQ إرجاعها بواسطة تحليل MaxQuant لكل فرعية في كل جزء على حدة وتطبيع قبل المقابلة قيمة iBAQ الطعم في هذا الكسر.
   3. رسم iBAQs تطبيع للالطعم والبروتين مفارز المعقدة عبر أجزاء من ذروة اختيار وتطبيق الانحدار الخطي. حساب كمية النسبي فرعية معقدة لالطعم بمقارنة اتجاهات القيم iBAQ تطبيع بهم.
4. تقدير البروتين حجم معقدة
   1. استخدام معايير البروتين لحساب الأوزان الجزيئية توقع لمواءمة الزرقاء شرائح هلام الأم من حارة العينة. من هذه، وتوليد نموذج الانحدار الخطي بالتآمر شرائح هلام في x -axis والأوزان الجزيئية في -axis ذ. استخدام نموذج لتقدير مدى الوزن الجزيئي الملحوظ للمجمع البروتين (الخانات) استنادا إلى شريحة الأم الزرقاء (ق) من التي تم تحديدها.

النتائج

سير العمل في تنقية تقارب الأزرق التنميط الأصلي البروتين الارتباط التي كتبها الطيف الكتلي هو مبين (ABC-MS) استراتيجية في الشكل 7. يتم عزل بروتين المجمعات الوطنية حول بروتين الاهتمام من جانب تنقية تقارب باستخدام الأجسام المضادة ضد علامة حاتمة (في هذه الحالة FLAG) وشطف تنافسية. يتم حل المجمعات التي كتبها BN-PAGE، ورفعه جل حارة كله إلى 48 أقسام، وعلى استعداد لطلقات نارية LC-MS / MS. يستخدم المعلومات MS الكمية لإنشاء ملف تعريف الهجرة لكل بروتين تحديدها عبر فصل الأصلي الأزرق. البروتينات التي تتفاعل لتشكيل متميزة عرض معقدة ملامح هجرة مماثلة مع القمم superimposable. عندما يأخذ بروتين من الفائدة شارك في أكثر من محفل، لوحظ قمم متعددة في التشكيل الهجرة لها، نظرا لالمجمعات الفرعية ضمن قوة حل من هلام الأصلي الأزرق. مقارنة منهجية لميجلمحات التموينية يمكن أن يتحقق عن طريق ارتباط بروتين التنميط باستخدام المجموعات الهرمية. وتصور لdendrogram وشدة الذروة لجميع كسور في الحرارة الخريطة، تسهيل تحديد التفاعل البروتينات التي تنتمي إلى المجمعات البروتين متميزة (الشكل 8).

استخدمنا هذه الاستراتيجية لتحليل شركاء التفاعل من Mta2، وحدة فرعية أساسية من لونين NuRD إعادة عرض تعقيدا ^20. كما هو مبين في الشكل 9، عرض الملف الشخصي هجرة Mta2 قمتين من شدة واضحة بين 700 كيلو دالتون و 1.2 نجمة داود الحمراء، مع ذروة الجماعية أقل عرض أعلى وفرة. وأظهرت مفارز NuRD الأساسية الأخرى، بما في ذلك Mta1 / 3، Hdac1 / 2 و Mbd3، نمط الفصل متطابقة، وإن كانت القمم لبعض مفارز، وهي Chd4، كان Gatad2a / ب وRbbp4 / 7، وتوزيع وفرة معكوس (الشكل 9A، B). في المقابل، فإن الملف الشخصى للمعلمين2ap1، وهو عامل تنظيمي المجندين مجمع NuRD لمروجي الجينات WNT ^23، عرض فقط قمة جماهيرية أعلى (الشكل 9C)، وكذلك فعل Sall4، وقامع النسخي الذي ثبت أيضا لربط NuRD ^{20 و 24 و 25.} وهكذا، فإن تجزئة من البروتينات المرتبطة Mta2 النقاء تقارب كتبها PAGE الأم الزرقاء قادرة على حل شكلين مختلفين من مجمع NuRD.

كما يسمح ABC-MS تحديد interactors جديدة في حين تعيينهم إلى هيئات معينة تابعة للبروتين. من خلال فحص مجموعات البروتينات وشدة جزء ممثلة في الحرارة خريطة اكتشفنا وجود علاقة قوية بين مفارز NuRD وWdr5، وحدة فرعية التنظيمية للناقلة ميثيل مجمع MLL ^26، مع Wdr5 عرض قمتين الهجرة تتزامن مع اثنين NuRD صeaks (الشكل 8)، مما يشير إلى التفاعل الرواية بين Wdr5 وNuRD. أكدنا هذا التفاعل عن طريق المشاركة في مناعي وشارك في الهجرة في حجم الإقصاء اللوني ^20.

وسيكون اختيار المسافة حساب متري في المجموعات الهرمية تؤثر على شكل مجموعات، وبالتالي الارتباطات. نوصي تجريب مع مقاييس مختلفة لتحقيق أفضل تتناسب مع المعرفة التفاعل القائمة من البروتين أو مجمع الفائدة. عموما حققنا أفضل النتائج مع مانهاتن (L1) مسافة قياس ^20. كما تم الإبلاغ عن ارتباط بيرسون أو مقاييس المسافة الإقليدية لتحديد المجمعات استنادا إلى تقنيات بديلة تجزئة ^{10 و 11 و 12.}

وتشيوانويمكن أيضا أن البيانات titative MS الحصول عليها من كسور الأم الزرقاء أن تستخدم لتحديد العناصر المتفاعلة المجمعات البروتين. وتقدم (على أساس تقدير المطلقة كثافة) قيمة iBAQ مقياس الوفرة النسبية من البروتينات التي تم تحديدها ^{27 و 28.} قيم iBAQ لأعضاء بروتين معقد في جميع الكسور في ذروة الشخصي الهجرة إلى طبيعتها إلى أن من البروتين الطعم للحصول على الكميات النسبية. ينبغي أن iBAQs تطبيع عبر الذروة الشخصي لأحد أفراد بروتين معين معقدة اتباع الاتجاه الأفقي، والقيم الاتجاه تعكس رياضيات الكيمياء من البروتينات التفاعل النسبية للبروتين الطعم. للحصول على تمثيل أكثر تفصيلا للحسابات رياضيات الكيمياء، انظر ^20.

الشكل 7: رسم تخطيطي سير العمل يلخص ABC-MS الصورةtrategy. تم تعديل هذا الرقم من ^20. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8. التجميع الهرمي لمحات الهجرة BN-PAGE من interactors Mta2. وتتجمع البروتينات المرتبطة Mta2 على أساس التشابه في الملامح هجرتهم. فقط يتم عرض مجموعة فرعية من حرارة خريطة تحتوي على مجمع NuRD (المغلقة في المربع الأزرق). المربع الأصفر يسلط الضوء على علاقة قوية من Wdr5 مع مجمع NuRD. وقدرت الأوزان الجزيئية المشروح من مسافات الهجرة من المعايير البروتين تشغيل في نفس هلام. وقد نشر هذا البحث أصلا في الجزيئية والخلوية البروتيوميات ²⁰ للجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية ومو علم الأحياء lecular. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9. BN-PAGE الشخصي هجرة مفارز NuRD والبروتينات المرتبطة بها. A) Mta2 وNuRD مفارز الحالية في نمط كثافة مماثلة. B) Mta2 وNuRD مفارز مع نمط كثافة معكوس. C) Mta2 وCdk2ap1، التي هي موجودة فقط في الوزن الجزيئي كيان أعلى NuRD. وقدرت الأوزان الجزيئية المشروح من التشكيل الجانبي هجرة المعايير البروتين. وقد نشر هذا البحث أصلا في الجزيئية والخلوية البروتيوميات ²⁰ للجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية._blank "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

البيانات التكميلية: بيانات عينة. MaxQuant المستمدة ملف proteingroups.txt التي تحتوي على البروتين هويات والقيم الكمي من تجربة ABC-MS. وقد نشر هذا البحث أصلا في الجزيئية والخلوية البروتيوميات ²⁰ للجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

هنا، نحن تصف استخدام تنقية تقارب يليه الأزرق الكهربائي للهلام الأصلي في تركيبة مع مطياف الكتلة الكمي لحل مجمعات البروتين. ويوفر هذا النهج طريقة لكشف قوائم التفاعل البروتين ذات بعد واحد في المجالس البروتين وظيفية.

نحن لشرح طريقة تعتمد على استخدام البروتينات الموسومة حاتمة. ومع ذلك، إذا كان خط الخلية تعبر عن بروتين الموسومة غير متوفر، قد يكون بديلا لاستخدام أجسام مضادة ضد بروتين من الفائدة، شريطة وجود الببتيد المتاحة لتحقيق شطف تنافسية الأصلي. قد تحتاج إلى تعديل تبعا لمستوى التعبير عن بروتين الهدف كمية بدءا المادية وكمية من الخرز. ونحن أداء عادة هذا البروتوكول 2-5 × 10 ⁸ خلايا بدءا المواد، وهذا يكفي حتى للبروتينات مع مستوى التعبير منخفضة. وينبغي اختيار تكوين العازلة تحلل تجريبيا لتحقيقبالقرب من إكمال الإذابة من الطعم. وهذا قد يكون صعبا بالنسبة لبعض أنواع البروتينات، وخاصة لونين ملزمة أو بروتينات الغشاء. وتشمل الخيارات البديلة زيادة كمية الملح، شريطة أن يكون بروتين معقد تحت الدراسة هو مستقر في الملح العالية، أو باستخدام صوتنة و / أو العلاج نوكلياز لونين البروتينات ملزمة ^{20 و 29.} في حالة بروتينات الغشاء، والتحول إلى المنظفات DDM أو ديجيتونين قد يكون من المستحسن ^30. في حالة DNA البروتينات ملزمة، فمن المفيد أن تشمل نوكلياز مثل benzonase خلال خطوة تنقية ^20. إزالة كاملة من الأحماض النووية يضمن أن التفاعلات الكشف تحدث بين البروتينات ولم يتم بوساطة الحمض النووي.

