Method Article

الدراسات هيكل الوظائف في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس عن طريق بوساطة Recombinase-كاسيت تبادل

DOI:

10.3791/55575

⸱

April 27th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, 2Inflammation Research Center, VIB, 3Center for Medical Genetics, Ghent University Hospital, 4Cancer Research Institute Ghent (CRIG), 5Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, 6Helmholtz Center for Infection Research, 7Mammalian Functional Genetics Laboratory, Division of Blood Cancers, Australian Centre for Blood Diseases, Department of Clinical Haematology, Monash University and Alfred Health Alfred Centre

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما تحتوي على البروتينات المجالات المتعددة التي يمكن أن تمارس الوظائف الخلوية المختلفة. الجينات ضرب الرافضة (KO) لا يعتبرون هذا التنوع الوظيفي. هنا، نحن الإبلاغ عن النهج المستندة إلى هيكل الوظائف بوساطة إعادة التركيب الصرف كاسيت (RMCE) في KO الخلايا الجذعية الجنينية التي تسمح للتشريح الجزيئي للمجالات أو أنواع من البروتين وظيفية مختلفة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهندسة الوراثية في الأجنة الماوس أو الخلايا الجذعية الجنينية (mESCs) تسمح لدراسة وظيفة بروتين معين. البروتينات هي حقوله المنتجة من الخلية وتتكون غالبا من المجالات الوظيفية متعددة، والتي يمكن أن تتأثر التعديلات posttranslational. استنزاف البروتين بأكمله في مشروط أو التأسيسي الضربة القاضية من أصل (KO) الفئران لا يأخذ بعين الاعتبار هذا التنوع الوظيفي والتنظيم. وقد ذكرت سابقا خط مسك ونموذج الفأر المشتقة، التي تم إدراج موقع رسو السفن لFLPe الصرف كاسيت بوساطة إعادة التركيب (RMCE) في موضع ROSA26 (R26). هنا، ونحن التقرير على نهج هيكل الوظائف التي تسمح للتشريح الجزيئي للوظائف مختلفة من البروتين متعددة المجالات. وتحقيقا لهذه الغاية، يجب أن عبرت الفئران RMCE متوافق مع الفئران KO، ويجب أن تكون معزولة mESCs KO ثم RMCE متوافق. بعد ذلك، يمكن إدخال لجنة من ثوابت الإنقاذ المفترضة في موضع R26 عبر RMCE targetiنانوغرام. وcDNAs الإنقاذ مرشح يمكن إدراجها بسهولة بين المواقع RMCE للناقلات التي تستهدف باستخدام إعادة التركيب الاستنساخ. بعد ذلك، و transfected mESCs KO مع ناقلات تستهدف في تركيبة مع FLPe التعبير recombinase البلازميد. RMCE إعادة تنشيط الجين النيوميسين-مقاومة المروج أقل في مواقع رسو السفن ROSA26 ويسمح لاختيار الحدث الاستهداف الصحيح. وبهذه الطريقة، يتم الحصول على الكفاءات استهداف عالية قريبة من 100٪، والسماح لإدخال عدة ثوابت الإنقاذ المفترضة بطريقة الإنتاجية شبه عالية. وأخيرا، العديد من بنيات الإنقاذ مدفوعة R26-يمكن اختبار لقدرتها على إنقاذ النمط الظاهري الذي لوحظ في mESCs KO الوالدين. نقدم دراسة بنية وظيفة إثبات صحة المبدأ في كاتينين P120 (p120ctn) mESCs KO باستخدام الأديم الباطن التمايز في الهيئات مضغي (EBS)، وقراءات المظهرية. هذا النهج يمكن تحديد المجالات الهامة، مسارات المصب المفترضة، ونقطة من الأمراض ذات الصلةالطفرات التي تكمن وراء الظواهر KO لبروتين معين.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويقدر أن جينومات الثدييات تحتوي على حوالي 20000 جينات تشفير البروتين. الربط البديل والتعديلات posttranslational يزيد من ذخيرة البروتين. البروتينات لديها بنية وحدات (1) وغالبا ما تحتوي على مجالات التفاعل متعددة، والتي تسمح تجنيدهم في المجمعات بروتين مختلفة، ومشاركتهم في العمليات الخلوية متعددة 2. ومن الأمثلة على ذلك البروتين متعدد الوظائف وتسمى p120ctn. يتم ترميز p120ctn بواسطة الجينات Ctnnd1 ويتكون من مجال أرماديلو تكرار مركزي كبير محاط من قبل N-المحطة ومنطقة C-المحطة. المجال أرماديلو من p120ctn بربط مجال juxtamembrane الحفظ جدا من cadherins الكلاسيكية، التي تشارك في التص....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب على الفئران وفقا للوائح الحيوان المؤسسية والوطنية والأوروبية.

1. عزل mESCs KO RMCE متوافق

  1. تتكاثر الفئران KO متخالف مع الفئران RMCE متوافق، مثل الفئران ROSALUC 10 أو ROSA26-IPSC الفئران 21. وقد حافظت كل من الفئران RMCE متوافق على مختلطة 129 / C57BL6 / الخلفية السويسرية.
    ملاحظة: عبور مع الفئران KO متخالف ينصح للتغلب على الفتك الجنينية في الفئران KO متماثل.
  2. استخدام PCR لتحدي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفت الإجراء لعزل خطوط KO مسك-RMCE متوافقة في الشكل 2. مطلوبة اثنين من قطعان متتالية للحصول على الكيسات الأريمية KO-RMCE متوافق. أولا، وعبرت الفئران KO متخالف مع الفئران RMCE متوافق للحصول على-RMCE متوافق، الفئران KO متخالف. ثم يتم استخدام هذه الفئران لالتزاوج في الوقت المناسب مع الفئران KO متخالف أخرى للحصول على 3.5 DPC، RMCE متوافق، الكيسات الأريمية KO متماثل. فرصة الحصول على مثل هذا الجنين هو واحد في ثمانية، كما تنبأ به وراثة من.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدينا طريقة مسك العزلة هو سهل الاستعمال ولا يتطلب مهارات متقدمة أو المعدات، مثل المجهرية من الكيسات الأريمية. وهكذا، وهذه التكنولوجيا يمكن الوصول إلى نسبة كبيرة من المجتمع العلمي. يمكن لأي شخص من ذوي الخبرة الأساسية ثقافة الخلية نشر الامتداد ICM وإنشاء خطوط mESCs. ومع ذلك، فإن التنظيف والتعامل مع الكيسات الأريمية يتطلب بعض الممارسة. يتم استخدام ماصة الفم لنقل الكيسات الأريمية ويتكون من micropipette، حامل micropipette، وأنابيب، والناطقة باسم الشافطة 28. بال .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر Jinke وD'هونت، فريدريك فان Rockeghem، ناتالي Farla، كيلي ليمير، وRIET دي Rycke حصول على الدعم الفني الممتاز. كما نشكر EEF Parthoens، Evelien فان HAMME، وأماندا جونكالفيس من مرفق Bioimaging الأساسية لمركز أبحاث التهاب للحصول على مساعدة الخبراء التابعة لها. ونحن نعترف أعضاء مجموعتنا البحثية لإجراء مناقشات قيمة. وأيد هذا العمل من قبل سياسة البلجيكي العلوم (Belspo بين الجامعات الجذب البولنديين - جائزة IAP VII-07 DevRepair، https://devrepair.be)، من قبل مؤسسة الملكة إليزابيث الطبي، بلجيكا (GSKE 2008-2010، HTTP: // شبكة الاتصالات العالمية .fmre-gske.be)، ومن قبل تطبيقات البحوث المنسقة (GOA 01G01908) من جامعة غنت، بلجيكا (htt....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
فئران ROSALUCالمصنوعة في المنزلالمنوية المجمدة متوفرة عند الطلب
الفئران R26-iPSCالمصنوعة في المنزلالمنوية المجمدة المتاحة عند الطلب
مسبار السفينةأدوات العلوم الدقيقة10160-13للتحقق من وجود سدادات جماع
M2 متوسطةSigma-AldrichM7167تجعل aliquots وتخزينها في -20 درجة ؛ C
ملقط ناعم (Dumont # 5 ملقط الطالب القياسي)أدوات العلومالدقيقة 11251-10رش مع 70٪ EtOH قبل الاستخدام (لا تستخدم الأوتوكلاف)
23 G إبرFine-ject8697
1 مل محاقنناعمة6680
60 مم لوحات بكتيرية (للتنظيف)  GosselinBB60-01
ماصة الفمالمصنوعة في المنزلانظر المناقشة
الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs ، TgN (DR4) 1 سلالة Jae)ATTCSCRC-1045
TgN (DR4) 1 Jae miceThe Jackson Laboratory3208
Mitomycin C & nbsp ؛Sigma-AldrichM0503
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون كالسيوم أو مغنيسيومGibco14190-094
Tg (DR4) 1Jae / J الفئرانJAX3208التي تحتوي على أربعة جينات قابلة للاختيار من قبل الأدوية و DR4 MEFS يمنح مقاومة للنيومايسين والبورومايسين والهيجروميسين و 6-ثيوغوانين
0.1٪ جيلاتينسيجما ألدريتشG1393قم بإذابة 0.5 جم في 500 مل من الماء المقطر والأوتوكلاف وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
التربسين (0.25٪) جيبكو25200-056
2 & M pluripotinكايمان كيماويات10009557
pRMCE-DV1BCCM / LMBP مجموعة LMBP 08870عام متاح من مجموعة BCCM / LMBP (http://bccm.belspo.be) 
مجموعة pRMCE-DV1BCCM / LMBP المقطوعة  LMBP 08195متاح من مجموعة BCCM / LMBP (http://bccm.belspo.be) 
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA Addgene20733
صدمة حرارية مختصة DH5 & alpha البكتيريا  صنع في المنزل
Gateway pDONR221 vectorThermo Fisher12536-017يحتوي على جين مقاومة الكاناميسين
BP clonase II مزيجThermo Fisher11789-020
LR clonase II mixThermo Fisher11791-020   ؛
مرق لوريا (LB) 
أمبيسيلين 
محلل الحمض النووي للأنظمة الحيوية التطبيقية 3730XLThermo Fisher3730XL
G418Thermo Fisher11811-023
Lipofectamine 2000 كاشف التعداءThermo Fisher11668027
Lipofectamine LTX كاشف التعداءThermo Fisher15338100
كاشفتعداء EffecteneQiagen301425
GATEWAY pENTR 1A vectorThermo FisherA10462متوافق مع إعادة التركيب ناقلات
الفأر أحادي النسيلة مضاد للجسم المضاد p120ctnمختبرات نقل BD610134
الفأر أحادي النسيلة المضاد للأجسام المضادةBD مختبرات نقل التنبيغ610181
< قوية > معدات عامة < / قوية>
تشريح معقمةمقص وملقط ناعم لتشريح الرحم
الماصات المعقمة: 5 مل و 10 مل و 25 مل
طرد مركزي مخروطية 15 مل و 50 مل ألواح
ثقافة 96 بئر قاع على شكل حرف V وقاع مسطح)   ؛
أطباق الاستزراع: 24 بئرا و 12 بئرا و 6 آبار ماصات
متعددة القنوات (إلى ماصة 30 و 50 و 100 و 200 مو ؛ L) 
خزانات معقمة متعددة القنوات الوصول
إلى تدفق
الوصول إلى حاضنة عند 37 درجة ؛ C مع 5٪ CO2
الوصول إلى المجهر
الوصول إلى جهاز
الطاولة الوصول إلى مجهر ستيريو مع الضوء المنقول 
<قوي>ثقافة وسائل الإعلام
<قوي>MEF متوسطمخزنة في 4 درجات ؛ C; دافئ لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة ؛ C قبل استخدام
Dulbecco s النسر المعدل s متوسط (DMEM)Gibco41965-062
10٪ مصل بقري الجنين (FBS)سيجما ألدريتشF-7524
L-جلوتامين (2 ملليمتر)جيبكو25030-024   ؛
بيروفات الصوديوم  (0.4 مل)جيبكو11360-039 
البنسلين (100 U / mL)Gibco15140-122   ؛
الستربتومايسين (100 & ميكرو; g / mL)Gibco15140-122   ؛
<قوي> المستندة إلى SR mESC متوسطة< / em>< / strong>مخزنة في 4 درجات ؛ C; دافئ لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام
DMEM / F12Gibco31330-038مختلطة بنسبة 1: 1
٪ استبدال المصل بالضربة القاضية (SR)Gibco10828 &ndash ؛ 028
L-الجلوتامين (2 مل)Gibco25030-024   ؛
0.1 ملي مولار من الأحماض الأمينية غير الأساسية Gibco11140-050
البنسلين (100 U / mL)Gibco15140-122   ؛
الستربتومايسين (100 & ميكرو; g / mL)Gibco15140-122   ؛
β-mercaptoethanol (0.1 mM) سيجما ألدريتشم 3148  
2,000 وحدة / مل ماوس مؤتلف LIF  ؛(مرفق خدمة البروتين IRC / VIB)
<قوي >< م > FBS القائم على وسيط mESC (على غرار وسيط mESC المستند إلى SR) < / em >< / strong >المخزن في 4 درجة ؛ C; دافئ لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة ؛ ج قبل الاستخدام
Knockout DMEMGibco10829-018 
15٪ FBSHycloneSH30070.03E
Differention Medium< / em>< / strong>المخزنة في 4 درجات ؛ C; دافئ لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام
Modified Dulbecco's Medium (IMDM) من IscoveGibco21980-032 
15٪ FBSHycloneSH30070.03E
5٪ CD Hybridoma متوسط (1x) سائل    جيبكو11279-023 
2 ملي مولار L-الجلوتامينجيبكو25030-024 
0.4 ملي مولار 1-ثيوجلسرينسيجما ألدريتشM-6145
50 مو ؛ جم / مل حمض الأسكوربيكسيجما ألدريتشA-4544   ؛
البنسلين (100 U / mL)Gibco15140-122   ؛
الستربتومايسين (100 & ميكرو; g / mL)Gibco15140-122   ؛
<قوي><إم>2i
1 & mu; مثبط إرك PD0325901 أكسون ميدشيمأكسون 1408
3 & مثبط M Gsk3 CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
أدوات أنابيب الهواء الرقائقيالمقلوبطرد مركزي أعلى 15

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gul, I. S., Hulpiau, P., Saeys, Y., van Roy, F. Metazoan evolution of the armadillo repeat superfamily. Cell Mol Life Sci. , (2016).
  2. Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
  3. Pieters, T., van Hengel, J., van Roy, F.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Recombination mediated Cassette ExchangeMouse Embryonic Stem CellsRosa26 Locus TargetingRescue Construct InsertionFLPe Recombinase ExpressionNeomycin Resistance SelectionEndoderm Differentiation Assayp120 Catenin KnockoutEmbryoid Body FormationGenetic Rescue Screening

Related Articles