مقالة منهجية

الكشف عن التعبير ميكرورنا في الغشاء البريتوني من الفئران باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي ير

DOI:

10.3791/55505

⸱

يونيو 27, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Nephrology, Department of Internal Medicine, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم بروتوكول للكشف عن التعبير ميكرورنا في الفئران الغشاء البريتوني باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي عكس النسخ البلمرة سلسلة من ردود الفعل. هذه الطريقة مناسبة لدراسة الملف الشخصي التعبير ميكرورنا في الغشاء البريتوني الفئران في العديد من الحالات المرضية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ميكرورناس (ميرناس) هي رنا غير نكودينغ الصغيرة التي تنظم رسول رسول التعبير بعد ترانسكريبتيونالي. وقد تم التحقيق في الملف الشخصي التعبير ميرنا في مختلف الأجهزة والأنسجة في الفئران. ومع ذلك، لم يتم تأسيس أساليب موحدة لتنقية ميرناس والكشف عن التعبير في الغشاء البريتوني الفئران راسخة. قمنا بتطوير طريقة فعالة وموثوق بها لتنقية وتحديد ميرناس باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي عكس النسخ البلمرة سلسلة من ردود الفعل (كرت-ير) في الفئران الغشاء البريتوني. يتكون هذا البروتوكول من أربع خطوات: 1) تنقية عينة الغشاء البريتوني. 2) تنقية رنا الكلي بما في ذلك ميرنا من عينة الغشاء البريتوني. 3) النسخ العكسي من ميرنا لإنتاج [كدنا]؛ و 4) كرت-ير للكشف عن التعبير ميرنا. باستخدام هذا البروتوكول، قررنا بنجاح أن التعبير عن ستة ميرناس (ميرنا-142-3p، ميرنا-21-5p، ميرنا-221-3p، ميرنا -223-3p، ميرنا -327، و ميرنا -34a-5P) زيادةبشكل ملحوظ في الغشاء البريتوني من الفئران نموذج التليف البريتوني مقارنة مع تلك الموجودة في مجموعات السيطرة. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة الملف الشخصي للتعبير ميرنا في الغشاء البريتوني من الفئران في العديد من الحالات المرضية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ميكرورناس (ميرناس) قصيرة، رناس غير الشفرة التي بعد ترانسكريبتيونالي تنظيم رنا رسول (مرنا) التعبير 1 . التغيرات في التعبير عن ميرناس تنظيم التعبير عن العديد من مرناس التي تلعب الأدوار المحورية في مختلف الظروف المرضية، بما في ذلك السرطان، والتهاب، واضطرابات التمثيل الغذائي، والتليف 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 . لذلك، ميرناس لها إمكانات المؤشرات الحيوية الرواية والأهداف العلاجية 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 . وقد تم تحديد الملف الشخصي التعبير ميرنا في مختلف الفئرانوالأعضاء والأنسجة، بما في ذلك الكبد والقلب والرئة والكلى 9 . ومع ذلك، لم يتم تأسيس أساليب موحدة لتنقية وكشف عن ميرناس في الغشاء البريتوني الفئران راسخة.

الهدف العام من هذا البروتوكول هو لتنقية بنجاح وكشف ميرناس في الغشاء البريتوني الفئران. أولا، تم تجانس عينة الغشاء البريتوني باستخدام الخالط الزجاج، تليها التعرض لنظام التمزق الحيوي البوليمر في عمود تدور ميكروسنتريفوج 10 . بعد ذلك، تم تنقية مجموع الحمض النووي الريبي بما في ذلك ميرنا من عينة الغشاء البريتوني باستخدام عمود تدور غشاء السيليكا القائمة على 10 . ثم، تم تصنيعه [كدنا] من الحمض النووي الريبي مجموع المنقى باستخدام ترانسكريبتاس العكسي، بولي (A) البلمرة، و أوليغو دت التمهيدي 11 . وأخيرا، تم تحديد التعبير عن ميرنا بواسطة كرت-ير باستخدام صبغ مقحم 11 . والأساس المنطقي لهذا البروتوكول هو بأسيد على الدراسات السابقة التي أظهرت تنقية كبيرة والكشف عن ميرنا في الأنسجة عن طريق عملية بسيطة 8 ، 10 ، 11 . وقد أفيد بأن استخدام نظام تمزيق بيوليمر الحيوية في عمود تدور ميكروسنتريفوج والعمودي تدور الغشاء السيليكا الغشاء يمكن تنقية عالية الجودة الحمض النووي الريبي مجموع من الأنسجة 10 . وقد تم الإبلاغ عن طريقة توليف [كدنا] من تنقية الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام ترانسكريبتاسيس العكسي، بولي (A) البلمرة، و أوليغو دت التمهيدي، وطريقة الكشف عن التعبير ميرنا بواسطة كرت-ير باستخدام صبغ مقحم في هذا البروتوكول لإظهار دقة عالية و حساسية 11 . وبالإضافة إلى ذلك، وهذا هو عملية بسيطة، مما يوفر الوقت ويمنع الخطأ التقني. لذلك، هذا البروتوكول مفيد في الدراسات التي تتطلب الكشف دقيقة للغاية وحساسة من ميرنا في الفئران الغشاء البريتوني في مجموعة واسعة من الحالات المرضية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية الحيوانية من قبل لجنة الأخلاقيات الحيوانية من جامعة جيتشي الطبية وأجري وفقا وفقا لرعاية واستخدام المبادئ التوجيهية الحيوانات التجريبية من دليل جامعة جيتشي الطبية للحيوانات المختبر.

1. البريتوني جمع العينات

  1. جمع العناصر التالية: 50 مل أنبوب الطرد المركزي مع القطن منقوع في إيسوفلوران، ورقة الفلين، طبق بتري مع الفوسفات مخزنة المالحة (بس)، مقص الجراحية، وملقط.
  2. الموت ببطء الفئران مع جرعة زائدة من إيسوفلوران، ثم رش الجلد في البطن من الفئران مع الايثانول 70٪، وجبل الفئران على ورقة الفلين على ظهرها.
  3. جعل شق طولي في الجلد في البطن، والعضلات، والغشاء البريتوني باستخدام مقص وملقط.
  4. التقاط الغشاء البريتوني باستخدام ملقط، وجعل الشقوق الأفقية على الجزء العلوي على طول العظم الضلع السفلي تحت الحجاب الحاجز وعلى لأور، جانب، عن، ال التعريف، جانبي، اقليم، الاستعمال، ال التعريف، جراحية، سسيسورس. المقبل، وجعل الشقوق الطولية الجانبية لإزالة الغشاء البريتوني من الجسم باستخدام مقص جراحي. ثم، وغسله مع برنامج تلفزيوني في طبق بتري.
  5. قطع وتقليم 20 ملغ (3-5 ملم 2 ) من عينات الغشاء البريتوني، وهو حجم مناسب للخطوات التالية، وذلك باستخدام مقص جراحي وملقط.

2. تنقية رنا الكلي من عينات الغشاء البريتوني

ملاحظة: هنا، يتم تجانس عينات الغشاء البريتوني وزنها 20 ملغ باستخدام الخالط الزجاج ونظام تمزيق بيوليمر الحيوية في العمود تدور ميكروسنتريفوج. ثم، يتم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من عينة الغشاء البريتوني باستخدام عمود تدور الغشاء السيليكا الغشاء.

  1. جمع العناصر التالية: 1.5 أو 2.0 مل أنابيب ميكروسنتريفوج، الإيثانول بنسبة 100٪، الكلوروفورم، الخالط الزجاج، والجليد، ونظام تمزيق البوليمر الحيوي في عمود تدور ميكروسنتريفوج 10 عمود الغزل على أساس السيليكا غشاء 10 ، الفينول / كوانيدين القائم على تحلل كاشف، غسل العازلة بما في ذلك غوانيدين والإيثانول (غسل العازلة 1)، وغسل العازلة بما في ذلك الإيثانول (غسل العازلة 2).
  2. وضع 20 ملغ عينة الغشاء البريتوني في الخالط الزجاج وإضافة 700 ميكرولتر من الكاشف تحلل القائم على الفينول / غوانيدين.
  3. تجانس عينة الغشاء البريتوني عن طريق الضغط ببطء على مدقة على العينة مع التواء. كرر هذه العملية عدة عشرات من المرات على الجليد حتى عينة الغشاء البريتوني قد حلت تماما في كاشف تحلل القائم على الفينول / غوانيدين.
  4. لمزيد من التجانس، نقل المحللة المتجانس إلى نظام تمزيق البوليمر الحيوي في عمود تدور ميكروسنتريفوج في أنبوب جمع 2.0 مل. ثم، أجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
  5. نقل المحللة المتجانس إلى أنبوب ميكروسنتريفوج جديد.
  6. إضافة 140 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى المحللة المتجانسة وغطاء الحوضe بشكل آمن. ثم، مزيج أنبوب عن طريق انقلاب لمدة 15 ثانية.
  7. احتضان العينات لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، أجهزة الطرد المركزي لهم في 12000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  8. نقل طاف (عادة 300 ميكرولتر) إلى أنبوب ميكروسنتريفوج جديد دون إزعاج راسب، وإضافة 1.5X حجمه (عادة 450 ميكرولتر) من الايثانول بنسبة 100٪. ثم، مزج العينة بواسطة فورتيكسينغ لمدة 5 ثوان.
  9. ماصة تصل إلى 700 ميكرولتر من العينة في عمود تدور الغشاء السيليكا الغشاء وضعت في أنبوب جمع 2.0 مل. أغلق غطاء العمود. ثم، أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 15 ثانية. بعد الطرد المركزي، وتجاهل تدفق من خلال في أنبوب جمع.
  10. إضافة 700 ميكرولتر من غسل العازلة 1 إلى عمود تدور الغشاء السيليكا الغشاء لغسل بعنف العينة. أغلق غطاء العمود. ثم، أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 15 ثانية. بعد الطرد المركزي، وتجاهل تدفق من خلال في أنبوب جمع.
  11. إضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة 2 إلى السيليكا-ممبرن القائم على عمود تدور لإزالة أي أثر للملح. أغلق غطاء العمود. ثم، أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 15 ثانية. بعد الطرد المركزي، وتجاهل تدفق من خلال في أنبوب جمع.
  12. كرر 2.11.
  13. أجهزة الطرد المركزي العمودية تدور على غشاء السيليكا الغشاء مرة أخرى في 15،000 x ج لمدة 1 دقيقة. بعد الطرد المركزي، وتجاهل تدفق من خلال في أنبوب جمع.
  14. وضع عمود تدور الغشاء السيليكا الغشاء في أنبوب جمع 1.5 مل جديد. ثم، ونقل 25 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه في العمود. أغلق غطاء العمود. ترك العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم، أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  15. نقل 25 ميكرولتر شطافة تحتوي على مجموع الحمض النووي الريبي إلى أنبوب ميكروسنتريفوج جديد. ثم، تخزينه في -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.

3. النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي مجموع

ملاحظة: مرجع والالتزام الحد الأدنى من المعلومات لنشر الكمي في الوقت الحقيقي ير التجربة(ميق) تشجع ممارسة أفضل وتساعد في الحصول على نتائج موثوقة لا لبس فيها 12 .
ملاحظة: هنا، ما مجموعه 1.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي معزولة هو عكس مكتوبة باستخدام ترانسكريبتاسيس العكسي، بولي (A) البلمرة، و أوليغو دت التمهيدي.

  1. جمع العناصر التالية: 1.5 مل أنابيب ميكروسنتريفوج. أنابيب الشريط ثمانية جيدا. ريبونوكلياز المياه مجانا. جليد؛ مجموعة النسخ العكسي (انظر جدول المواد) 11 .
  2. إعداد حل مزيج الرئيسي الذي يحتوي على 2.0 ميكرولتر من مزيج حمض النووي 10X، 2.0 ميكرولتر من مزيج ترانسكريبتاس العكسي (من عدة)، و 4.0 ميكرولتر من العازلة مرحبا 5X المواصفات لما مجموعه 8.0 ميكرولتر لكل أنبوب.
  3. الاستغناء 8.0 ميكرولتر من حل مزيج الرئيسي (من عدة) في كل أنبوب.
  4. قياس كمية من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مقياس الطيف الضوئي. إضافة 1.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع معزولة تنقيته من عينة الغشاء البريتوني إلى كل أنبوب.
    ملاحظة: كرت-ير يمكن أن يؤديها وسينغ رنا الكلي كقالب دون النسخ العكسي لمراقبة الجودة من الحمض النووي الريبي مجموع المنقى. إذا ملوث أي دنا، ويلاحظ منتجات التضخيم غير متوقعة من قبل كرت-ير.
  5. إضافة ريبونوكلياز خالية من المياه إلى كل أنبوب إلى ما مجموعه 20 ميكرولتر. ثم، تخلط جيدا عن طريق بيبتينغ وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية.
  6. احتضان العينات لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. احتضان فورا لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة في سيكلر الحرارية.
  7. نقل [كدنا إلى أنبوب ميكروسنتريفوج جديد وتمييع عشر مرات (1:10) مع المياه خالية من ريبونوكلياز.
  8. تخزين كدنا المخفف على الجليد مؤقتا، وعند -80 درجة مئوية على المدى الطويل قبل الاستخدام.

4. كرت-ير من ميرنا

ملاحظة: يتم تنفيذ كرت-ير من ميرنا باستخدام صبغ مقحم. هنا، الاشعال ل رنا، U6 النووية الصغيرة 2 (RNU6-2)، ميرنا-142-3p، ميرنا -21-5p، ميرنا-221-3p، ميرنا -223-3p، ميرنا -327، و ميرنا -34a-5P استخدمت.

  1. جمع العناصر التالية: 1.5 مل أنابيب ميكروسنتريفوج، 96-جيدا لوحة رد الفعل ل كرت-ير، فيلم لاصق لوحة 96-جيدا رد فعل، الاشعال ميرنا محددة، الأخضر ير يستند صبغ كيت (انظر الجدول المواد) 11 ، و في الوقت الحقيقي ير أداة.
  2. إعداد مزيج الرئيسي يحتوي على 12.5 ميكرولتر من 2X ير مزيج الرئيسي، 2.5 ميكرولتر من 5 ميكرومتر كل التمهيدي ميرنا الذائبة في المياه نوكليس خالية، و 1.25 ميكرولتر من التمهيدي العالمي 10X لكل بئر.
  3. الاستغناء 22.5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة 96 جيدا.
  4. إضافة 2.5 ميكرولتر من قالب [كدنا] لكل بئر.
  5. ختم لوحة مع فيلم لاصق لوحة 96-رد فعل جيدا. ثم، أجهزة الطرد المركزي لوحة في 1000 x ج لمدة 30 ثانية.
  6. تشغيل برنامج الدراجات ير مع الوقت الحقيقي ير أداة والبرمجيات على النحو التالي.
    1. تعيين لوحة في الوقت الحقيقي ير أداة. في الوقت الحقيقي البرمجيات ير، وتحديد الخصائص التجريبية (المدخلات التجريبيةاختر "96- ويلز " للنوع التجريبي للأداة، واختر "2 - طريقة ΔΔCT " لطريقة الكميات، واختر "الكواشف الخضراء سيبر" للكاشف لاكتشاف التسلسل المستهدف، واختر "سرعة المنحدر القياسية" أداة المدى).
    2. ثم، تعيين أسماء للعينات وميرناس المستهدفة في كل بئر. يتم اختبار العينات دائما في نسخة مكررة أو ثلاثية للحصول على بيانات كافية للتحقق من صحة النتائج. حدد عينة مرجعية والسيطرة الذاتية. حدد "لا شيء" للصبغة لاستخدام كمرجع السلبي.
    3. إدخال حجم رد فعل من "20 ميكرولتر" وظروف الدراجات ير التالية في الوقت الحقيقي البرمجيات ير وفقا للتعليمات: بريانكوباشيون عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ثم 40 دورات من تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، الصلب في 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، والإرشاد في 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
  7. تحليل بيانات كرت-ير شالغناء البرنامج من أداة ير في الوقت الحقيقي. تأكد من أن العتبة وخط الأساس التي يتم تحديدها تلقائيا بواسطة البرامج مناسبة في كل بئر.
  8. تحقق من دورة الحد من ميرناس الهدف في كل عينة. ودورة العتبة هي التقاطع بين منحنى التضخيم وخط العتبة. ثم، تطبيع مستوى التعبير من ميرناس الهدف ضد RNU6-2 باعتبارها السيطرة الذاتية، وحساب مستوى التعبير النسبي من ميرناس الهدف باستخدام طريقة 2 - ΔΔCT 13 .
    ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أنه ينبغي التحقق من استقرار مستوى التعبير من ميرنا التحكم الذاتية. في هذه التجربة، تم تأكيد RNU6-2 على مستوى عال ومتغير نسبيا عبر كل مجموعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستند النتائج المعروضة هنا على دراستنا ذكرت سابقا 8 . نحن التحقيق في الملف الشخصي التعبير ميرنا في التليف البريتوني. التليف البريتوني هو أحد المضاعفات الرئيسية في غسيل الكلى البريتوني. ويتميز فقدان الخلايا أحادية الطبقة الظهارية وتراكم الزائد من مكونات المصفوفة خارج الخلية، ويرتبط مع فشل الغشاء البريتوني 14 ، 15 . تم إنتاج نموذج الفئران التليف البريتوني عن طريق الحق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام بروتوكول المقدمة في هذه المخطوطة، ميرناس في الفئران الغشاء البريتوني تم تنقيته بنجاح وكشف باستخدام كرت-ير. موثوقية تحليل البيانات كرت-ير يعتمد على نوعية ميرناس المنقى. لذلك، قد يتم فحص نقاء ميرناس قبل كرت-ير بنسبة الامتصاصية في 260 نانومتر إلى أن في 280 نانومتر، والتي يمكن قياسها باستخدام الطيفي. عندما تضخيم كبير من ميرنا لا يمكن الحصول عليها باستخدام كرت-ير، يمكن زيادة تركيز قالب [كدنا]. ويمكن أيضا زيادة تركيز كل ميرنا التمهيدي محددة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه لا يوجد لديهم أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر مياكو شيجيتا لدعمها الفني الممتاز. وقد حظي هذا العمل بدعم جزئي من جسبس كاكينهي (رقم المنحة 25461252).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
جهاز التقطيع QIAQiagen79654نظام تمزيق البوليمر الحيوي في جهاز طرد مركزي صغير عمود الدوران
miRNeasy مجموعة صغيرةQiagen217004عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا
QIAzol كاشف التحللQiagen79306كاشف التحلل القائم على الفينول / الجوانيدين
العازلة RLTQiagen79216عازلة الغسيل 1
Buffer RWTQiagen1067933wash buffer 2
miScript II RT kit  يتضمن Qiagen21816110 مرات ؛ مزيج النوى الذي يحتوي على الديوكسي نوكليوتيدات ، ثلاثي الفوسفات الريبونوكليوتيد ، والبادئات oligo-dT. مزيج النسخ العكسي miScript الذي يحتوي على بولي (أ) بوليميراز والنسخ العكسي و ؛ miScript HiSpec buffer
miScript SYBR Green PCR kitQiagen218073 يتضمن QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix و miScript Universal Primer
RNU6-2 primer   يتمالكشفQiagen
التمهيدي miRNA-142-3pQiagenMS000314515'-UGUAGUGUUUCC
UACUUUAUGGA-3'   
miRNA-21-5p التمهيديQiagenMS000090795'-UAGCUUAUCAG
ACUGAUGUUGA-3'miRNA-221-3p
التمهيديQiagenMS000038575'-AGCUACAUUGU
CUGCUGGGUUUC-3'miRNA-223-3p
التمهيديQiagenMS000333205'-UGUCAGUUUG
UCAAAUACCCC-3'miRNA-34a-5p
التمهيديQiagenMS000033185'-UGGCAGUGUCU
UAGCUGGUUGU-3'miRNA-327
التمهيديQiagenMS000008055'-CCUUGAGGGG
CAUGAGGGU-3'MicroAmp
Optical 96 لوحة تفاعل بئر ل qRT-PCRThermo Fisher Scientific431681396 بئر لوحة
MicroAmp Optical Adhesive Film   ؛Thermo Fisher Scientific4311971للوحة تفاعل 96 بئرا
QuantStudio 12K Flex نظام PCR في الوقت الحقيقيThermo Fisher Scientific4472380أداة PCR في الوقت الفعلي
QuantStudio 12K Flex الإصدار 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380أداة PCR في الوقت الحقيقي
ميثيل جليوكسالسيجما-ألدريتشM0252
MidpericTerumoلا يتم تعيينه   ؛سائل غسيل الكلى البريتوني
Sprague– Dawley ratsSLCلا يتم تعيينه  
لم عن MS00033740 تفاعل فيلم لاصق برنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
  2. Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
  3. Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
  4. Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
  5. Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
  6. Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
  7. Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
  8. Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
  9. Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005(2014).
  10. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  11. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  12. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  13. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  14. Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, Suppl 4. S22-S42 (2000).
  15. Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. The pathophysiology of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).
  16. Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
  17. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate? BMC Genomics. 6, 59(2005).
  18. Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary? Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MicroRNA ExpressionQuantitative Real time PCRPeritoneal MembraneRNA PurificationReverse TranscriptionmiRNA DetectionPeritoneal FibrosisRat ModelTotal RNA IsolationqRT PCR Protocol

مقالات ذات صلة