Method Article

رباعية المناعية من لمبة الشمية لتصور رموز حسية أكسون الجزيئية الحسية

DOI:

10.3791/55893

⸱

June 5th, 2017

 ,  , 
1Laboratory of Chemical Pharmacology, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo, 2Center for Information and Neural Networks, National Institute of Information and Communications Technology, 3PRESTO, Japan Science and Technology Agency (JST)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العصبية الحسية الشمية تعبر عن مجموعة واسعة من جزيئات محوار الفرز لإنشاء الدوائر العصبية المناسبة. يصف هذا البروتوكول طريقة تلطيخ المناعية لتصور التعبيرات كومبيناتوريال من جزيئات الفرز محوار في تيرميني محور عصبي من الخلايا العصبية الحسية الشم.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وغالبا ما يستخدم نظام الشمية الماوس لدراسة آليات تشكيل الدائرة العصبية بسبب هيكل تشريحي بسيط لها. الخلايا العصبية الحسية الشمية (أوسن) هي خلية ثنائية القطب مع دندريت واحد و محور عصبي واحد أونبرانشد. وتعبر أوسن عن جينة واحدة فقط من مستقبلات أولفاكتوري (أور)، أوسنز تعبر عن نوع معين من أور تتلاقى محاورها مع بضع مجموعات من الكبيبات الثابتة في لمبة الشم (أوب). وهناك ميزة ملحوظة من إسقاط أوسن هو أن أورس أعرب لعب الأدوار مفيدة في الإسقاط محور عصبي. أورس تنظم التعبير عن جزيئات محورية الفرز متعددة وتوليد رمز الجزيئي كومبيناتوريال من جزيئات الفرز محوار في تيرميني محور أوسن. وهكذا، لفهم الآليات الجزيئية لآليات التوجيه محور عصبي أور، فمن الأهمية بمكان لتوصيف ملامح التعبير في تيرميني محور أوسن داخل الكبيبة نفسها. والهدف من هذه المقالة هو إدخال أساليب لجمع أكبر عدد ممكن من الكبيبات كما بوسيبله على قسم أوب واحد وأداء إمونوستينينغ باستخدام الأجسام المضادة متعددة. وهذا من شأنه أن يسمح للمقارنة وتحليل أنماط التعبير من جزيئات الفرز محوار دون تلطيخ التباين بين أقسام أوب.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال التنمية، ترتبط الخلايا العصبية على وجه التحديد مع بعضها البعض لتشكيل الدوائر العصبية المناسبة، وهو أمر حاسم لوظيفة الدماغ العادية. منذ الدوائر العصبية الشاذة في الدماغ ويعتقد أن يكون سبب الاضطرابات النفسية مثل التوحد والفصام، فهم آليات تشكيل الدوائر العصبية هي واحدة من التحديات الرئيسية في مجال علم الأعصاب.

في نظام الشمي الماوس، كل الخلايا العصبية الحسية الشم (أوسن) في ظهارة الشمية (أو) يعبر عن واحد فقط الجينات مستقبلات الشفة (أور) و أوسنز التعبير عن نفس أو تلاقى محاورها لزوج معين من الكبيبات في مواقع نمطية في اللمبة الشمية (أوب) 1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أجريت جميع الإجراءات التجريبية بموافقة لجنة أخلاقيات التجارب الحيوانية في جامعة طوكيو ووفقا للمبادئ التوجيهية لجامعة طوكيو لرعاية واستخدام حيوانات المختبر.

1. إعداد الحلول

  1. إعداد 0.01 M الفوسفات مخزنة المالحة (بس): إضافة قرص بس (0.14 M كلوريد الصوديوم، 0.0027 M بوكل، 0.010 M بو 4 3- ، ودرجة الحموضة 7.4) إلى 1 لتر الماء المقطر ويقلب في رت حتى يتم حله تماما.
  2. إعداد بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) في ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تشكيل خريطة الكبيبي الشمي عن طريق الاستهداف العالمي الأولي والفصل الكبيبي لاحق من المحاور أوسن 1 ، 2 . وينظم الفصل الكبيبي عن طريق التفاعلات المحاور / محاذاة متهورة بوساطة جزيئات الفرز محوار التي يتم تحديد مستويات التعبير عن طريق التعبير عنها أو جزيئات 7 . يتم التعبير عن جزيئات الفرز المحوري المشاركة في الفصل الكبيبي بطريقة فسيفساء مستقلة عن الموقف في أوب

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمكنت المناعية رباعية من أقسام أوب باراساجيتال التصور والتقدير الكمي لمستويات التعبير من ما يصل إلى أربعة جزيئات محوار الفرز في وقت واحد في عدد أكبر من الكبيبات. من خلال تحليل هذه البيانات متعددة المتغيرات مع يكا، يمكن التكهن بخصائص التعبير عن تلك الجزيئات.

لتلطيخ ناجحة، وإعداد عينة الأنسجة أمر بالغ الأهمية. بعض البروتوكولات تشير إلى أن الأنسجة يجب أن تكون ثابتة مع 4٪ بفا ومعالجتها مع 30٪ السكروز ل كريوبروتكتيون........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ميتسوبيشي، ومؤسسة تاكيدا للعلوم، جست بريستو و جسبس كاكينهي رقم المنحة 16H06144.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أقراص محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4TAKARA BIOT9181
حليب خالي الدسمناكالاي31149-75
الماعز المضاد للجسم المضاد ل Sema7AR & D SystemsAF2068
الفئران المضادة للجسم المضاد ل OLPCMerck MilliporeMABT20
الفأر المضاد ل VGLUT2 الأجسام المضادةMerck MilliporeMAB5504
الماعز المضاد للجسم المضاد BIG-2R & D SystemsAF2205
gunea pig antibody المضاد ل Kirrel2Operon Biotechnologiesتم إنشاء الأجسام المضادة Anti-Kirrel2 عن طريق تحصين خنازير غينيا بالببتيدات الاصطناعية المترافقة KLH (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
حمار مضاد للفأر Alexa Fluor 405Abcamab175658
حمار مضاد للماعز Alexa Fluor 488   ؛Jackson ImmunoResearch705-545-003
حمار مضاد لخنزير غينيا Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA21432
حمار مضاد للفئران Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch712-605-153
Paraformaldehyde (PFA)Wako162-16065
MAS نظارات منزلقة مطليةMATSUNAMIMAS-01
ملقطأدوات العلوم الدقيقة11253-27
Vannas الربيع مقصأدوات العلومالدقيقة 15000-00
مقص تشريحأدوات العلوم الدقيقة14090-09
مجهر الفلورسنتKEYENCEBZ-X700
DAPI مكعب مرشحKEYENCEOP-87762
GFP مكعب مرشحKEYENCEOP-87763
مكعب مرشح TRITCKEYENCEOP-87764
مكعب مرشح Cy5KEYENCEOP-87766
ورق ترشيحADVANTEC00011185
OCT مركبSakura FinetekM71484

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain? Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
  2. Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
    3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Olfactory BulbOlfactory Sensory NeuronsImmunostaining MethodAxon Sorting MoleculesFluorescence MicroscopyImage J AnalysisPrimary AntibodiesSecondary AntibodiesGlomerular StructureVGLUT2 Marker

Related Articles