وثمة عنصر حاسم في الاعتبار عند استخدام هذا النهج هو استقرار المجمع قيد التحقيق. هذا الإجراء هو طويل وقد تنطوي على لحفز البروتين بين عشية وضحاها معقدة. لقد حققنا نجاحا جيدا مع مجمعين لونين إعادة عرض (D. بوده وM. باردو، لا تظهر البيانات)، ولكن هذا يجب أن يتم تقييم. يمكن اختصارها الخطوة تنقية تقارب إذا لزم الأمر.

التقنيات البديلة التي تسمح للتجزئة الأم، مثل اللوني حجم الإقصاء، وقد استخدمت على نطاق واسع لأكثر من 50 عاما لتوصيف المجمعات البروتين. نحن وغيرنا قد أظهرت أن حل PAGE الأم الزرقاء متفوقة على أن تحقيق ذلك باستخدام حجم الإقصاء اللوني ^{20، 31، 32، 33.} ميزة أخرى لPAGE الأم الزرقاء هو أنه لا يتطلب أنظمة اللوني، والتي هي مكلفة، وإنما يستخدم البروتين المعدات الكهربي التي هي على نطاق واسع في المختبرات. من حيث التدريب العملي في الوقت المحدد، وهذه الطريقة لا تنطوي على المزيد من العمل من أنصار الكنيسة الألمانية-MS / MS التقليدي لpproach أو غير متصل الكروماتوغرافي تجزئة. لكن، وكما تفعل معظم تقنيات تجزئة، ولها حدود لحلها. المجمعات التي هي متجانسة جدا أو قريبة في الكتلة والشكل قد يكون وراء قرار تقدمها PAGE الأم الزرقاء، وبالتالي البروتوكول كما ذكرت هنا قد لا تكون ناجحة عالميا في حل المجمعات متميزة مع مفارز مشتركة. ومن المشجع أن نكون قد وفقنا في فصل مجمعين رباعي القسيمات مشابهة جدا تقاسم ثلاثة مفارز (M. باردو، مخطوطة في الإعداد).

منذ مطياف الكتلة قد تصبح حساسة على نحو متزايد، حتى كميات ضئيلة من interactors والملوثات غير محددة يمكن اكتشافه في عينات AP-MS. النهج المقدمة هنا قد يساعد في التمييز interactors حقيقية من التلوث الخلفية في تنقية تقارب من خلال التركيز على الاهتمام على البروتينات مع وجود قمم الهجرة التي تتزامن مع قمم الطعم الهجرة على أعلى الوزن الجزيئي من ذلكالبروتينات أحادى.

وقد استخدمت العديد من المجموعات تقنيات تجزئة تليها البروتين ارتباط التنميط لتحديد بروتين المجمعات على نطاق واسع الخلوي دون الحاجة لعزل السابقة ^{10 و 11 و 12 و 34.} ومع ذلك، فإن هذا يمكن أن يؤدي إلى الفشل في الكشف عن التفاعلات شبه متكافئة. إدراج خطوة التخصيب من خلال تنقية تقارب يمكن أن يساعد على التغلب على هذا. يجب أن يكون النهج الموصوف هنا من المفيد بشكل عام لاستكشاف طوبولوجيا المجمعات البروتين وكشف المجمعات متعددة بروتين معين يشارك في داخل نفس السياق الخلوية. استراتيجية بسيطة وقابلة للمختبرات التي قد لا تكون مكلفة المعدات تجزئة الكروماتوغرافي لحل مجمعات البروتين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
بروتين G Dynabeads	Life Technologies	10003D
FLAG الجسم المضاد M2	Sigma-Aldrich	F1804
Tween-20 ، درجة البروتين ، محلول 10٪	Millipore	655206
ثنائي ميثيل بيميليميدات	سيجما ألدريتش	80490
0.2 M عازلة ثلاثي إيثانول أمين ، درجة الحموضة 8.2	سيجما ألدريتش	T0449
3x علم الببتيد	سيجما ألدريتش	F4799
فيفاسبين 5K NMWCO, PES	Sartorius	VS0112
NativePAGE 3-12٪ Bis-Tris gel	Life Technologies	BN1001
20x NativePAGE تشغيل تقنيات الحياة العازلة		BN2001
20x NativePAGE تقنيات الحياة المضافة الكاثودية		BN2002
4x NativePAGE نموذج تحميل المخزن المؤقت	Life Technologies	BN2003
NativeMARK	Life Technologies	LC0725
NativePAGE 5٪ G-250 عينة مضافة	Life Technologies	BN2004
Nunc صفيحة مخروطية القاع 96 بئر ، بولي بروبيلين	Thermo	249944
نظام ترشيح HTS 96 جيدا	Thermo	MSDVN6550
Nunc غطاء	حراري	276002
TCEP (تريس (2-كربوكسي إيثيل) هيدروكلوريد الفوسفين)	سيجما ألدريتش	646547
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
Acetonitrile ، درجة HPLC	Fisher Scientific	A / 0627/17
Trypsin ، درجة التسلسل	Roche	11418475001
MaxQuant (برنامج)	NA.	ن.	http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
Perseus (برمجيات)	N.A.	ن.	http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus