مقالة منهجية

التحقيق فون "ويليبراند عامل الفيزيولوجيا المرضية باستخدام" نموذج دائرة تدفق فون ويليبراند عامل-الصفائح الدموية "تشكيل سلسلة"

DOI:

10.3791/55917

⸱

أغسطس 14, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Department of Medicine, Queen's University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الورقة، ويصف لنا طريقة لتقييم غشائي فون ويليبراند الإفراج عن عامل والصفائح الدموية اللاحقة التقاط إجهاد القص السوائل في الاستجابة للمحفزات التحريضية باستخدام نظام دائرة تدفق في المختبر .

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عامل فون ويليبراند (فوف) عامل تخثر بروتين سكري مولتيميريك الذي يتوسط التصاق الصفائح الدموية وتجميعها في مواقع الضرر بطانية وأن يحمل العامل الثامن في الدورة الدموية. فوف يتم تصنيعه من قبل خلايا بطانية وهو أما تطلق مؤثرا في البلازما أو المخزنة في العضيات المتخصصة، ودعا الهيئات بلادي ويبيل (WPBs)، للإفراج على الطلب استجابة للتحدي مرقئ. سرعة يمكن أن يستحث المحفزات بروكواجولانت و proinflammatory WPB الرقابة وإطلاق سراح فوف. غالبية VWF صدر عن خلايا بطانية يدور في البلازما؛ ومع ذلك، يرتكز نسبة فوف إلى سطح الخلية البطانية. يمكن ربط VWF غشائي مرتبط تحت ظروف فسيولوجية القص، الصفائح الدموية، تشكيل سلسلة VWF-الصفائح الدموية التي قد تمثل nidus تكوين خثرة. يمكن استخدام نظام دائرة تدفق بصريا مراقبة الإفراج عن فوف من خلايا بطانية والصفائح الدموية اللاحقة القبض بطريقة استنساخه وذا صلة الفسيولوجيا المرضية لتكوين خثرة VWF بوساطة. باستخدام هذه المنهجية، خلايا بطانية تربى في حجرة تدفق وتحفز في وقت لاحق مع secretagogues للحث على الرقابة WPB. ثم هي perfused الصفائح غسلها عبر البطانة المنشط. الصفائح الدموية يتم تفعيلها، وبعد ذلك ربط سلاسل VWF ممدود في اتجاه تدفق السائل. استخدام histones خارج الخلية كحافز بروكواجولانت و proinflammatory، لاحظنا زيادة تشكيل سلسلة VWF-الصفائح الدموية في خلايا بطانية تعامل هيستون مقارنة بخلايا بطانية غير المعالجة. ويصف هذا البروتوكول إجراء تقييم كمي والبصرية في الوقت الحقيقي لتنشيط التفاعلات VWF-الصفائح الدموية في نماذج تجلط الدم والارقاء.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تجلط الدم هو سبب الرئيسي للوفيات في جميع أنحاء العالم1 ويمكن أن تتطور في الاستجابة توديسريجولاتيد الصفائح الدموية التنشيط وثرومبين جيل في الشرايين فينساند على حد سواء. مستويات البلازما VWF منظم رئيسي تخثر الدم، ومستويات منخفضة حيث (< 50%) يؤدي إلى اضطراب النزيف المعروف باسم فون ويليبراند المرض (VWD)2 ومستويات عالية (> 150%) ترتبط بزيادة خطر وريدي3 و تجلط الدم الشرياني4 .

فوف بروتين سكري مولتيميريك توليفها من قبل ميجاكاريوسيتيس وخلايا بطانية وتخزينها في الصفيحات α-حبيبات و WPBs، على التوالي. عند التحدي مرقئ، يمكن إصدار VWF من WPBs بطانية إلى حبل الصفائح الدموية المتداولة لتنشيط خلايا بطانية5 أو الكولاجين المكشوفة في جدار السفينة6. لقد ثبت رسو من فوف إلى خلايا بطانية أن توسط سيليكتين ف7 وانتغرين αvβ38. إطلاق سراح اللاحقة من مخازن α-الحبيبية الصفائح الدموية يمكن زيادة تركيزات VWF المترجمة استقرار التفاعلات الصفائح الدموية-الصفائح الدموية للصفائح الدموية تكوين التوصيل، سقالة اللازمة لنشر تتالي التخثر وفيبرينوجين الترسب. وينظم نشاط الصفائح الدموية-ربط VWF هيكلها مولتيميريك، مع مولتيميرس الوزن الجزيئي العالية التي تمتلك أكبر نشاط مرقئ9،10. في الدورة الدموية، فوف أيضا بمثابة ناقل لعامل تخثر الدم الثامن.

إجهاد القص السائل منظم أساسي لفسيولوجيا VWF. نظراً لغياب إجهاد القص، يوجد VWF في شكل كروي، إخفاء المجالات الملزمة للصفيحات بروتين سكري Ib التصاق11. عند وجود إجهاد القص، يتعرض موقع الانقسام ميتالوبروتيسي، ديسينتيجرين وميتالوبروتيسي مع ثرومبوسبوندين عزر (ADAMTS13)،. ADAMTS13 كليفس سلاسل VWF عارية وزينت الصفائح الدموية لتنظيم حجم مولتيمير، مما يقلل من نشاط مرقئ به12.

فوف بروتين المرحلة الحادة، ومحفزات عديدة، بما في ذلك نقص13وإصابة14السيتوكينات proinflammatory، قد ثبت للتوسط من أجل الإفراج عن فوف من خلايا بطانية. مماثلة إلى أخرى التحريضية وكلاء، histones خارج الخلية قد أظهرت أيضا للحث على إطلاق سراح VWF النظمية في الفئران15،16 وتنشيط الصفائح الدموية في المختبر17،18، 19. هذا تبين أن يتوقف على نوع فرعي هستون، كالاختلافات في يسين ومحتوى ارجينين قد تؤثر على وظيفة15. لدينا أهداف الدراسة إلى إنشاء دائرة لتدفق نموذج للتحقيق في تأثير يسين-الغنية (هونج كونج) والمخططات هستون (HR) الغنية ارجينين و secretagogues على إطلاق سراح VWF بطانية والصفائح الدموية في الوقت الحقيقي التقاط، الأحداث المبكرة المحتملة في تجلط الدم الناجم عن التهاب.

ويجمل هذه المنهجية الدائرة تدفق في فيفو التفاعلات بين الكولاجين سوبيندوثيليال وخلايا بطانية، فوف، والصفائح الدموية في المختبر نظام البصرية واستنساخه، وقابلة للقياس. أنها تسمح للتقييم في الوقت الحقيقي لجميع جوانب المسار الذي ينظم التفاعلات VWF-الصفائح الدموية، بما في ذلك إفراز WPB وتنشيط الصفائح الدموية وبروتيوليسيس فوف. استخدمت الدراسات VWF تحت ظروف الإجهاد القص الخاضعة للرقابة لتقييم VWD الطفرات التي تضر بالإفراج عن فوف و وظيفة الصفائح الدموية-ملزمة20، WPB فسيولوجيا21، والانقسام فوف ADAMTS135. ونحن نستخدم هذه المنهجية للتحديد الكمي لتشكيل سلسلة VWF-الصفائح الدموية نتيجة حافز تحريضية: histones خارج الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووافقت هذه الدراسات جامعة في كندا "بحوث أخلاقيات المجلس للملكة".

1. تنشيط الخلية بطانية

  1. الكولاجين-معطف طبق استنبات الأنسجة 6-جيدا.
    1. 24 ساعة مقدما، معطف طبق استنبات الأنسجة 6-جيدا في 37 درجة مئوية مع 1 مل الكولاجين المخزن المؤقت (50 ميكروغرام/مل الفئران الذيل الكولاجين النوع 1 مع حمض الخليك الجليدية 0.02 M).
    2. غسل الآبار مرتين مع 2 مل من موازنة الملح الحل (حبس هانك).
      ملاحظة: لوحات يمكن مغلفة برقائق القصدير والمخزنة في حقيبة بلاستيك محكم الإغلاق عند 4 درجة مئوية.
  2. بذور الخلايا البطانية في كثافة الخلايا 1 × 106 كل بئر في 2 مل من النمو المتوسطة تحتوي على 10% الجنيني البقري المصل (FBS). احتضان الخلايا عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية (5% CO2).
    ملاحظة: هنا، ثمرة غشائي خلايا الدم (بوكس) بين 5 و 15 الممرات واستخدمت. بوكس بمعزل عن المتطوعين صحية مع تسلسل VWF wildtype باستخدام أسلوب المشار إليه في ستارك et al. 22 بطريقة مشابهة لأحد المبينة سابقا بجوف23.
  3. إزالة المتوسط بعد 24 ساعة وتغسل الخلايا مع حبس.
  4. أضف 1 مل من المصل خالية المتوسطة (المتوسطة النمو الأساسية الحد الأدنى دون FBS) تحتوي على phorbol 12-myristate 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية؛ 100 nM)، غير المجزأ مع الاسبيرين هستون (آه)، وهونج كونج أو HR (جميعها في 25 ميكروغرام/مل) إلى الخلايا ح 2 في 37 درجة مئوية (5% CO2).
    ملاحظة: هذا التركز من هستون يستند إلى تقارير سيتوتوكسيسيتي في المختبر السابقة قبل شو et al. 24 وابرامز وآخرون. 25 التي تستخدم 50 ميكروغرام/مل.
  5. جمع المتوسطة بعد ح 2 وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى التحليل.

2-VWF القياس الكمي بمقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA)

  1. معطف صفيحة مع 100 ميليلتر من الطلاء العازلة (10 ملم مائي فوسفات الصوديوم و 145 مم كلوريد الصوديوم، الرقم الهيدروجيني 7.2) التي تحتوي على 10 ميكروغرام/مل VWF مكافحة [بولكلونل] جسم بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  2. أغسل لوحة ثلاث مرات مع 250 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (10 ملم مائي فوسفات الصوديوم وكلوريد الصوديوم 500 مم 0.1% 20 توين، الرقم الهيدروجيني 7.2).
  3. تمييع عينات متوسطة 1:2 و 1:4 مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي واستخدام البلازما المرجع الطبيعي لمنحنى قياسي، بدءاً 01:10 إضعاف.
  4. لوحة 100 ميليلتر من عينات المخفف والمعايير بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  5. أغسل لوحة ثلاث مرات مع 250 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
  6. إضافة 100 ميليلتر من المخفف المضادة-VWF، مترافق HRP الكشف عن الأجسام المضادة (1، 1 ميكروغرام/ميليلتر في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي) اللوحة واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  7. أغسل اللوحة واحتضان لمدة 10 دقيقة مع كاشف هيدروكلوريد (العيادات الخارجية) س-فينيلينيدياميني، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  8. وقف رد فعل مع 100 ميليلتر م 1 ح2حتى4 وقراءة اللوحة في 492 شمال البحر الأبيض المتوسط.

3-المرحلة الصلبة هيستون-VWF ملزم الإنزيم

  1. معطف صفيحة مع histones المخفف في 0.5% الصوديوم deoxycholate 50 مم كربونات العازلة (pH 9.6) إلى 10 ميكروغرام/مل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  2. أغسل لوحة ثلاث مرات مع 250 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 0.1% 20 توين، حضانة لمدة 10 دقائق بين يغسل.
  3. كتلة اللوحة مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 0.1% 20 توين و 1% البقري ألبومين المصل (BSA) ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  4. كرر الخطوة 3، 2.
  5. متسلسل تمييع المستمدة من البلازما البشرية فوف/عامل الثامن معقدة من 200 مو/مل إلى 25 mU/mL في المخزن المؤقت المالحة (كلوريد الصوديوم 500 ملم مائي فوسفات الصوديوم، 10 ملم، و 0.1% 20 توين، الرقم الهيدروجيني 7.2). إضافة 100 ميليلتر للوحة ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
  6. كرر الخطوة 3، 2.
  7. الكشف عن ربط VWF إلى هيستون المعطل تداولها باستخدام 100 ميليلتر من محلول يحتوي على PBS-0.1% 20 توين و 1:1,000 الأرنب VWF مكافحة [بولكلونل] جسم مترافق لبرنامج الصحة الإنجابية ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  8. كرر الخطوة 3، 2.
  9. احتضان لوحة مدة 30 دقيقة مع 100 ميليلتر من كاشف العيادات الخارجية والتوقف عن رد فعل مع 100 ميليلتر م 1 ح2حتى4. قياس الكثافة الضوئية في 492 شمال البحر الأبيض المتوسط.

4-بذر خلايا بطانية على الدوائر تدفق

  1. تحميل 0.5 مل من الكولاجين-طلاء المخزن المؤقت (كما هو موضح في الخطوة 2، 1) في محقن 1 مل اللوير لوك.
  2. تطور نهاية اللوير لوك المحاقن إلى الخزان من شريحة الدائرة التدفق.
  3. اضغط المكبس ببطء حتى هي مغلفة أكمله لين وكل الخزان ممتلئ. كرر لكل حارة واحتضان قاعة في 37 درجة مئوية ح 24.
  4. نضح المخزن المؤقت الكولاجين-طلاء مع ماصة 200 ميكروليتر. تحميل حقنه أخرى مع 1 مل حبس واضغط المكبس ببطء لغسل كل حارة من قاعة التدفق. نضح الغسيل مع 200 ميكروليتر ماصة في نهاية قاعة تدفق المتعارضة. كرر مرتين.
  5. "الماصة؛" حوالي 100 ميليلتر من 3 × 106 خلايا/مل غشائي خلية (بوك) حلاً في متوسط نمو بنسبة 10% FBS في حارة من حجرة التدفق.
    ملاحظة: بذر كثافة خلايا بطانية يتجاوز قدرة الدائرة. هذا لضمان تغطية القناة القصوى؛ تتم إزالة الخلايا غير ملتصقة في الخطوة اللاحقة المياه والصرف الصحي.
  6. احتضان قاعة في 37 درجة مئوية ل h. 24 تغير المتوسط كل ح 8-12 استخدام المحاقن اللوير لوك (كما في الخطوة 4، 4). تأكد من أنه لا يوجد أي فقاعات مرئية في الممرات.

5-عزل الصفائح الدموية من دماء كل البشر

  1. في مجلس الوزراء بإبرة 30 غ سلامة بيولوجية، إضافة 300 ميليلتر من المخزن المؤقت حامض-سترات الدكستروز (85 ملم سترات صوديوم و 111 ملم د-الجلوكوز وحمض الستريك 71 مم، الرقم الهيدروجيني 4.5) إلى vacutainer جمع دم مل 3 خالية من المواد المضافة.
  2. جمع الدم كله من المتطوعين صحية (مجاناً من العقاقير المضادة الصفيحات وغير الستيرويدية المضادة للالتهابات لمدة سبعة أيام) فينيبونكتوري (ثلاثة أنابيب من 3 مل)، بعد بروتوكول مماثل للذي ينشره برناردو وآخرون26.
  3. تجاهل الأنبوب الأول، كما يمكن أن يسبب تلف الأنسجة الأولية المرتبطة فينيبونكتوري تنشيط الصفيحات عفوية.
  4. برفق عكس فاكوتاينيرس ثلاث مرات لخلط الدم مع تخثر الدم.
  5. الطرد المركزي في فاكوتينيرس في 150 غ س لمدة 15 دقيقة في 24 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة).
  6. إزالة البلازما الغنية بالصفائح الدموية (طافية) مع ماصة ببطء في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء ونقلها بعناية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. نقل حجم كل فاكوتينير الغنية بالصفائح الدموية إلى أنبوب مخروطي واحدة لتجنب التنشيط عبر المحتملة.
    ملاحظة: ينبغي إجراء عزل الصفائح الدموية في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء لمنع التلوث البكتيري والصفائح الدموية الاصطناعية المحتملة و/أو تنشيط بطانية.
  7. الطرد المركزي هذه الأنابيب المخروطية في 900 غ س لمدة 10 دقيقة في 24 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة) إلى بيليه الصفائح الدموية.
  8. "الماصة؛" وتجاهل المادة طافية الصفائح الدموية-الفقراء.
  9. أغسل بيليه بعناية مع 1 مل من سترات-الجلوكوز-الصوديوم (CGS) المخزن المؤقت (pH سترات الصوديوم 13 مم وعيار 30 ملم د-الجلوكوز، وكلوريد الصوديوم 120 ملم، 7.0).
    ملاحظة: سوف تظهر الصفائح الدموية في تشكيلات لفافة ورقية مثل عندما يتم إضافتها المخزن المؤقت لكلية الدراسات العليا وهو حراكه بيليه بلطف. في العينات الملوثة بتنشيط الصفائح الدموية، الصفائح الدموية سوف لا ريسوسبيند بسهولة وسوف تظهر كلومبي.
  10. بمجرد الكامل حراكه، الطرد المركزي العينات من 900 غ س لمدة 10 دقائق في 24 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة).
  11. إزالة المخزن المؤقت أغسل CGS وريسوسبيند بيليه في 3 مل من المخزن المؤقت تيرودي (كلوريد الصوديوم 138 مم، مم 5.5 مم 0.36 مائي فوسفات الصوديوم، وكلوريد البوتاسيوم 2.9 ملم، د-الجلوكوز وبيكربونات الصوديوم 12 مم درجة الحموضة 7.4). ضمان استثارة كاملة الصفائح، وإذا لوحظت المجموعات، تجاهل العينة.
  12. إضافة 1.5 ميليلتر من 20 مم DiOC6 الأسهم الحل (حل ملغ 57.25 في 5 مل ميثانول) لكل أنبوبة مخروطية الشكل 3 مل من الصفائح الدموية غسلها لتركيز نهائي من 1 ميكرومتر.
    ملاحظة: DIOC6 صبغة المتقدرية فلورية خضراء المستخدمة في هذه التجربة إلى تسمية الصفائح الدموية.
  13. 1 مل الكوة من حل الصفيحات غسلها ثلاث ميكروسينتريفوجي 1.5 مل أنابيب.
    ملاحظة: يحسب حجم الصفائح الدموية اللازمة لهذه التجربة أساس على حجم الدائرة تدفق وإجهاد القص المطلوب، وطول التجربة (الخطوة 6، 5). ويمكن تعديل هذا البروتوكول تغير الأوضاع ضمان عدم وجود حجم كاف لتدفق السوائل.
  14. استخدام الصفائح غسلها داخل ح 2 من العزلة.

6-تدفق أجهزة الجمعية

  1. إرفاق قطعة 70 سم معقمة سيليكون أنابيب (الداخلية قطرها 1.6 ملم) اتصال اللوير كوع ذكور في نهاية واحدة ومحول قفل اللوير الإناث في الطرف الآخر.
  2. قم بتوصيل مهايئ قفل اللوير الإناث يعلق على الأنابيب لحقنه 20 مل.
  3. كرر الخطوات من 6.1 و 6.2 مرتين لإنشاء ثلاثة اتصالات أنابيب حقنه متطابقة.
  4. استخدام مضخة الحقن بتوليد تدفق السائل. إدخال الإعدادات التالية في مضخة الحقن: قطرها الداخلي معدل الحقن وتدفق.
    ملاحظة: قد حقنه 20 مل قطر مم 19.55 داخلية. يتم حساب معدل التدفق استناداً إلى الإجهاد معدل/القص القص المطلوب والأبعاد للدائرة التدفق. لتدفق الدائرة المستخدمة في الدراسة الحالية، وإلى تحقيق 1 داين/سم2 (الملاحظ في القص الوريدي منخفضة)، مطلوب بمعدل تدفق 9.37 ميليلتر/دقيقة. بسبب أدلة تربط histones بتجلط وريدي، محدداً إمالة وريدية معتدلة من 4.45 داين/سم2 . كما يستند هذا على افتراض أن المخزن المؤقت لزوجته مماثلة للمياه. ثم يساوي معدل تدفق 41.7 ميليلتر/دقيقة المعادلات المستخدمة لحساب معدل التدفق لمختلف أبعاد الدائرة التدفق ويمكن الاطلاع على:
    1. تعيين المضخة سحب السوائل باستخدام زر الخيار على مضخة الحقن.
  5. تحميل المحاقن الثلاثة المرفقة للأنابيب على مضخة الحقن وأحكام تأمين الأقواس المحيطة بالحقن وبلونجيرس.
  6. إرفاق كوع ذكور اللوير طرفي قطعة 20 سم الثانية من أنابيب سيليكون العقيمة.
  7. قم بتوصيل الكوع واحد اللوير إبرة عيار 18 يتثلم.
  8. كرر مرتين، إنشاء ثلاثة أنظمة كمية مماثلة للممرات الثلاثة من قاعة التدفق.
    ملاحظة: أنابيب السيليكون ولويرس يمكن أن تغسل بالتبييض 10% تليها الماء المقطر قبل إعادة استخدامها. لا ينصح بإعادة استخدام الدوائر التدفق.

7-المجهر الإعدادات

  1. استخدام مجهر قرص غزل مزودة بمرحلة مؤتمتة بالكامل. تؤدي الإضاءة مع إطلاق ليزر يوفر 405 و 458، 491، 543 و 633 نانومتر الليزر خطوط. التقاط جميع الصور ذات هدف X 20. ضبط كافة المعلمات مع برمجيات التحليل (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).
  2. حدد إعدادات القناة (تصفية الانبعاثات: 520/35)، مع الإثارة في 491 شمال البحر الأبيض المتوسط، لاقتناء. تعيين الإلكترون ضرب جهاز اقتران إلى كسب إلكترون-ضرب من 150، مع وقت تعرض من 200 مرض التصلب العصبي المتعدد، الحصول على مجموعة البيانات الديناميكية الكاملة.
    ملاحظة: يتم المسمى الصفائح الدموية مع صبغة فلورسنت أخضر، DiOC6، مع ماكسيما الطول الموجي (الإثارة، 482 نانومتر؛ والانبعاثات، 504 نيوتن متر).
  3. ضبط السلطة الليزر 491 شمال البحر الأبيض المتوسط إلى 20 في المائة.
  4. علامة المركز جميع الممرات الثلاثة وحدد 1 ميكرومتر لنطاق z و 0.5 ميكرومتر لحجم الخطوة. حدد العدد النقاط الزمنية (أي المدة) والوقت بين الصور (أي، الفاصل الزمني) لالتقاط صورة كل 10 s; قم بتحديد "النقاط الزمنية 60" كل شريحة. تعيين المجهر لالتقاط الصور من الممرات الثلاثة وحفظها إلى مجلد معين تجربة.
    ملاحظة: بسبب وجود قاعة تدفق الممرات الثلاثة, المجهر ستحتاج إلى التبديل بين ثلاث وظائف لالتقاط الصور.

8-فوف-الصفائح الدموية تشكيل سلسلة

  1. إزالة المتوسطة الثقافة من الدائرة تدفق (من الخطوة 4) باستخدام نفس الأسلوب كما في الخطوة 4، 4.
  2. إضافة 100 ميليلتر من أما الهيستامين (25 ميكرومتر)، سلطة النقد الفلسطينية (100 nM)، آه أو هونج كونج أو الموارد البشرية (كل في 25 ميكروغرام/مل) المخفف في المتوسط خالية من المصل (كما في الخطوة 1، 4) لتحفيز المونولاير بوك لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والمحيطة/CO2س2.
    ملاحظة: على الرغم من أن ليس من الضروري لإطلاق سراح VWF، أداء هذا التحفيز على 37 درجة مئوية سوف تحسين الرقابة VWF27.
  3. التأكد من أن واحداً من الثلاثة ممرات منفصلة للدائرة تدفق تظل غير المعالجة كعنصر تحكم تجريبية.
  4. إزالة المتوسطة استخدام حقنه 1 مل واستبدله مع 100-200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لغسل سيكريتاجوجويس الخروج من أحادي الطبقة غشائي.
  5. جبل الدائرة تدفق على موقف شريحة باستخدام مقاطع الأوعية الدموية لتأمين قاعة في مكان.
  6. إرفاق الرابط اللوير الذكور متاحة في نهاية الأنابيب 70 سم (متصلة بالمحاقن) إلى خزان الدائرة التدفق. كرر اثنان أخرى تدفق الدائرة الممرات.
  7. بدء ضخ حقنه لإزالة المياه والصرف الصحي في برنامج تلفزيوني. ماصة برنامج تلفزيوني إضافية إلى الخزان الدائرة تدفق المتعارضة التأكد من أن الممرات لم تجف.
  8. مراقبة نظام تدفق تدفق يعادل عبر جميع الممرات الثلاثة وثم توقف المضخة المحاقن.
  9. حدد مجالاً لالتقاط الصور في حوالي منتصف كل حارة، في نفس المنطقة تقريبا بين التجارب.
    ملاحظة: يمكن أن يكون أعمى الشخص الذي يعمل بالمجهر للظروف التجريبية. تضمن هذه الخطوة أن تركز المجهر قبل تدفق الصفائح الدموية (راجع الخطوة 7).
  10. إرفاق مقرنة اللوير الإناث لحقنه 5 مللي، ومن ثم إلى الموصل اللوير الذكور مجاناً (الخطوة 6.8) وتغرق إبرة يتثلم في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل يحتوي على الحل الصفيحات غسلها (الخطوة 5.13). رسم الحل الصفيحات عن طريق الأنابيب لضمان لا فقاعات الهواء داخل النظام ببطء.
  11. إزالة المحاقن 5 مل وإرفاق اللوير الذكور إلى خزان فتح الدائرة تدفق. كرر للممرات الثلاثة.
  12. إعادة تشغيل المضخة المحاقن والتقاط الصور أثناء تدفق الصفائح الدموية باستخدام مجهر وبروتوكول الإعدادات من الخطوة 7 لمدة 10 دقائق في الظلام.
  13. بعد 10 دقيقة، قطع الاتصال نظام من الأنابيب المدخول في الخزان الدائرة تدفق وملء الخزان مع برنامج تلفزيوني للحفاظ على التدفق عبر أحادي الطبقة غشائي.

9-فوف-الصفائح الدموية سلسلة القياس الكمي

ملاحظة: مطلوب التدفق المستمر لبرنامج تلفزيوني للحفاظ على استطالة السلسلة VWF-الصفائح الدموية لتحليل الصور. وقف تدفق سيؤدي إلى فوف أن تصبح كروي وسوف تنال من الصفائح الدموية VWF سلسلة القياس الكمي. من الضروري أن أعلى يصل كل الخزان مع برنامج تلفزيوني أثناء التقاط الصورة. يمكن استبدال حبس برنامج تلفزيوني إذا لوحظ تقلص الخلية أو مفرزة أثناء هذه الخطوة.

  1. بداية مع المسلك الأول، التقاط الصور 10 كل شريحة دون التداخل باستخدام عدسة هدف X 20 منتصف الشريحة. كرر هذه العملية لكل حارة.
    ملاحظة: ينبغي تجنب المناطق المحيطة بالخزانات بسبب إجهاد القص المضطربة.
  2. باستخدام برنامج معالجة الصور، ضبط السطوع عن طريق النقر فوق "صورة،" و "ضبط"، و "السطوع." اسحب شريط التمرير حتى يمكن عرض الصفائح الدموية التقيد بها جيدا بما يكفي للقياس الكمي.
  3. تسجيل سلسلة VWF-الصفائح الدموية عند ملاحظة الصفائح محاذاة ثلاثة أو أكثر في الصورة. عد جميع السلاسل VWF-الصفائح الدموية في صورة ما. كرر لكل صور 10 ومتوسط للتجربة.
    ملاحظة: يمكن أن يكون أعمى الشخص الذي يقوم بتقدير الظروف التجريبية. ليس من الضروري يشترك وصمة عار ل VWF،، وهذا ما أكدته الدراسات المستقلة8،،من2829.
  4. تكرار التجربة على الأقل ثلاث مرات لتقييم كل الارتباط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتقييم تأثير هيستونيس على الإصدار فوف من خلايا بطانية مباشرة، نتعرض بوكس المتلاقية لسلطة النقد الفلسطينية التي تحتوي على المتوسط خالية من المصل (مراقبة إيجابية)، آه، الموارد البشرية، ودولار هونج كونج ح 2. لقد أظهرنا أن هونج كونج الناجم عن زيادة إضعاف نسبة بروتين فوف (VWF:Ag) في متوسط خلايا بطانية المعالجة (الشكل 1). من المثير للاهتمام، عندما كانت تحفز بوكس مع آه والموارد البشرية، هناك أقل VWF:Ag اكتشفت في المتوسط مما في الحالة غير المعالجة. افترضنا لأنه يمكن ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بينما الفسيولوجية أهمية الصفائح الدموية VWF سلاسل تظل مثيرة للجدل بسبب انحلالها السريع حضور حوزتي ناهضة VWF ADAMTS13، هي بمثابة نموذج قابلة للقياس في المختبر للتوظيف الصفائح الدموية التي فوف إلى موقع في قد تشكل خثرة حضور مترجم زيادات في مستويات هيستون5. وعلاوة على ذلك، في الأمراض التي تفتقر إلى النشاط مثل ADAMTS13 البرفرية الصفيحات الخثاريه (TTP)-أو في ميكرونفيرونمينتس التحريضية-حيث النشاط ADAMTS13 الصفيحات VWF تحول دون سلاسل يمكن ملاحظتها في فيفو32 وقد تس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ميشيل أليسون مستلم فردريك بانتنغ و "تشارلز أفضل كندا منحة الخريجين" من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا). لورا ل. سويستون هو زمالة استوفوا المستلم. ليليكراب ديفيد هو المستفيد من "كرسي أبحاث كندا" في "الأرقاء الجزيئية". تم تمويل هذه الدراسة في الجزء من استوفوا التشغيل منحة (اجتماع-97849).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
هيستونات الغدة الصعترية غير المجزأة (UH)ورثينجتون الكيمياء الحيويةHLYالمعاد تشكيلها في وسائط مخفضة المصل (5 مجم / مل)
هيستونات الغدة الصعترية الغنية بالليسين (هونج كونج)سيجما ألدريتشH5505أعيد تشكيلها في وسائط مخفضة المصل (5 مجم / مل)
هيستونات غنية بالأرجينين (HR)سيجما ألدريتشH4830أعيد تشكيلها في وسائط مخفضة بالمصل (5 مجم / مل)
فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA)سيجما ألدريتشP8139أعيد تشكيله في DMSO (20 ملم)
الهيستامينسيجما-ألدريتشH7125-1Gأعيد تشكيله في الماء (50 مجم / مل)
3،3 'ديهكسيل أوكساكاربوسيانين يوديد (DiOC6)InvitrogenD273أعيد تكوينه في الميثانول (20 ملم)
الأرانب المضادة للطلاء VWF الأجسام المضادةDAKOA0082ل VWF ELISA
الأرانب الأجسام المضادة للكشف عن VWF ، HRP مترافقDAKOP0026ل VWF ELISA ومقايسة ربط هيستون-VWF
Nunc MaxiSorp مسطحة القاع 96 بئر ألواح دقيقةeBioscience44-2404-21لمقايسة ربط هيستون-VWF
Immulon 4 HBX مسطحة القاع Microtiter 96 بئر لوحاتحرارية علمية3855ل VWF ELISA
Humate-PCSL BehringN / Aعامل / عامل VON Willebrand البشري المشتق من البلازما مركب
البلازما المرجعية العاديةBioLogicCCNRP-05لمنحنى VWF ELISA
كاشف O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD)Sigma-AldrichP8287المنتج المكافئ المتوفر من خلال ThermoFisher Scientific (رقم الكتالوج: 34006)
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162للزراعة والأولي بذر
محلول الملح المتوازن من BOEC Hank (HBSS)ThermoFisher Scientific14025092
الكولاجين ذيل الفئران من النوع 1Corning354236
Gibco Opti-MEM I Reduced SerumMedia ThermoFisherScientific 31985070لتحفيز الخلايا البطانية
METAMORPH أتمتة الفحص المجهري وبرامج تحليل الصورالأجهزة الجزيئيةN / A
أنابيب جمع الدم BD Vacutainer ، بدون مضافةBD Biosciences366703
& micro ؛ -Slide III 0.1 (غرف التدفق)Ibidiإيقاف هذا المنتج. نقترح استخدام µ ؛ -Slide VI 0.1 (# 80661) أو 0.4 (# 80601) وإعادة حساب معدل التدفق وحجم الصفائح الدموية اللازمة للحفاظ على إجهاد القص البالغ 4.45 دن / سم 2
أنابيب السيليكون 1.6 مم ID: 5 م ، معقمIbidi10842
Luer Lock Connector أنثى: مادة البولي بروبيلين الطبيعية ، معقمةIbidi10825
Elbow Luer Connector ذكر: بولي بروبيلين أبيض ، معقمIbidi10802
حادة 18G إبرةBD Biosciences305180
20 مل محاقنBD Biosciences302830
مضخة حقنةNew Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTMN / A
Quorum WaveFX- 4X1 مجهر قرص الغزلQuorum TechnologiesN / A
معالجة الصورImageJN / A
القياسي تم برنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, aB., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel - Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473(2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384(2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend'homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة