مقالة منهجية

A 5-ماك دوت بلوت الفحص تحديد مستوى الحمض النووي ميثيلاتيون من تشوندروسيت التفرق في المختبر

DOI:

10.3791/55565

⸱

مايو 17, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangzhou Medical University, 2Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Laboratory of Digital Orthopeadic Engineering, Department of Orthopedics, Shenzhen Second People's Hospital (The First Hospital Affiliated to Shenzhen University), 3Department of Chemistry, The Chinese University of Hong Kong, 4School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, 5Renji Hospital Clinical Stem Cell Research Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 6Shantou University Medical College

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم طريقة لقياس مثيلة الحمض النووي على أساس 5-ميثيلسيتوسين (5-مك) نقطة لطخة. لقد حددنا مستويات 5-مك خلال ديدفيرنتياتيون غضروفي. ويمكن استخدام هذه التقنية البسيطة لتحديد بسرعة النمط الظاهري غضروفي في علاج إسي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

و ديديفرنتياتيون من غضروفية هيالين في غضروفية الليفية غالبا ما يرافق التوسع أحادي الطبقة من غضروفية في المختبر . ويعتبر مستوى مثيلة الحمض النووي العالمي من غضروفية لتكون علامة بيولوجية مناسبة لفقدان النمط الظاهري غضروفي. ومع ذلك، فإن النتائج التي تستند إلى أساليب تجريبية مختلفة يمكن أن تكون غير متناسقة. ولذلك، فمن المهم لوضع طريقة دقيقة وبسيطة وسريعة لتحديد مستويات الحمض النووي العالمية خلال ديدفيرنتياتيون غضروفي.

تعتمد تقنيات تحليل المثيلة الحالية على نطاق الجينوم إلى حد كبير على تسلسل الجينوم ثنائي الكبريت. بسبب تدهور الحمض النووي أثناء تحويل ثنائي الكبريت، هذه الطرق تتطلب عادة حجم عينة كبيرة. وتشمل الأساليب الأخرى المستخدمة لتحديد مستويات مثيلة الحمض النووي العالمية عالية الأداء اللوني السائل (هبلك). ومع ذلك، يتطلب هبلك هضم كامل من الحمض النووي الجيني. بالإضافة إلى ذلك، فإن ارتفاع تكلفة باهظة من هبلك فيسترومنتس حدود تطبيق هبلك على نطاق أوسع.

في هذه الدراسة، تم استخراج الحمض النووي الجيني (غنا) من تشوندروسيتس الإنسان مثقف مع عدد متفاوت من الممرات. تم الكشف عن مستوى مثيلة غنا باستخدام مقايسة محددة نقطة لطخة مقايسة. في هذا النهج نقطة وصمة عار، ورصدت خليط غنا تحتوي على الحمض النووي ميثليته ليتم الكشف عنها مباشرة على غشاء N + كنقطة داخل نمط قالب دائري رسمها سابقا. وبالمقارنة مع غيرها من نهج النشاف القائم على الرحل الكهربائي وغيرها من إجراءات النشاف المعقدة، وطريقة نقطة وصمة عار يوفر وقتا كبيرا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن البقع نقطة الكشف عن مستوى مثيلة الحمض النووي الشامل باستخدام المتاحة تجاريا 5-مك الأجسام المضادة. وجدنا أن مستوى مثيلة الحمض النووي تختلف بين الثقافات الفرعية أحادي الطبقة، وبالتالي يمكن أن تلعب دورا رئيسيا في ديفيدفيرنتياتيون غضروفي. و 5-مك نقطة لطخة هو وسيلة موثوقة وبسيطة وسريعة للكشف عن مستوى مثيلة الحمض النووي العام ل إيفالواتالنمط الظاهري غضروفي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

زرع خلية غضروفي الذاتي (إسي) هو جديد نسبيا، للدولة من بين الفن الإجراء لعلاج عيوب الغضروف المفصلي 1 ، 2 . واحدة من الخطوات الحاسمة في إسي هو التضخيم من غضروفية عن طريق ثقافة أحادي الطبقة في المختبر . خلال التضخيم، غضروفية هيالين تفقد بسهولة النمط الظاهري وتصبح ديديفيرنتياتد، وهو أمر غير مرغوب فيه لعلاج إسي 3 ، 4 . لتحسين نتيجة العلاج إسي، ينبغي تحديد مدى ديفيدفيرنتياتيون غضروفية قبل إعادة الزرع. لا بد من إنشاء وسيلة اقتصادية وسريعة لتحديد حالة غضروفية. في الآونة الأخيرة، وقد اجتذب الارتباط بين مثيلة الحمض النووي و غوندروسيت ديفيدفيرنتياتيون الكثير من الاهتمام 4 ، 5 ، 6 . مثيلة الحمض النووي هي عملية من قبل ويتم إضافة مجموعات الميثيل إش إلى الحمض النووي، مما أدى إلى تحويل بقايا السيتوزين إلى 5-ميثيلسيتوسين (5-مك).

لتوضيح بيولوجيا مثيلة الحمض النووي في ديدفيرنتياتيون غضروفي، الخطوة الأولى هي لتقييم مستوى مثيلة الحمض النووي من غضروفية، والتي حتى الآن أثبتت تحديا. تسلسل الجينوم ثنائي السلفيت هو الأكثر استخداما على نطاق واسع لتحليل مثيلة الحمض النووي 7 ، 8 . في هذا الفحص، تحويل ثنائي الكبريت يسبب تدهور الحمض النووي، وبالتالي يجب توفير كمية كبيرة من العينة للفحص. أيضا، عالية الأداء اللوني السائل (هبلك) وقد استخدمت لقياس مستويات الحمض النووي العالمية 9 ، 10 . ومع ذلك، يتطلب تحليل هبلك الهضم الحمض النووي الجيني. وعلاوة على ذلك، مطلوب أدوات تجريبية متقدمة ومكلفة. لذلك، بالإضافة إلى التكلفة العالية، وهذه الإجراءات التجريبية هي سلبيات الوقتuming. وأصبحت الأجسام المضادة المضادة 5-ماك متاحة تجاريا الآن، مما خلق إمكانية للنشاف المناعي من الحمض النووي الجيني التي تحتوي على 5 ميكروغرام من الجينومات المعقدة.

في هذا التقرير، نحن استخراج الحمض النووي الجيني من غضروفية نمت في سلسلة من الثقافات أحادي الطبقة. استخدمنا فحص نقطة وصمة عار لتقييم محتوى 5-مك في غضروفية الإنسان مع أعداد مختلفة من الممرات. وجدنا أن المحتوى 5-مك قد زاد في غضروفية ديديفيرنتياتد عالية مقارنة مع غضروفية مع انخفاض الدرجة ديفيدفيرنتياتيون. بالإضافة إلى ذلك، حددنا العلاقة بين حالة التباين ومستويات 5-ماك. وأخيرا، أبلغنا أن التغييرات في المحتوى 5-مك كانت مرتبطة النمط الظاهري غضروفي. ولذلك، فإن 5-مك نقطة وصمة عار الفحص هو وسيلة موثوقة وبسيطة وسريعة للكشف عن مستوى مثيلة الحمض النووي في غضروفية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات الإنسانية في مستشفى الشعب الثاني شنتشن.

1. الإنسان المفصلي الغضروف الأنسجة جمع و غضروفي الثقافة

  1. إعداد المواد
    1. إعداد وسط دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل الأبقار الجنين و 1٪ البنسلين الستربتومايسين. إعداد 1 ملغ / مل كولاجيناز الثاني، 0.25٪ التربسين-إدتا، الفوسفات مخزنة المالحة (بس)، ومصفاة الخلية (40 ميكرون النايلون).
  2. الإنسان، غضروف، أنسجة، الجمع
    1. عزل الغضروف المفصلي من المفاصل في الركبة من المرضى المانحة بعد الصدمة. الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المشاركين.
    2. النرد الغضروف في 1-2 ملم 3 قطع باستخدام مشرط العقيمة وهضم غضروفية من الغضروف المفروم مع 1 ملغ / مل كولاجيناز الثاني في دمم عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
    3. تصفية سيل الناتجلتر تعليق من خلال مصفاة الخلية (40 ميكرون) وغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    4. عد الخلايا مع عدادة الكريات والبذور بكثافة من 20،000-30،000 خلية / سم 2 في دمم تستكمل مع 10٪ مصل بقري الجنين (فبس) و 1٪ البنسلين الستربتومايسين.
    5. الثقافة في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  3. توسع غضروفي أحادي الطبقة
    1. حصاد الخلايا متموجة الفرعية باستخدام 0.25٪ التربسين إدتا وإعادة لوحة في كثافة من 6،600 خلية / سم 2 . غير الوسيط مرتين في الأسبوع.
    2. غضروف الثقافة في مونولايرس لمدة تصل إلى ستة الممرات وتقييم في الممرات 1 و 2 و 3 و 4 و 5.

2. الحمض النووي الجيني (غنا) استخراج

  1. جمع الخلايا و ريسوسبيند في 500 ميكرولتر العازلة تحلل (15 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 10 ملي إدتا درجة الحموضة 8.0، 0.5٪ سدز، 200 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز) لكل 10 مليون خلية. ريسوسبيند الخلايا بواسطة بيبتينغ والانقلاب السريع، ومن ثم احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  2. اد بروتيناز K بتركيز 160 ميكروغرام / مل من المحللة الخلية وعكس الخليط بقوة. احتضان 6 ساعات عند 55 درجة مئوية.
  3. إضافة حجم واحد من تريس الرقم الهيدروجيني 7.9 المشبعة الفينول: الكلوروفورم: الكحول الإيزوامل (25: 24: 1) للعينة. دوامة أو يهز العينة باليد تماما لمدة 20 ثانية تقريبا.
  4. الطرد المركزي العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 13،000 × ز. إزالة المرحلة المائية العليا ونقل طبقة إلى أنبوب جديد.
  5. استخراج مع حجم مساو من الكلوروفورم لإزالة الفينول ونقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد.
  6. يعجل الحمض النووي بإضافة 0.1 حجم عينة من 3 M خلات الصوديوم درجة الحموضة 8.0 و 2 مجلدات من الايثانول بنسبة 100٪.
  7. تخزين الأنبوب في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها لترسيب غنا.
  8. الطرد المركزي العينة في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة في 16،000 x ج بيليه غنا.
  9. غسل العينة ثلاث مرات مع الايثانول 70٪، وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 2 دقيقة في 13،000 x ز.
  10. إزالة سوبرناتانر بعناية ثم الهواء الجاف. ريسوسبيند الحمض النووي في 10 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 0.1 ملي إدتا.

3. الحمض النووي ميثيلاتيون التنميط

  1. استخدام مجموعة مثيلة الحمض النووي لأداء رد فعل تحويل ثنائي الكبريت باستخدام ما مجموعه 500 نانوجرام من الحمض النووي الجيني، وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. أزل في 10 ميكرولتر من شطف العازلة (50 نانوغرام / ميكرولتر).
  2. إجراء التنميط الحمض النووي باستخدام مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.

4. نقطة البقعة التحليل

  1. تخلل الحمض النووي معزولة (1 ملغ لكل عينة) في 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم لمدة 10 دقيقة عند 95 درجة مئوية. تحييد الحمض النووي مع 1 M نه 4 أواك على الجليد، ومن ثم تمييع اثنين أضعاف. بقعة 2 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني المخفف المسلسل على غشاء N + .
  2. لطخة الغشاء في 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. منع غير محددة مواقع الأجسام المضادة ملزمة عن طريق تمرغ N + غشاء في 5٪ بسا في تبس-T لمدة 1 ساعة. استخدام طبق بتري 10 سم كرد فعلأيون الغرفة في درجة حرارة الغرفة.
  4. بعد غسل 5 دقائق ثلاث مرات في تبست، احتضان الغشاء مع ماوس 5-ميثيلسيتوسين (5-مك) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (1: 1000) في تبس-T عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  5. غسل الغشاء لمدة 5 دقائق ثلاث مرات في تبس-T، ومن ثم احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية، هرب-مترافق الأغنام المضادة للماوس الجلوبيولين المناعي- G (مفتش) (1: 5،000) في تبس-T لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. غسل الغشاء لمدة 5 دقائق ثلاث مرات في تبس-T.
  7. إضافة الركيزة الانزيم إلى الغشاء واحتضان لمدة 5-10 دقيقة. تصور إشارة الأجسام المضادة الثانوية باستخدام مجموعة التوهج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم زراعة غضروفية في أحادي الطبقة حتى مرور 6 (P6). وأظهرت الخلايا الغضروفية التغيرات المظهرية التقدمية مع الممرات المتعاقبة من ثقافة أحادي الطبقة. كان التشكل غضروفي P0 مستديرة، في حين أصبحت الخلايا مقروص للغاية ومسطحة مع الممرات المتعاقبة تصل إلى P6 ( الشكل 1 ). هذا التغيير مورفولوجيا هو نموذجي لعملية ديفيدفيرنتياتيون غضروفي. وفي الوقت نفسه، أشارت نتائج خريطة الحرارة إلى أن مستوى المثيلة العام للمواقع كبغ زاد مع الثقافة الفرعية لفتر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشوندروسيت ديديفرنتيتياتيون في المختبر يضعف بشدة نتيجة إسي في علاج الغضروف إصلاح عيب 11 ، 12 . لتحسين نتيجة إسي، فمن الأهمية بمكان لتجنب استخدام غضروفية ديديفرنتياتد 13 . وقد اقترحت الدراسات أن مستوى الحمض النووي العام يرتبط مع مدى ديفيدفيرنتياتيون غضروفية 4 ، 6 . وبالتالي، لا بد من إنشاء طريقة موثوقة وسريعة للكشف عن حالة مثيلة الحم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل المنح التالية: مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (رقم 81572198؛ رقم 81260161؛ رقم 81000460)؛ مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ، الصين (رقم 2015A030313772)؛ الصين مؤسسة العلوم ما بعد الدكتوراه بتمويل المشروع (رقم 2013M530385)؛ مؤسسة البحوث الطبية بمقاطعة قوانغدونغ، الصين (رقم A2016314)؛ شنتشن للعلوم والتكنولوجيا المشاريع (رقم JCYJ20160301111338144؛ رقم JSGG20151030140325149؛ رقم JSGG20140519105550503؛ رقم JJYZ20130412153906739؛ رقم JCYJ20140414170821160؛ رقم JCYJ20140414170821200).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Recodes
DMEMGibco Inc.11965 – 092دافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)HyClone Inc.SH30256.01BD-PBS ، خالية من Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup>
FBSGibco Inc.10099-141
0.25٪ التربسين / EDTAGibco Inc.25200-056
1٪ بنسلين ستربتومايسينجيبكو15140-122
كلوروفورممالينكرودت4440
كحول الأيزواميلسيجماI-3643
فينولجيبكو BRL15513-039
بروتيناز كجيبكو BRL24568-2
TAE buffer  بيو ويتاكر16-011 فولت
ماء مقطرجيبكو BRL15230-170
1 م تريس هيدروكلوريكبيوشارب إنكBL514A
Tween20Biotop Inc.C58H114O26
BSAProliant Inc.68700
كولاجيناز ، النوع الثانيسيجما ألدريتشC6885
Equipment< / strong>
hemocytometerISOLAB Inc.075.03.001
Falcon 100 مم طبقCorning353003
أنابيب الطرد المركزيTPP AG91050معقم بجاما
Eppendorf5804R
ThermoMixerMIULABMTH-100
حاضنة خلايا ثاني أكسيد الكربونThermo Scientific3111
نظام تحليل التصوير الكيميائيUVITEC CambridgeALLIANCE
< td colspan = "4" > [header] جهاز طرد مركزي عالي السرعة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
  2. Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
  3. Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
  4. Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
  5. Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
  6. Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).
  7. Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
  8. Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
  9. Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
  10. Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
  11. Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
  12. Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
  13. Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
  14. Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
  15. Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
  16. Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68(2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

5 5 mC

مقالات ذات صلة