يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس الالتقام حويصلة متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف

9.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55862

⸱

سبتمبر 4, 2017

 ,  , 
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2College of Pharmacy, Chung-ang University

في هذه المقالة

ملخص

تم الكشف عن الالتقام حويصلة متشابك الخفيفة الميكروسكوب من فلورين تنصهر مع البروتين حويصلة متشابك والمجهر الإلكتروني لامتصاص حويصلة.

الملخص

خلال الالتقام، يتم استرداد حويصلات متشابك تنصهر في المحطات العصبية، مما يسمح لإعادة التدوير حويصلة ومن ثم الحفاظ على انتقال متشابك أثناء إطلاق العصبية المتكررة. الالتقام البصر في الحالات المرضية ويؤدي إلى نقصان في مهام القوة والدماغ متشابك. هنا، يمكننا وصف الطرق المستخدمة لقياس الالتقام حويصلة متشابك في المشبك هيبوكامبال الثدييات في ثقافة العصبية. نحن يرصدها الالتقام البروتين حويصلة متشابك الصمامات بروتين غشائي حويصلية متشابك، بما في ذلك سينابتوفيسين و VAMP2/سينابتوبريفين، إلى جانب لومينال حويصلية، مع فلورين، حساسة لدرجة الحموضة بروتين فلورية خضراء التي تزيد عن كثافة الأسفار كما يزيد من درجة الحموضة. خلال الرقابة، يزيد الرقم الهيدروجيني التجويف حويصلية، بينما خلال التجويف حويصلية الالتقام الأس الهيدروجيني إعادة المحمضة. وهكذا، يشير إلى زيادة كثافة fluorescence فلورين الانصهار، بينما تشير إلى انخفاض الالتقام البروتين المسمى حويصلة متشابك. بالإضافة إلى استخدام أسلوب التصوير فلورين لتسجيل الالتقام، نحن يرصدها غشاء حويصلية الالتقام بقياسات الميكروسكوب الإلكتروني (م) الفجل البيروكسيديز (HRP) امتصاص حويصلات. وأخيراً، نحن رصد تشكيل الأعصاب الطرفية الغشاء حفر في أوقات مختلفة بعد depolarization المستحثة بالبوتاسيوم عالية. يشير مسار الوقت لتشكيل حفرة الامتصاص والغشاء HRP إلى مسار الوقت الالتقام.

المقدمة

أجهزة الإرسال العصبية المخزنة في حويصلات متشابك وصدر عن الرقابة. غشاء حويصلة متشابك والبروتين ثم استيعابه الالتقام، وإعادة استخدامها في الجولة القادمة للرقابة. أمر مهم للحفاظ على تجمعات حويصلة متشابك الالتقام حويصلات متشابك ويزيل حويصلات بارزة من غشاء البلازما. وقد استخدمت فلورين البروتينات الفلورية الخضراء حساسة لدرجة الحموضة، وهو مروي في الظروف الحمضية وديكوينتشيد في الأس الهيدروجيني المحايدة، لقياس الوقت الالتقام دورات في العيش الخلايا1،،من23. عادة ما ترتبط البروتين فلورين الجانب لومينال حويصلة متشابك البروتينات، مثل سينابتوفيسين أو VAMP2/سينابتوبريفين. في الراحة وهي تطفئ فلورين في التجويف pH 5.5 من حويصلات متشابك. حويصلة الانصهار لغشاء البلازما يكشف التجويف حويصلية للحل خارج الخلية حيث هو الرقم الهيدروجيني ~ 7.3، أدى إلى زيادة في الأسفار فلورين. بعد الرقابة، يتعفن fluorescence المتزايدة، نظراً الالتقام بروتينات حويصلة متشابك تليها التحمض إعادة حويصلة داخل تلك الحويصلات المستردة. على الرغم من أن يعكس الانحلال الالتقام وتحمض إعادة حويصلية، أنه يعكس الالتقام، معظمها لتحميض إعادة أسرع من الالتقام في معظم الأحوال1،4. هو وقت ثابت لإعادة التحميض s 3-4 أو أقل5،6، الذي عادة أسرع من 10 s أو أكثر مطلوب لحويصلة الالتقام4،5. إذا كانت التجارب ضرورية للتمييز بين الالتقام من إعادة التحميض، حمض تجارب التبريد باستخدام الحل (MES) حمض مورفولينيثانيسولفونيك 4 (25 مم) مع الرقم الهيدروجيني 5.5 يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان يتم استرداد البروتينات حويصلة متشابك من غشاء البلازما عن طريق الالتقام1،،من34. وبالتالي، زيادة كثافة fluorescence فلورين يعكس توازناً أكسو-والالتقام، ويعكس الانخفاض بعد تحفيز الأعصاب على وجه التحديد الالتقام.

يمكن استخدام التصوير فلورين ليس فقط لقياس الدورة الزمنية الالتقام، ولكن أيضا حجم حويصلة متشابك برك7،8، واحتمال الإفراج عن مقولة وعفوية الإفراج عن9. العديد من العوامل والبروتينات المشاركة في تنظيم الالتقام، مثل الكالسيوم وجبهة الخلاص الوطني-مرفق قابل للذوبان بروتين مستقبلات (الفخ) البروتينات، factor(BDNF) نيوروتروفيك المستمدة من الدماغ وكالسينيورين وقد حددت استخدام التصوير فلورين1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16-وعلاوة على ذلك، يمكن اكتشاف الإفراج عن العصبي في الخلايا العصبية الأولية فقط لا بل في خلايا neuroblastoma مع تيرفم17. مؤخرا، تم وضع المتغيرات فلورين، دسريد، مورانج وفتوماتو لرصد تسجيلات المتزامن لعوامل متعددة في18،المشبك واحد19. على سبيل المثال، تنصهر مع سينابتوفيسين فتوماتو ويستخدم مع مؤشر كالسيوم مشفرة جينياً (GCaMP5K) لمراقبة الانصهار حويصلة presynaptic و Ca2 + تدفق في حجرة بوستسينابتيك20. ولذلك، فلورين يعلق على البروتينات متشابك يوفر وسيلة مفيدة لتحليل العلاقة بين الالتقام والرقابة.

أم هو أسلوب آخر استخداماً في دراسة الالتقام، سبب عالية الدقة المكانية التي تظهر التغييرات ultrastructural أثناء الالتقام. اثنين من مجالات عامة هي القدرة على تصور التغييرات المرضية داخل الخلايا العصبية21 وتعقب حويصلة البروتينات22. على وجه الخصوص، مراقبة امتصاص حويصلة متشابك، انحناء غشاء المغلفة كلاثرين في منطقة بيرياكتيفي، وهياكل اندوسومال ممكن مع م3،،من2324،25 26، ،،من2728. بينما م ينطوي على التحف المحتملة، مثل التشوهات الناجمة عن مثبت، التي قد تؤثر على الالتقام، وتحليل بيانات العمالة المكثفة، أن القرار يوفر فرصة جذابة لتصور البنية الخلوية. يمكن التغلب على المشاكل المحتملة مثبت والقيد في الأزمنة م بالضغط العالي تجميد، وتوفير وسيلة سريعة وغير كيميائية لاستقرار الهياكل الدقيقة الحالية أثناء الالتقام27.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: البروتوكول التالي يصف أساليب التصوير فلورين وم الأساليب المستخدمة في استزراع الخلايا العصبية هيبوكامبال. فلورين شاشات حويصلة متشابك بروتين امتصاص في الخلايا الحية ويكشف م الإقبال على حويصلة متشابك و التغييرات ultrastructural.

رعاية الحيوان والإجراء المعاهد الوطنية للصحة للمبادئ التوجيهية ووافقت عليها لجنة الاستخدام والمعاهد الوطنية للصحة الحيوانية العناية.

1-فلورين التصوير

  1. ثقافة العصبية هيبوكامبال
    1. تحضير الحصين المخزن المؤقت (خضاب الدم) عن طريق الجمع بين NaHCO 3 4 و 5 ملم هيبيس وضبط على درجة الحموضة 7.3 مع 5 م هيدروكسيد الصوديوم. جعل المتوسط الثقافة بخلط نيوروباسال المتوسط، 2% B27، 0.5 مم ستربتوميسين البنسلين لام الجلوتامين و 1%. بالإضافة إلى ذلك، إعداد خليط من المخزن المؤقت غبطة مع 20% "مصل بقرى الجنين" (HB/20% FBS).
      ملاحظة: يستند هذا البروتوكول تثقيف أرى, et al. 29 ووو , et al. 24
    2. قطع رأس الجراء الماوس بين يوم بعد الولادة 0 إلى 2 في اليوم في المتوسط الثقافة، واستخراج المخ إلى 4 درجة مئوية HB/20% FBS. إزالة الدماغ والمهاد لفضح هيبوكامبي. تشريح خارج هيبوكامبي، بعد كشف أنه بإزالة الدماغ والمهاد، ونقل إلى الطازجة 4 درجة مئوية HB/20% FBS-
      ملاحظة: عادة ما يكون العائد حوالي 4 × 10 5 خلايا/مل ألجرو واحد (اثنين هيبوكامبي). نظيفة من الأغشية المنضمة باستخدام الملقط أو المقص، ثم نقل إلى الطازجة 4 درجة مئوية HB/20% FBS. إلغاء المغزلي المسنن، وعزل في سوبيكولوم بقطع بالمقص، ثم نقل إلى الطازجة 4 درجة مئوية HB/20% FBS-
    3. تقسيم كل الحصين، بقطع من البداية إلى النهاية، إلى حوالي 10 شرائح وتحويلها إلى أنبوب 15 مل مخروطية البوليبروبيلين.
    4. بعد السماح للأنسجة لتسوية، يغسل مع 10 مل من HB/20% FBS، ومن ثم يغسل ثلاث مرات مع 10 مل غبطة.
    5. إعداد الحل الهضم من 137 كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 7 ملم Na2HPO 4، و 25 ملم هيبيس، وضبط للرقم الهيدروجيني 7.2 مع 5 م هيدروكسيد الصوديوم. إزالة المادة طافية من هيبوكامبي. إضافة 10 مغ التربسين و 1 ملغ من الدناز إلى 2 مل من محلول الهضم، وتصفية من خلال غشاء عقيمة 0.22 ميكرومتر مباشرة على بيليه عينة-
    6. احتضان هيبوكامبي لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية، ثم يغسل مرتين مع 10 مل من HB/20% FBS، ويغسل مرة واحدة مع 10 مل غبطة.
    7. تنأى بالخلايا بملغ 6 مجسو 4 ∙ 7 ح 2 س و 1 ملغ من الدناز 2 مل غبطة وتصفية العقيمة على هيبوكامبي بيليه من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر عقيمة. بلطف ننأى بالخلايا بعناية تريتوراتينج، مع الحرص على تجنب إدخال فقاعات الهواء. السماح للجسيمات الأنسجة تسوية لمدة 2 دقيقة، وبعد ذلك ببطء نقل المادة طافية إلى أنبوب آخر.
    8. إضافة 3 مل HB/20% FBS إلى تعليق خلية، وأجهزة الطرد المركزي أو 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و 1,000 لفة في الدقيقة. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند في مستنبت.
      9. الخلايا
    9. 60,000 لوحة علقت في 150 ميليلتر الثقافة المتوسطة في ساترة قطرها 25 ملم بولي-د-يسين المغلفة، دون انسكاب قبالة ساترة. إضافة 2 مل من قبل حرارة الثقافة المتوسطة ح 2 بعد الطلاء. تتم المحافظة على كوفيرسليبس في لوحات تثقيف 6-جيدا أو أطباق بتري معقمة.
    10. المحافظة على الخلايا عند 37 درجة مئوية في نسبة 5% CO 2 هوميديفيد حاضنة في الثقافة المتوسطة لمدة 14-21 يوما قبل التسجيل. وخلال نمو الثقافة، تغيير النصف الأعلى من المتوسط مرتين في أسبوع-
  2. تعداء
    1. 6-7 أيام بعد الطلاء، ترانسفيكت سينابتوفيسين-فلورين 2 X (SpH) أو VAMP2-فلورين في الخلايا العصبية هيبوكامبال. سف، استخدم مروج "الفيروس المضخم للخلايا" (CMV)، إدراج ناقل pcDNA3 30. بالنسبة VAMP2-فلورين، استخدم مروج CMV إدراجها ناقل pCI 31-
      2. ترانسفيكت
    2. أما ناقل الناقل المادة الدهنية إلى خلايا الهدف، باستخدام 1 ميكروغرام من بلازميد. استخدام الثقافة المتوسطة من البروتوكول خطوة 1.1.1، الذي يفتقر إلى المصل، تعداء. تغيير المتوسطة ح 2 بعد تعداء لتقليل السمية.
      ملاحظة: في حالة منخفضة من التعبير عن SpH في بتونس، زيادة تركيز الحمض النووي إلى 2 ميكروغرام أو وقت الحضانة مع الناقل الدهن، إذا لم تكن الخلايا غير صحية. نموذجياً، 4-10 خلايا (0.006-0.008%) من الخلايا العصبية تم transfected.
  3. الخفيفة الميكروسكوب
    1. تحضير المحلول الملحي العادي يتألف من 119 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم كاكل 2، 2.5 ملم بوكل، حبيس (درجة الحموضة 7.4)، الجلوكوز 30 مم، 2 مم مجكل 2، 25 مم (0.01 مم 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione كنقكس)، و 0.05 ملم حمض DL-2-أمينو-5-فوسفونوفاليريك (AP5). تأخذ ساترة من صفيحة متوسطة الثقافة والمكان في دائرة لتصوير تسمح التحفيز الميدانية، واستخدام زيوت التشحيم وتسرب لتجنب تسرب. تجنب ترك الزجاج الجاف أثناء نقل ساترة من اللوحة إلى الدائرة عن طريق إضافة فورا 750 المحلول الملحي العادي ميليلتر.
      ملاحظة: استخدمت كنقكس و AP5 لحظر نشاط بوستسينابتيك، الذي ينطوي على إمكانات لنشاط متكرر. قبل وضع دائرة على مجهر مقلوب الأسفار، استخدام تنظيف الأنسجة للتأكد من أن الدائرة لا تسرب. تسريب بطيء يسبب تغييرات التركيز أثناء التسجيل بخلط النفط المالحة والغمر العادي، مما يؤدي إلى تغيرات في الانكسار.
    2. التحفيز وتسجيل
      1. الصورة في مجهر مقلوب ويديفيلد مع 60 X (1.4 الفتحة العددية) النفط غمر عدسة مع مصباح هاليد معدني. تصور فلورين مع عامل تصفية مجموعة لذروة إثارة 480 نانومتر، 490 نانومتر تمرير طويل مرآة، عامل تصفية انبعاث 500-550 نانومتر، ومصراع الوجه يدوي. التقاط الصور كل مرض التصلب العصبي المتعدد 100، مع 2 × 2 binning، باستخدام كاميرا إلكترون تتضاعف تهمة إلى جانب جهاز (امككد)-
        ملاحظة: ينبغي النظر العديد من الميزات لتحقيق الظروف الملائمة لتجنب فوتوبليتشينج، بما في ذلك فترة التقاط الصورة، وتصفية و binning، التي تعتمد على المعدات. في حالة التصوير [كنفوكل]، ينبغي النظر في وقت الليزر السلطة والتعرض لتجنب فوتوبليتشينج. مصممة الإعداد بعد تسجيل على الأقل 3 دقائق بدون حافز، وتم إجراء التسجيل لمالا يقل عن 10 s دون حافز للتحقق من فوتوبليتشينج-
      2. اختيار منطقة بكثافة عالية من بتونس وتيسيرا للتحليل في كل تجربة. تحديد خلايا ترانسفيكتيد بإشارة الفلورية الخضراء، مع التركيز على أنماط التعبير مستديرة أو بيضاوية بوتون والتعبير المستمر بين بتونس-
      3. الالتقام الحث بتنشيط الحقل استخدام 1 نبضة، 20 mA العمل المحتملة (أ فب) المقدمة من نبض مشجعا وتسليمها عن طريق قطب البلاتين ضمن وحدة عزل التحفيز. صورة النشاط الأسفار على مدى التحفيز وأثناء استرداد الخلية.
        ملاحظة: في حالة الخلايا الميتة، التعبير أقوى من بوتونس الحية وأظهرت نمطاً متفاوتاً بين بوتونس-
  4. تحليل الصور
    1. لتحليل كثافة fluorescence في بوتون واحد، تعيين يصل المنطقة للفائدة (ROI) ك 1.5 x 1.5 ميكرومتر مربع؛ حجم بوتون على مسافة حوالي 1.5 ميكرومتر. استخدام آثار قبل التحفيز للتحقق من فوتوبليتشينج وطرح كخلفية.
      2. تغيير
    2. fluorescence تطبيع (ΔF) مع المعادلة: figure-protocol-1
      حيث و ماكس وو 0 تشير إلى الزيادة القصوى بعد التحفيز وخط الأساس الأسفار، على التوالي. قياس معدلات الالتقام كمعدل الاضمحلال خلال الأول s 4-10 بعد نقطة الحد الأقصى من الأسفار فلورين. الحصول على وقت ثابت (τ) من الالتقام باحتواء الانحلال fluorescence فلورين من الزيادة القصوى لخط الأساس مع دالة آسيه مونو-

2. المجهر الإلكتروني

  1. تحضير بولي-د-يسين المغلفة صفيحة 6-جيدا قبل تطبيق 1.5 مل من 0.01 ٪ العقيمة التي تمت تصفيتها بولي-د-يسين الحل لكل بئر ح 1 في درجة حرارة الغرفة، ثم الغسل ثلاث مرات بالماء المعقم. تشريح، والثقافة، والمحافظة على الخلايا العصبية هيبوكامبال كما هو الحال في الخطوات 1.1.1 و 1.1.2 و 1.1.3، على التوالي.
  2. تحضير حلاً تحفيز ك + عالية مع برنامج الصحة الإنجابية ملم 31.5 كلوريد الصوديوم، 2 مم كاكل 2، 90 مم بوكل، 25 مم حبيس (درجة الحموضة 7.4)، الجلوكوز 30 مم، 2 مم مجكل 2 ومم 0.01 كنقكس 0.05 مم AP5 5 ملغ/مل برنامج الصحة الإنجابية، ثم ضبط على درجة الحموضة 7.4 مع م 5 هيدروكسيد الصوديوم.
    1. الحث ثقافة العصبية هيبوكامبال بارتفاع 1.5 مل ك + الحل التحفيز في درجة حرارة الغرفة (يشار إلى ك +) بالإضافة إلى 1.5 مل لكل بئر ل 90 ثانية. في حالة الراحة (المشار إليها كالبحث والتطوير)، تنطبق نفس تركيز 5 ملغ/مل HRP 90 s، ولكن مع المحلول الملحي العادي. للحصول على نموذج الاسترداد، تطبيق الحل التحفيز ك + عالية كما هو الحال مع العينة ك +، ثم سرعة تغسل ويستبدل المحلول الملحي العادي واحتضانها للحد الأدنى 10
  3. وتثبيت وتلطيخ
    1. إعداد 0.1 م غ كاكوديلاتي المخزن المؤقت باستخدام 21.4 غرام/لتر كاكوديلاتي نا على درجة الحموضة 7.4. إصلاح الخلايا مع 4 ٪ glutaraldehyde في 0.1 م غ كاكوديلاتي المخزن المؤقت على الأقل 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. أغسل ثلاث مرات مع 0.1 م نا كاكوديلاتي المخزن المؤقت لمدة 7 دقائق.
    2. الحل ديامينوبينزيديني إعداد (DAB)، تتألف من 0.5 ملغ/مل من الدأب مع 0.3 ٪ ح 2 س 2 في ddH 2 س، وتصفية مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. تطبيق الحل الدأب 1.5 مل لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. يغسل ثلاث مرات مع 0.1 م نا كاكوديلاتي المخزن المؤقت لمدة 7 دقائق.
      تنبيه: الدأب مادة مسرطنة سامة والمشتبه فيهم. الرجاء استخدام قفازات ومعاطف المعمل.
      ملاحظة: وسم مع الدأب يحدث نتيجة للأكسدة، ح 2 س 2، كما حفزت ببرنامج الصحة الإنجابية. تؤدي الزيادات الصغيرة في المكونات إشارة زيادة في العينة. زيادة تركيز HRP يسرع تأثير المحفز. تجمعات كبيرة بما فيه الكفاية من ح 2 س 2 تسمح المنهكة ردود فعل الجانب مع برنامج الصحة الإنجابية، التي تحول دون تأثير وسم 32. في هذا العمل، وتركيزات هذا النظام وضع العلامات اختيرت استناداً إلى البحوث المتاحة حاليا 33 ، 34-
    3. احتضان الخلايا العصبية مع 1.5 مل من 1% أوسو 4 في 0.1 م غ كاكوديلاتي المخزن المؤقت لح 1 في 4 درجات مئوية كمرحلة ما بعد التثبيت. أغسل ثلاث مرات مع 1.5 مل من 0.1 م نا كاكوديلاتي المخزن المؤقت لمدة 7 دقائق.
      تنبيه: نظراً لسمية ومفاعليه أوسو 4، حفظ العينة على الجليد في غطاء كيميائية الأفضل في كثير من الحالات إلى استخدام ثلاجة للاحتضان.
    4. تحضير م 0.1 الصوديوم خلات المخزن المؤقت مع 13.61 غرام/لتر صوديوم اسيتات و 11.43 مل/لتر الجليدية حمض الخليك على درجة الحموضة 5.0. تغسل ثلاث مرات مع 1.5 مل م 0.1 خلات المخزن المؤقت على درجة الحموضة 5.0 لكل 7 دقائق واحتضان مع خلات اليورانيل 1% 1.5 مل م 0.1 خلات المخزن المؤقت على درجة الحموضة 5.0 ح 1 في 4 ° أغسل جيم ثلاث مرات مع 1.5 مل م 0.1 خلات المخزن المؤقت لمدة 7 دقائق.
  4. الإيبوكسي التضمين
    1. يذوي ثقافة العصبية مع يغسل واحد 1.5 مل من الإيثانول 50%، 70%، و 90 في المائة، لمدة 7 دقائق في كل مجال وثم يغسل 3 من الإيثانول 100% 1.5 مل ل 7 دقيقة في غطاء دخان.
    2. ميكس 485 مل/لتر bisphenol-A-(epichlorhydrin) الإيبوكسي الراتنج، 160 مل/لتر دوديسينيل succinic الخل (دسا)، 340 مل/لتر الفينول 2,4,6-تريس (ديميثيلامينوميثيل) الخل (دكتور)، و 15 مل/لتر الميثيل-5-نوربورنيني-2, 3-ديكاربوكسيليك (برنامج إدارة الكوارث-30) لإنشاء في الإيبوكسي راتنج. المزيج جيدا، ثم تخزين تحت الفراغ لإزالة فقاعات الهواء-
      ملاحظة: أنها حاسمة لإزالة فقاعات الهواء في الراتنج، لا سيما تلك التي أصغر من رؤيته بالعين المجردة، نظراً لأنها يمكن أن تسبب تسوس الأسنان في الراتنج خلال تمزيقها.
    3. ارتشاح الراتنج العينة بالاستعاضة عن الإيثانول مع الإيبوكسي 50% في الإيثانول مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر، ثم 70% الإيبوكسي الراتنج في الإيثانول مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
    4. التبديل الإيبوكسي الراتنج الحل مع الراتنج الإيبوكسي 100% واحتضان لمدة 10 دقيقة في 50 درجة مئوية. تنفيذ اثنين التبادلات راتنج الإيبوكسي 100% جديدة مع إينكوباتيونس ح 1 في 50 درجة مئوية. إضافة جديدة 100% الإيبوكسي الراتنج والسماح تتصلب عند 50 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ومن ثم في 60 آند #17 6؛ (ج) لما يزيد على 36 ح تتصلب.
  5. إزالة كل عينة من لوحة موتى، حسنا مع صائغ ' s المنشار. تحديد المناطق ذات الاهتمام، تجمعات كثيفة من الخلايا، باستخدام مجهر ضوء مقلوب، وثم قطع 70 إلى 80 نانومتر كتل لتمزيقها مبضع. جبل منطقة قطع في تشاك مبضع وتحميل مبضع. ضع تشاك في مبضع وجبل سكين الماس مع حافة موازيا لسطح الكتلة. جمع الفروع من 70 إلى 80 نانومتر سمك مباشرة على الشبكات الفردية-
  6. يذوب خلات اليورانيل في المياه لحل 1% بالوزن، ويذوب بشكل منفصل سترات الرصاص في المياه لحل 3% بالوزن. كونتيرستين المقاطع بغمر مع خلات اليورانيل مائي 1% لمدة 15 دقيقة ومن ثم سترات الرصاص مائي 3% لمدة 5 دقائق لتحسين تباين العينات.
  7. تصوير م
    1. دراسة المقاطع مع مجهر إلكترون انتقال وتسجيل الصور مع كاميرا رقمية اتفاقية مكافحة التصحر في تكبير الأولية من 10,000-20، 000 X 3.
  8. الإحصاءات
    1. أداء تي-اختبار لتحديد فوارق كبيرة بمقارنة متوسط والخطأ المعياري للقياس (s.e.m.) بين التحكم والعينات التجريبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

استخدام أسلوب الناقل الدهن، أعرب SpH في هيبوكامبال الخلايا العصبية، مما يسمح لتحديد بوتونس (الشكل 1a). التحفيز الكهربائي للخلايا التي يسببها الرقابة، وإلى زيادة مقابلة في كثافة الأسفار. الزيادة في الأسفار (ΔF) أوقف قبل إنهاء الحافز (الشكل 1b). وأعقب fluorescence زيادة انخفاض بطيء، بسبب الالتقام. وفي حالة VAMP2-فلورين، ينشر VAMP2 على طول إكسون من بوتون بعد التحفيز4. البيانات الخام تستخدم وحدات التعسفي، وقد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا نظهر طريقتين لرصد الالتقام حويصلة متشابك. في الطريقة الأولى، يمكننا رصد فلورين تنصهر مع بروتين حويصلة متشابك في transfected الخلايا العصبية وحفزت كهربائياً في وقت لاحق. ثانيا، قمنا باستخدام التصوير م من الإقبال على برنامج الصحة الإنجابية كما فعل بوكل. نحن استخدام المحفزات المختلفة لسببين. أولاً، الحث على تطبيق البوتاسيوم عالية depolarization جميع الخلايا العصبية في الثقافة. وهذا يسهل دراسة طب الطوارئ، نظراً لأن منهجنا م يمكن أن لا تميز بين الخلايا العصبية غير حفز وتنشيط. ولوحظت أكثر موثوقية التغيرات المورفولوجية الثا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونحن نشكر الدكتور تشو يونغ لينغ لتوفير بنية سينابتوفيسين-pHluorin2x، والدكتور جيمس روثمان هاء لتقديم VAMP2-فلورين. ونشكر الدكتورة سوزان تشنغ وفيرجينيا كروكر NINDS الميكروسكوب الإلكتروني مرفق للدعم التقني والمساعدة. هذا العمل كان يدعمها المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية داخلية برنامج البحوث في الولايات المتحدة الأمريكية، ومنحة من KRIBB مبادرة برنامج البحوث (الكورية الطبية الحيوية عالم برنامج زمالة)، المعهد الكوري لأبحاث العلوم الحيوية والتكنولوجيا الحيوية، وجمهورية كوريا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Lipofectamine LTX مع PlusThermo Fisher15338-100تعداء الحمض النووي البلازميدي بما في ذلك synaptophysin أو VAMP2-pHluorin
الوسط العصبيالعصبي Thermo Fisher21103-049وسط النمو للخلايا العصبية ، الاحماء حتى 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام
B27Thermo Fisher17504-044التدرج للتمايز العصبي
GlutamaxThermo Fisher35050-061التدرج لثقافة الخلايا العصبية
Poly-D-Lysine المغلفةNeuvitroGG-25-pdlالركيزة لنمو الخلايا العصبية وتصوير pHluorin
Trypsin XI من بنكرياز البقرSigmaT1005Neuronal أنسجة الحصين المثقافة الهضم
Deoxyribonuclease I من البنكرياس البقريSigmaD5025الثقافة العصبية - تمنع محفز نبض تعليق الخلايا اللزجة
AM نموذج 2100تطبيق التحفيز الكهربائي
حمام مشقوق مع التحفيز الميدانيWarner InstrumentsRC-21BRFS
عزل تحفيز التحفيز الكهربائيWarner InstrumentsSIU102
زيوت التشحيمDow corning111pHluorin imaging-seal مع غطاء وغرفة تصوير ، وتجنب التسرب من الغرفة
AP5Tocris3693التدرج للمحلول الملحي العادي ، ومضاد مستقبلات NMDA الانتقائي ، ويمنع نشاط ما بعد المشبكي الذي لديه إمكانية للنشاط المتكرر
CNQXTocris190تدرج للمحلول الملحي العادي ، مضاد مستقبلات AMPA / kainate التنافسي ، يمنع نشاط ما بعد المشبكي الذي لديه إمكانية للنشاط المتكرر
IlluminatorNikonC-HGFIمصدر ضوء الهاليد المعدني لكاميرا pHluorin
EMCCDAndoriXon3تصوير pHluorin ، كشف شدة مضان pHluorin
الفحص المجهري المقلوبنيكونTi-Eالتصوير للسينابتوفيسين أو VAMP2 pHluorin الخلايا المنقولة
NIS-Elements ARNikonNIS-Elements برامج أبحاث متقدمةللحصول على التصوير وتحليله
Igor ProWaveMetricsIgor proبرنامج لتحليل التصوير وعرض البيانات
غرفة التصويرWarner InstrumentsRC21BpHluorin ، تطبيق التحفيز الميداني على الخلايا
الحيةبولي إل ليسينسيجماP4832المجهر الإلكتروني ، الركيزة لنمو الخلايا العصبية ، يوضع على صفيحة متعددة الآبار لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ثم يغسل بالماء المعقم 3 مرات
بيروكسيداز الفجل الحار (HRP)سيجماP6782المجهر الإلكتروني ، وضع العلامات على الحويصلات المشبكية الداخلية عن طريق تحفيز DAB في وجود بيروكسيد الهيدروجين ، التركيز النهائي هو 5 مجم / مل في محلول ملحي عادي ، اجعله طازجا قبل الاستخدام
Na cacodylateعلوم المجهر الإلكتروني12300المجهر الإلكتروني ، مخزن مؤقت للمثبتات والغسيل ، التركيز النهائي 0.1 N
3،3 & prime ؛ -Diaminobenzidine (DAB)SigmaD8001المجهر الإلكتروني ، وضع العلامات على الحويصلات المشبكية الداخلية ، الركيزة ل HRP ، التركيز النهائي هو 0.5 مجم / مل في DDW وتصفية ، اجعلها طازجة قبل الاستخدام
محلول بيروكسيد الهيدروجينSigmaH1009الفحص المجهري الإلكتروني ، وضع العلامات على الحويصلات المشبكية الداخلية عن طريق إحداث تفاعل HRP-DAB ، التركيز النهائي هو 0.3٪ في DDW ، اجعله طازجا قبل الاستخدام
الجلوتارالديهايدعلوم المجهر الإلكتروني16365المجهر الإلكتروني ، المثبتات ، التركيز النهائي 4٪ في المخزن المؤقت Na-cacodylate ، اجعله طازجا قبل الاستخدام ، رج جيدا قبل استخدام
TEMJEOL200CXالمجهر الإلكتروني ، تصوير الحويصلات الخلوية والتغيرات في البنية التحتية
CCD الكاميرا الرقميةAMTXR-100المجهر الإلكتروني ، التقاط الصور
الرصاصسيترات لايكا المجهرية16707235المجهر الإلكتروني ، تلطيخ الشبكة
أنظمة تطبيق وحدة تطبيق للتحفيز الكهربائي

المراجع

  1. Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
  2. Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow endocytosis at central synapses. J Neurosci. 30 (35), 11838-11847 (2010).
  3. Wu, X. -S. S., Lee, S. H., et al. Actin Is Crucial for All Kinetically Distinguishable Forms of Endocytosis at Synapses. Neuron. 92 (5), 1020-1035 (2016).
  4. Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
  5. Atluri, P. P., Ryan, T. A. The kinetics of synaptic vesicle reacidification at hippocampal nerve terminals. J Neurosci. 26 (8), 2313-2320 (2006).
  6. Royle, S. J., Granseth, B., Odermatt, B., Derevier, A., Lagnado, L. Imaging phluorin-based probes at hippocampal synapses. Methods Mol Biol. 457, 293-303 (2008).
  7. Moulder, K. L., Mennerick, S. Reluctant vesicles contribute to the total readily releasable pool in glutamatergic hippocampal neurons. J Neurosci. 25 (15), 3842-3850 (2005).
  8. Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptopHluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6131-6136 (2005).
  9. Morris, R. G. Elements of a neurobiological theory of hippocampal function: the role of synaptic plasticity, synaptic tagging and schemas. Eur J Neurosci. 23 (11), 2829-2846 (2006).
  10. Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Calcium accelerates endocytosis of vSNAREs at hippocampal synapses. Nat Neurosci. 4 (2), 129-136 (2001).
  11. Balaji, J., Armbruster, M., Ryan, T. A. Calcium control of endocytic capacity at a CNS synapse. J Neurosci. 28 (26), 6742-6749 (2008).
  12. Ferguson, S. M., Brasnjo, G., et al. A selective activity-dependent requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis. Science. 316 (5824), 570-574 (2007).
  13. Baydyuk, M., Wu, X. S., He, L., Wu, L. G. Brain-derived neurotrophic factor inhibits calcium channel activation, exocytosis, and endocytosis at a central nerve terminal. J Neurosci. 35 (11), 4676-4682 (2015).
  14. Wu, X. S., Zhang, Z., Zhao, W. D., Wang, D., Luo, F., Wu, L. G. Calcineurin is universally involved in vesicle endocytosis at neuronal and nonneuronal secretory cells. Cell Rep. 7 (4), 982-988 (2014).
  15. Zhang, Z., Wang, D., et al. The SNARE proteins SNAP25 and synaptobrevin are involved in endocytosis at hippocampal synapses. J Neurosci. 33 (21), 9169-9175 (2013).
  16. Wu, L. -G. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76 (1), 301-331 (2014).
  17. Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in SH-SY5Y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis. J Vis Exp. (95), e52267(2015).
  18. Shaner, N. C., Lin, M. Z., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
  19. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  20. Leitz, J., Kavalali, E. T. Fast retrieval and autonomous regulation of single spontaneously recycling synaptic vesicles. Elife. 3, e03658(2014).
  21. Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., Sánchez, M. G., Tremblay, M. -È Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J Vis Exp. (112), e54060(2016).
  22. Schikorski, T. Monitoring Synaptic Vesicle Protein Sorting with Enhanced Horseradish Peroxidase in the Electron Microscope. High-Resolution Imaging of Cellular Proteins: Methods and Protocols. , 327-341 (2016).
  23. Kononenko, N. L., Puchkov, D., et al. Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses. Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).
  24. Wu, Y., O'Toole, E. T., et al. A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis. eLife. 2014 (3), e01621(2014).
  25. Heuser, J. E., Reese, T. S. Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 315-344 (1973).
  26. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 499-524 (1973).
  27. Watanabe, S., Rost, B. R., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
  28. Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
  29. Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. A. Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function. Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).
  30. Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging. Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).
  31. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  32. Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. A., García-Cánovas, F. Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent. Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).
  33. Deák, F., Schoch, S., et al. Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis. Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).
  34. Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).
  35. Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
  36. Wienisch, M., Klingauf, J. Vesicular proteins exocytosed and subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical. Nat Neurosci. 9 (8), 1019-1027 (2006).
  37. Fernández-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
  38. Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins. Nat Commun. 6, 8392(2015).
  39. Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin. J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).
  40. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).
  41. Wisse, E., Braet, F., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  42. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
  43. Søndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions. J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تصوير pHluorinالمجهر الإلكترونيامتصاص بيروكسيداز الفجلالحويصلات المغلفة بالكلاثرينتحفيز البوتاسيوم العاليالتضمين في راتنج الإيبوكسيالصبغ بأسيتات اليورانيلتكوين نُقرات الغشاء
قياس الالتقام حويصلة متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.