Method Article

تحليل معلقات خلية معزولة من الأنسجة الصلبة من قبل الطيفي التدفق الخلوي

DOI:

10.3791/55578

⸱

May 5th, 2017

 ,  ,  , 
1Flow Cytometry Core Facility, Center for Translational Research-Technical Core, Institut Pasteur, 2Unit for Lymphopoiesis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, 3Stem-Cell Microenvironments in Repair/Regeneration Team, Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3s), INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, 4ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 5Stem Cells and Regenerative Medicine Team, UMRS 1166, ICAN - Institute of Cardiometabolism And Nutrition, UPMC - Université Pierre et Marie Curie - Paris 6, INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة الطيفية الخلوي، نهجا جديدا في التدفق الخلوي يستخدم الأشكال من أطياف الانبعاث للتمييز fluorochromes. خوارزمية استبدال التعويضات ويمكن علاج لصناعة السيارات في مضان كمعلمة مستقلة. يسمح هذا النهج الجديد لتحليل سليم للخلايا معزولة من الأعضاء الصلبة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التدفق الخلوي قد استخدمت على مدى السنوات ال 40 الماضية لتحديد وتحليل النمط الظاهري للاللمفاوية والخلايا المكونة للدم الأخرى. يقتصر في البداية على تحليل عدد قليل من fluorochromes، وحاليا هناك العشرات من الأصباغ الفلورية مختلفة، وتصل إلى 14-18 الأصباغ المختلفة يمكن الجمع في وقت واحد. ومع ذلك، لا يزال العديد من القيود يضعف القدرات التحليلية. ونظرا لتعدد تحقيقات الفلورسنت، أصبح تحليل البيانات تزداد تعقيدا بسبب حاجة كبيرة، المصفوفات تعويضات متعددة حدودي. وعلاوة على ذلك، أصبحت نماذج الماوس متحولة تحمل البروتينات الفلورية لكشف وتتبع أنواع معينة من الخلايا في الأنسجة المختلفة المتاحة، لذلك مطلوب تحليل (عن طريق التدفق الخلوي) من تعليق خلية لصناعة السيارات الفلورسنت تم الحصول عليها من الأعضاء الصلبة. الطيفي التدفق الخلوي، والذي يميز الأشكال الأطياف الانبعاثات على مجموعة واسعة من موجات مستمرة، يعالج بعض من هذه المشاكل. ويتم تحليل البيانات ثإيث خوارزمية الذي يحل محل المصفوفات التعويض ويعامل صناعة السيارات في مضان كمعلمة مستقلة. وبالتالي، يجب أن يكون الطيفي التدفق الخلوي قادرة على التمييز fluorochromes مع قمم الانبعاثات مماثلة، ويمكن أن توفر تحليل متعدد حدودي دون متطلبات التعويض.

يصف هذا البروتوكول تدفق الطيفي الخلوي التحليل، والسماح لمعلمة 21 (19 تحقيقات الفلورسنت) توصيف وإدارة إشارة لصناعة السيارات الفلورسنت، وتوفير عالية الدقة في كشف سكان القصر. أظهرت النتائج المعروضة هنا أن تدفق الطيفي يعرض الخلوي المزايا في تحليل للسكان الخلية من الأنسجة يصعب تميز في التدفق التقليدي الخلوي، مثل القلب والأمعاء. الطيفي التدفق الخلوي وبالتالي يدل على القدرة التحليلية متعددة حدودي من إدارة التدفق التقليدي الخلوي دون الحاجة للحصول على تعويضات عالية الأداء ويمكن لصناعة السيارات في مضان.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في العقود القليلة الماضية، التدفق الخلوي (FCM) أصبحت وسيلة تحليلية على نطاق واسع أساسيا للدراسات خلية phenotyping. كان هناك زيادة كبيرة في الأصباغ الفلورية المتاحة، وخاصة fluorochromes ولع الليزر البنفسجي (405 نانومتر) (على سبيل المثال، البنفسج الرائعة والأصباغ الجديدة-Q نقطة). ومع ذلك، فإن نمو الأصباغ الفلورية المتاحة يزيد من خطر الانبعاثات المتداخلة ويتطلب المصفوفات تعويض كثيفة العمالة. أصبح FCM المستخدمة على نطاق واسع لتحليل تعليق خلية من الأنسجة الصلبة، ولكن وجود خلايا لصناعة السيارات الفلورسنت يحد من التمييز ضد السكان المسمى على وجه التحديد.

ويقا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع التجارب وفقا لمعهد باستور ميثاق أخلاقيات والمبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي وتمت الموافقة من قبل وزارة الزراعة الفرنسية.

1. خلية التحضير تعليق من أجهزة الماوس الكبار

  1. عزل splenocytes
    1. الموت ببطء الفئران الكبار خلع عنق الرحم. إجراء شق في خط الوسط البطن وفتح الجلد مع مقص. حصاد الطحال بالملقط.
    2. سحق الطحال بين....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

21-المعلمة الطيفية فم لوحة لتحليل سبلينوسيتس

ويبين الشكل 1 النتائج التي تم الحصول عليها مع لوحة 19-الفلورسنت الأجسام المضادة المطبقة على الخلايا الطحال تضم الأجسام المضادة المختلفة التعرف على مجموعات فرعية من T، B، نك، شجيري، والخلايا النخاعية، في حين CD45 تسميات جميع الخلايا النوى المكونة للدم. كما تتضمن اللوحة أيضا صبغية الجدوى (بي).......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويستند FCM التقليدية للكشف عن الفوتونات المنبعثة بعد إثارة تحقيقات الفلورسنت. انبعاث مضان من تألقي واحدة في الكشف عن جهاز كشف لقياس إشارة من تألقي آخر يدفع التداخل المادي. هذا امتداد بين أطياف الانبعاث يحتاج إلى تصحيحها عن طريق التعويضات.

FCM الطيفي ومعالجة البيانات بواسطة خوارزمية unmixing إزالة التفاف يسمح لمجموعة من fluorochromes مع قمم الانبعاثات وثيقة دون تعويض إضافي، بشرط أن الأشكال الطيفية المختلفة. الخوار.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نعترف المساهمات التقنية والنظرية في الخلوي الطيفي للK فوتامورا، الذي أيضا مراجعة نقدية للمخطوطة. ونحن أيضا مدينون لC. آيت منصور، P.-H. Commere، A. بانديرا، وP. بيريرا لقراءة نقدية للمخطوطة وللحصول على المشورة التقنية التي لا نهاية لها والدعم. كما نشكر P. بيريرا لهبة المضادة Vγ7-APC وVδ4-البيوتين الأجسام المضادة المسمى. نحن يعترفون والمركز Enseignements من معهد باستور للترحيب ودعم الخدمات اللوجستية التصوير. وأيد هذا العمل من قبل معهد باستور، المعهد الوطني للسانتيه آخرون للبحوث ميديكال (INSERM)؛ مؤسسة العلوم وباستور بورصة رو (SS) الوطني السويسري. فونداساو الفقرة على عصام Ciência بحوث والتكنولوجيا - SFRH / BD / 74218/2010 (MV....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الفئرانJanvier LabsCD45.2مصدر الخلايا
الإيثانول 70٪VWR83801.36التعقيم
DPBS (Ca2 + < / sup> ، Mg 2 + < / sup>)GIBCO ThermoFisher14040-174مجموعة الأجنة
محلول الملح المتوازن هانكس (+ Ca 2 + < / sup> + Mg 2 + < / sup>) (HBSS +/+)GIBCO Life التفكك والهضم والتلوين14025092
محلول الملح المتوازن هانكس (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-)GIBCO Life ThermoFisher14175095حلول التفكك والهضم والتلوين
مصل ربلة الساق الجنينية (FCS)EUROBIOCVFSVF00-0Uمحاليل التفكك والهضم والتلوين
كولاجينازSigmaC2139محلول إنزيمي
90 × 15 مم ، أطباق بتري لزراعة الأنسجة البلاستيكية
.		TPPT93100مجموعة الأجنة والقلوب
35 × 15 مم ،
أطباق بتري لزراعة الأنسجة البلاستيكية.		TPPT9340مجموعة القلوب
مقص قزحية دقيقةأدوات العلوم الدقيقة14090-09أدوات التشريح
الملقط الإجمالي (ملقط نمط ضيق ، منحني 12 سم)أدوات العلوم الدقيقة11003-12أدوات التشريح
ملقط دقيق (ملقط دومون رقم 7)أدوات العلوم الدقيقة11272-30أدوات التشريح
مشرط  VWR21909-668أدوات التشريح
LEICA MZ6 مجهرLEICAMZ6 10445111العينات ؛ العين W-Pl10x / 23
مصدر المصباح الباردSCHOTT VWRKL1500 أخذ العيناتالمدمجة ؛
ألياف عنق أوزة مكيفة
أنابيب FACSVWR60819-310خلايا الهضم
96 لوحة بئر (قاع دائري) VWR10861-564خلايا تلطيخ
قماش نايلون شبكي معقم ،
قطع 50/50 مم.		SEFAR NITEXSEFAR NITEXترشيح الخلايا
UltrasComp eBeads
الأجسام المضادة المسماةBiolegendرقم كتالوج انظر الجدول أدناهتلطيخ الخلايا
حلول ThermoFisher تشريح أخذ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
  2. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spectral Flow CytometryCell Suspension IsolationSolid Tissue AnalysisAutofluorescence ManagementMulti parameter AnalysisCompensation free DetectionHeart Intestine Cell IsolationPropidium Iodide StainingAntibody Panel StainingFlow Cytometry Gating

Related Articles