مقالة منهجية

ريتروفيرال المسح الضوئي: تعيين مواقع تكامل ملف لتحديد المناطق التنظيمية الخاصة بالخلية

7.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55919

⸱

مايو 28, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genome Research, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, 2Laboratory of Chromatin and Gene Regulation During Development, Imagine Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, CNR, 4Généthon, 5Sorbonne Paris Cité - Université Paris Descartes

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نحن تصف بروتوكول لرسم الخرائط على نطاق الجينوم من مواقع التكامل من مولوني الفئران فيروس اللوكيميا النواقل الفيروسية القائمة على فيروس في الخلايا البشرية.

الملخص

مولوني الفئران اللوكيميا (ملف) الفيروسات الفيروسية القائمة على الفيروس تتكامل في الغالب في المحسنات أسيتيلاتد والمروجين. لهذا السبب، يمكن استخدام مواقع التكامل مف كعلامات وظيفية من العناصر التنظيمية النشطة. هنا، نقدم أداة مسح الفيروسات الرجعية، والذي يسمح لتحديد الجينوم على نطاق واسع من المعززات خلية محددة والمروجين. باختصار، يتم ترانزدوسد السكان الخلية المستهدفة مع ناقلات المشتقة ملف ويتم هضم الحمض النووي الجيني مع انزيم تقييد القطع في كثير من الأحيان. بعد ربط الشظايا الجينومية مع رابط الحمض النووي متوافق، وتفاعل سلسلة البلمرة ربط بوساطة (لم-ير) يسمح التضخيم من تقاطع الجينوم الفيروس المضيف. ويستخدم تسلسل هائل من أمبليكونس لتحديد ملف التكامل التكامل الجينوم واسعة. وأخيرا، يتم تعريف مجموعات من التكامل المتكررة لتحديد المناطق التنظيمية محددة الخلية، المسؤولة عن تفعيل الخلايا من نوع برامج النسخي محددة.

= "jove_content"> تسمح أداة المسح الضوئي للفيروسات الرجعية بتحديد الجينوم على نطاق واسع للمروجين والمحسنات الخاصة بالخلية في مجموعات الخلايا المستهدفة معزولة مستقبلا. ومن الجدير بالذكر أن المسح الضوئي للفيروسات الرجعية يمثل تقنية فعالة للتعرف بأثر رجعي على السكان النادرين ( مثل الخلايا الجذعية الجسدية) التي تفتقر إلى علامات قوية للعزلة المرتقبة.

المقدمة

يتم تحديد هوية الخلية عن طريق التعبير عن مجموعات محددة من الجينات. دور العناصر التنظيمية سيس، مثل المروجين والمعززة، أمر بالغ الأهمية لتفعيل الخلايا من نوع برامج النسخي محددة. وتتميز هذه المناطق التنظيمية بميزات لونين محددة، مثل تعديلات هيستون غريبة، وعوامل النسخ والعوامل المشتركة الملزمة، وإمكانية الوصول إلى الكروماتين، والتي استخدمت على نطاق واسع لتحديدها على نطاق الجينوم في عدة أنواع من الخلايا 1 ، 2 ، 3 . على وجه الخصوص، يستخدم على نطاق واسع الجينوم على نطاق واسع من أستيليون هيستون H3 ليسين 27 (H3K27ac) لتحديد المروجين النشطة، والمحسنات وعظم المعززات 4 ، 5 ، 6 .

مولوني الفئران فيروس سرطان الدم (مف) هو فيروس غاما ريتروفيروس الذي يستخدم على نطاق واسع للجيناتنقل في خلايا الثدييات. بعد إصابة الخلية المستهدفة، يتم إعادة نسخ جينوم الحمض النووي الريبي ريتروفيرال في جزيء الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل الذي يربط البروتينات الفيروسية والخلوية لتجميع مجمع ما قبل التكامل (بيك). بيك يدخل نواة ويربط لونين الخلية المضيفة. هنا، إنتغراس الفيروسية، عنصر بيك الرئيسية، يتوسط دمج الحمض النووي بروفيرال في الجينوم الخلية المضيفة. والتكامل ملف في الحمض النووي الجيني ليس عشوائيا، ولكن يحدث في العناصر النشطة التنظيمية سيس، مثل المروجين والمعززين، بطريقة محددة خلية 7 ، 8 ، 9 ، 10 . يتم التوسط هذا الملف التكامل غريبة عن طريق التفاعل المباشر بين إنتغراس مف والبرومودومين الخلوية والنطاق إكستراترمينال (بيت) البروتينات 11 ، 12 ، 13 . البروتينات بيت (BRD2، BRD3، وBRD4) بمثابة جسر بين الكروماتين المضيف و بيك الموافقة المسبقة عن علم: من خلال برومودومينز أنها تعترف للغاية أسيتيلاتد المناطق التنظيمية رابطة الدول المستقلة، في حين أن المجال إكستراترمينال يتفاعل مع مف إنتغراس 11 ، 12 ، 13 .

هنا، نحن تصف المسح الضوئي للفيروسات الرجعية، أداة جديدة لتعيين المناطق النشط- سيس التنظيمية على أساس خصائص التكامل من مف. باختصار، يتم ترانسدوسد الخلايا مع ناقلات فيروس النسخ الاحتياطي المستمدة مف لفب التعبير عن تعزيز البروتين الأخضر الفلورسنت (إغف) مراسل الجينات. بعد استخراج الحمض النووي الجيني، يتم تضخيم تقاطعات بين 3 'تكرار محطة طويلة (لتر) من ناقلات مف والحمض النووي الجيني من قبل ربط بوساطة ير (لم-ير) وتسلسل بشكل واسع. يتم تعيين مواقع التكامل ملف إلى الجينوم البشري والمناطق الجينومية المستهدفة للغاية من قبل ملف تعرف بأنها مجموعات من مواقع التكامل ملف.

المسح الضوئي للفيروسات الرجعيةتم استخدام نينغ لتحديد العناصر التنظيمية النشطة الخلية محددة في العديد من الخلايا الأولية الإنسان 14 ، 15 . مف التي تم تحديدها بشكل مشترك مع المروجين والمعززين المعرفة إبيجينيتيكالي، ومعظمها تأوي علامات هيستون النشطة، مثل H3K27ac، وكانت محددة الخلية. المسح الضوئي للفيروسات الرجعية يسمح لتحديد الجينوم على نطاق واسع من العناصر التنظيمية الحمض النووي في مستقبلي تنقيته السكان الخلية 7 ، 14 ، وكذلك في السكان خلية محددة بأثر رجعي، مثل الخلايا الجذعية الخلايا الكيراتينية، التي تفتقر إلى علامات فعالة لعزلة المحتملين 15 .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. ملف تناسل الخلايا البشرية

  1. عزل الخلايا المستهدفة و ترانزدوس لهم مع ناقلات فيروس الورم الرجعي المستمدة مف التي تؤوي الجين مراسل إغف و بسيودوتيبد مع الحويصلي فيروس الفم G (فسف-G) أو بروتين سكري مغلف أمفوتروبيك 16 .
    1. إبقاء الخلايا وهمية ترانسدوسد كسيطرة سلبية للتحليلات التالية. وبما أن ناقلات الفيروسات القهقرية المستندة إلى مف يمكن أن تنقل الخلايا التي تقسم بكفاءة، فإن ثقافة سكان الخلية المستهدفة في ظروف تحفز انقسام الخلايا. تحتاج ظروف التحول إلى أن يكون الأمثل على وجه التحديد لكل نوع من الخلايا قيد الدراسة. يتم وصف نمو الخلايا وظروف تنبيغ للأسلاف المكونة للدم البشرية، والخلايا التائية وخلايا البشرة في المراجع 7 و 14 و 15 و 17.
  2. 48 ساعة بعد تنبيغ، ريسوسبيند 100،000 الخلايا في 300 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (بس) تحتوي على 2٪ مصل بقري الجنين وقياس إغف التعبير عن طريق وتحليل سايتوميتريك منخفضة (488 نانومتر الإثارة الليزر). استخدام الخلايا وهمية ترانزدوسد كما السيطرة السلبية. لاستعادة موقع التكامل الأمثل، وتنقية الخلايا + غفب بواسطة مضان تنشيط الخلايا فرز (فاكس).
  3. جمع 0.5 إلى 5 ملايين خلية لإعداد الحمض النووي الجيني. يفضل فترة أطول من الثقافة (> 7 أيام) لتخفيف البروفيروس غير المتضمنة وضرورية عند تحليل سلالة الخلايا الجذعية النائية على المدى الطويل (انظر قسم المناقشة والمرجع 15 ). الكريات الخلية يمكن أن تكون المفاجئة المجمدة وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. التضخيم من مواقع التكامل مف بواسطة رابط بوساطة ير (لم-ير)

  1. إعداد الحمض النووي الجيني (غنا)
    1. استخراج غنا باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي المستندة إلى عمود واتبع بروتوكول للخلايا مثقف، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. تقييد انزيم الهضمعلى
    1. إعداد 4 تقييد انزيمات الهضم لكل عينة في أنابيب 1.5 مل. هضم 0.1 إلى 1 ميكروغرام غنا في كل أنبوب بإضافة 1 ميكرولتر من Tru9I (10U) و 1 ميكرولتر من العازلة M في الحجم النهائي من 10 ميكرولتر. احتضان ردود الفعل في 65 درجة مئوية لمدة 6 ساعات أو بين عشية وضحاها.
    2. إضافة إلى كل رد فعل 1 ميكرولتر من بستي (10U)، 1 ميكرولتر من العازلة H و 8 ميكرولتر من الماء. احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات أو بين عشية وضحاها. يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. ربط رابط
    1. إعداد 100 ميكرومتر Tru9I رابط حل الأسهم في أنبوب 1.5 مل عن طريق خلط رابط زائد حبلا وربط ناقص أوليغونوكليوتيدس حبلا في تركيز 100 ميكرومتر. وضع أنبوب في مجموعة المياه في 100 درجة مئوية والسماح لها يبرد في درجة حرارة الغرفة. يمكن تخزين Tru9I رابط حل المخزون في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. إعداد 8 ربط ربط ردود الفعل في 1.5 مل أنابيب. لكل رد فعل، قم بإضافة المكون التاليثانية إلى 10 ميكرولتر من تقييد انزيم الهضم: 1.4 ميكرولتر من 10X T4 الحمض النووي ليغاس رد فعل العازلة، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر رابط Tru9I، 1 ميكرولتر (2000U) من ليغاز T4 دنا و 0.6 ميكرولتر من الماء. احتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 3 إلى 6 ساعات. يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. أول ير
    1. إعداد 48 ردود الفعل ير (6 ردود فعل من كل أنبوب ربط) في 0.2 مل أنابيب. لكل ير، إضافة الكواشف التالية إلى 2 ميكرولتر من رد فعل ربط: 5 ميكرولتر من العازلة 10X ير، 2 ميكرولتر من 50 ملي سلفات المغنيسيوم، 1 ميكرولتر من 10 ملي ديوكسينوكليوتيد (دنتب) مزيج، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر رابط التمهيدي، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر مل-3 "لتر التمهيدي، 0.3 ميكرولتر (1.5U) من البلمرة دنا طق و 37.7 ميكرولتر من الماء. وترد تسلسل التمهيدي في الجدول 1.
    2. أداء تفاعل ير في سيكلر الحرارية مع غطاء ساخن، على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. 25 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 72 درجة؛ C لمدة 5 دقائق. عقد في 4 درجات مئوية. يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  5. ير الثاني
    1. إعداد 48 ردود الفعل ير (1 من كل "أول ير" أنبوب) في 0.2 مل أنابيب. لكل ير، إضافة المكونات التالية إلى 2 ميكرولتر من تفاعل ير الأول: 5 ميكرولتر من العازلة ير 10X، 2 ميكرولتر من 50 ملي مغنيسيوم كبريتات، 1 ميكرولتر من 10 ملي دنتب ميكس، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر رابط التمهيدي متداخلة، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر مل-3 "لتر متداخلة متداخلة، 0.3 ميكرولتر من طاق دنا البلمرة (1.5 U) و 37.7 ميكرولتر من الماء. استخدام الاشعال المتداخلة مصممة لاستراتيجية التسلسل ضخمة محددة اختيار: (ط) رابط متداخلة متداخلة و مف-3 'لتر متداخلة متداخلة متوافقة مع منصة إلومينا. (إي) رابط متداخلة متداخلة و مف-3 'لتر متداخلة متداخلة متوافقة مع منصة روش. وترد تسلسل التمهيدي في الجدول 1 .
    2. أداء تفاعل ير في سيكلر الحرارية مع غطاء ساخن، على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. 25دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. عقد في 4 درجات مئوية. يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    3. تجمع ردود الفعل ير متداخلة 48 في أنبوب 15 مل (الحجم النهائي من ~ 2.4 مل). يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  6. تحديد وجود وحجم المنتجات لم-ير من قبل الاغاروز الكهربائي هلام.
    1. إضافة 4 ميكرولتر من تحميل العازلة إلى 20 ميكرولتر من المنتجات لم-ير وتحميل العينة على هلام الاغاروز 1٪، جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي 100 بب. تشغيل هلام في 5 V / سم لمدة 30 إلى 60 دقيقة وتصور المنتجات ير من قبل تلطيخ إيثيديوم بروميد.
    2. تشغيل رد فعل لم-ير من عينة وهمية ترانزدوسد كما السيطرة السلبية.
  7. يعجل أمبليكونس بإضافة 0.1 مجلدات من محلول خلات الصوديوم (3 M؛ ودرجة الحموضة 5.2) و 2.5 مجلدات من الايثانول بنسبة 100٪. مزيج وتجميد في -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    1. تدور في فوليرة لبنانية السرعة في ميكروسنتريفوج القياسية في 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تجاهل طاف وغسل بيليه مع الايثانول 70٪. تدور بأقصى سرعة في ميكروسنتريفوج القياسية في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. تجاهل طاف والهواء الجاف بيليه. إضافة 200 ميكرولتر من المياه ير الصف و ريسوسبيند الحمض النووي. يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  8. إضافة 20 ميكرولتر من تحميل العازلة إلى 100 ميكرولتر من المنتجات لم-ير وتحميل العينة على هلام الاغاروز 1٪، جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي 100 بب.
    1. تشغيل هلام في 5 V / سم لمدة 30 إلى 60 دقيقة وقطع جزء من هلام تحتوي على 150 إلى 500 أمبليكونس بب طويلة.
    2. تنقية المنتجات لم-ير مع العمود القائم على استخراج هلام عدة وقياس التركيز باستخدام طيف الأشعة فوق البنفسجية.
  9. استخدام 1 ميكرولتر من المكتبة لتقييم طول المنتجات لم-ير باستخدام أداة بيواناليزر، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  10. استنساخ بندقية من أمبليكونس
    1. استخدام 20 نانوغرام من المنتجات لم-ير المنقى واستنساخ لهم في ناقلات pCR2.1-توبو، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. أداء التفاعلات التسلسل باستخدام M13 العالمي التمهيدي، تليها رسم الخرائط الجينومية من تسلسل الناتجة، للكشف عن وجود تقاطعات الجينوم الفيروسي (بما في ذلك التمهيدي مت-3 "لتر متداخلة) في> 50٪ من الحيوانات المستنسخة لتحديد العينات المناسبة لتسلسل هائل. مثال على تقاطع الجينوم الفيروسي:
      figure-protocol-1
      ملف-3 'لتر متداخلة التمهيدي 454 والربط متداخلة التمهيدي 454 ( الجدول 1 ) يشار إلى جريئة و 3' نهاية لتر الفيروسية في مائل. يتم تسلسل تسلسل الجينوم البشري في النص الأحمر (chr10: 6439408-6439509، hg19).

3. تسلسل هائل من مواقع التكامل مف

ملاحظة: لم-ير برودأوكتس يمكن أن تتسلسل باستخدام المنصات التجارية (اختيار الزوج التمهيدي الصحيح متداخلة في تفاعل ير الثاني، انظر القسم الفرعي 2.5.1). للتسلسل من قبل منصة روش غس-فلك بايروسكنسينغ، الرجوع إلى الأوراق السابقة 7 ، 14 ، 15 . في هذا القسم، يتم وصف بروتوكول الأمثل حديثا لمنصة التسلسل إلومينا.

  1. إعداد المكتبة
    1. إعداد 1 فهرسة تفاعل ير لكل عينة في 0.2 مل أنابيب. لكل ير، إضافة الكواشف التالية إلى 5 ميكرولتر (150-170 نانوغرام) من المنقى المنتج لم-ير: 5 ميكرولتر من مؤشر التمهيدي 1، 5 ميكرولتر من مؤشر التمهيدي 2، 25 ميكرولتر من 2X ماستر ميكس و 10 ميكرولتر من PCR- المياه الصف. استخدم تركيبة فهرس مختلفة لكل عينة.
    2. أداء تفاعلات ير في سيكلر الحرارية مع غطاء ساخنة، على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 8 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. 72 درجة مئوية لمدة 5 مفي؛ عقد في 4 درجات مئوية.
    3. تنقية المنتجات ير باستخدام الصلبة المرحلة عكسها الشلل بروتوكول (سبري) العزلة حبة: في جديد 1.5 مل أنابيب، إضافة 56 ميكرولتر من الخرز لكل عينة والمضي قدما بعد تعليمات الشركة الصانعة. أزل في 25 ميكرولتر من تريس-حمض الهيدروكلوريك 10 ملم. يمكن تخزين المكتبات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. مكتبة الاختيار
    1. استخدام 1 ميكرولتر من العينة لتقييم حجم المكتبة باستخدام أداة بيواناليزر.
    2. استخدام 1 ميكرولتر من العينة لتحديد مولاريتي المكتبة باستخدام القائم على مضان الوقت الحقيقي ير فحص، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  3. مكتبة التخفيف والتسلسل
    1. تمييع المكتبات إلى 10 نانومتر باستخدام تريس-هكل 10 ملم. لتجميع المكتبات، ونقل 5 ميكرولتر من كل مكتبة المخفف إلى أنبوب 1.5 مل جديد ومن ثم تمييع حمام السباحة إلى 4 نانومتر في تريس-حمض الهيدروكلوريك 10 ملم.
    2. مزيج 5 ميكرولتر من تجمع المخفف مع 5 ميكرولتر من 0.2 N هيدروكسيد الصوديوم في 1.5 متر جديدL أنبوب، دوامة لفترة وجيزة، تدور إلى أسفل واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة إلى ديفيراتيون المكتبات.
    3. وضع أنابيب على الجليد وإضافة 990 ميكرولتر من العازلة التهجين قبل المبردة (HT1). قسامة 300 ميكرولتر من تجمع التشويه والتحريف في أنبوب 1.5 مل جديد وإضافة 300 ميكرولتر من HT1 قبل المبردة للحصول على 10 بم بركة المكتبة النهائية.
    4. في موازاة ذلك، مزيج 2 ميكرولتر من مكتبة مراقبة فيكس (10 نانومتر) مع 3 ميكرولتر من تريس-هكل 10 ملم في أنبوب 1.5 مل. إضافة 5 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 0.2 N، دوامة لفترة وجيزة، تدور إلى أسفل واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة إلى ديناتور فيكس المخفف. وضع أنبوب على الجليد وإضافة 990 ميكرولتر من HT1 قبل المبردة.
    5. قسامة 300 ميكرولتر من فيكس التشويه والتحريف في أنبوب 1.5 مل جديد وإضافة 300 ميكرولتر من HT1 قبل المبردة للحصول على 10 بم النهائي فيكس.
    6. في أنبوب 1.5 مل جديد، مزيج 510 ميكرولتر من تجمع مكتبة التشويه والتحريف مع 90 ميكرولتر من مكتبة فيكس التشويه والتحريف، وبالتالي الحصول على النهائي 10 بم تجمع مع 15٪ من السيطرة فيكس.
    7. ماصة هذه 600 ميكرولتر من العينةالحجم في خزان عينة تحميل من خرطوشة كاشف تسلسل ذوبان ومتابعة على الفور لأداء قراءة واحدة 150 دورة تشغيل.
      ملاحظة: يتم سرد الكواشف الحرجة وتسلسل التمهيدي المطلوبة لهذا البروتوكول في الجدول 1 .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

سير عمل إجراء المسح الضوئي للفيروسات الرجعية

يتم تخطي تدفق العمل من إجراء المسح الضوئي فيروسات في الشكل 1 . يتم تنقية السكان الخلية المستهدفة و ترانسدوسد مع ناقلات فيروس النسخ الاحتياطي المستمدة ملف معبرا عن الجينات مراسل إغف. ويحيط التحوير من قبل اثنين من تكرار محطة متطابقة متطابقة (5 'و 3' لتر)، وضمان التخليق، ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا، وصفنا بروتوكول لرسم الخرائط على نطاق الجينوم على مواقع التكامل من مف، وهو فيروس ريتروفيروس الذي يستهدف مناطق الكروماتين، علامة إبيجينيتيكالي كما المروجين النشطة والمحسنات. الخطوات الحاسمة و / أو القيود على البروتوكول ما يلي: (ط) تنبيغ مف السكان الخلية المستهدفة. (2) تضخيم الوصلات المضيفة للفيروسات بواسطة لم-ير؛ (3) استرجاع جزء كبير من مواقع التكامل. ناقلات فيروس العوز المناعي القائم على ملف تنتقل بكفاءة الخلايا المقسمة. انخفاض كفاءة تنبيغ الخلايا غير تقسيم (مثل الخلايا العصبي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل بمنح مقدمة من مجلس البحوث الأوروبي (إرك-2010-أدغ، غ-سكين)، ووزارة التعليم الإيطالية والجامعات والبحوث (فيرب-فوتورو في ريسركا 2010-RBFR10OS4G، فيرب-فوتورو في ريسركا 2012-RBFR126B8I_003 ، ومشروع إبيجن إبيجينوميكس الرائد)، ووزارة الصحة الإيطالية (باحثون شباب دعوة 2011 غر-2011-02352026) ومؤسسة معهد إيماجين (باريس، فرنسا).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
PBS ، درجة الحموضة 7.4ThermoScientific 10010031أو ما يعادلها
مصل الأبقارالجنيني ThermoScientific16000044أو ما يعادلها
0.2 مل أنابيبمورد المختبر
1.5 مل أنابيبالمختبر
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit   ؛QIAGEN51306أو ما يعادله
T4 DNA ligase New England BioLabsM0202T
T4 DNA Ligase ReactionNew England BioLabsM0202T
Linker Plus Strand oligonucleotideموردالعام 5'-PO4< / sub>-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3'   (درجة التنقية: SDS-PAGE)
رابط ناقص حبلا قليل النوكليوتيدالمختبر العام المورد5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (درجة التنقية: SDS-PAGE)
Tru9IRoche-Sigma-Aldrich11464825001
SuRE / Cut Buffer MRoche-Sigma-Aldrich11417983001
PstI Roche-Sigma-Aldrich10798991001
SuRE / Cut Buffer HRoche-Sigma-Aldrich11417991001
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity Invitrogen11304011
10 ملي مولار dNTP مزيجInvitrogen18427013أو ما يعادله
من مورد المختبر
PCR 96 بئر تدوير حراري (مع غطاء ساخن) موردمختبر
التمهيديالمختبر5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (درجة التنقية: درجة PCR)
MLV-3' مختبرالتمهيدي 5 '-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3 ' (درجة التنقية: درجة PCR)
رابط متداخل التمهيدي 454مورد المختبر5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC] (درجة التنقية: SDS-PAGE)
MLV-3 ' LTR التمهيدي المتداخل 454المختبر العام5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC [GGTCTCCTCTGAGTTGACTACC] (درجة التنقية: SDS-PAGE)
الرابط التمهيدي المتداخل Illuminaموردالعام 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG- [AGGGCTCCGCTTAAGGGAC] (درجة التنقية: SDS-PAGE)
MLV-3 ' التمهيدي المتداخل LTR موردالمختبر5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG- [GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC] (درجة التنقية: SDS-PAGE) محلول
أسيتات الصوديوم (3M) الرقم الهيدروجيني 5.2مورد
الإيثانول (مطلق) للبيولوجيا الجزيئيةSigma-AldrichE7023أو ما يعادلها
من طقم استنساخ Topo TA (مع ناقل pCR2.1-TOPO)InvitrogenK4500-01
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28704
AgaroseSigma-AldrichA9539أو ما يعادله
من بروميد الإيثيديوم  Sigma-AldrichE1510أو ما يعادله
100 نقطة أساس سلم الحمضالنووي Invitrogen15628019 أو ما يعادلها
6x تحميل عازلةThermoScientificR0611أو ما يعادلها
NanoDrop 2000 UV-Vis مقياس الطيف الضوئيThermoScientificND-2000
Nextera XT Index kitIlluminaFC-131-1001 أو FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix  KAPA BiosystemsKK2601
حامل مغناطيسي دينال لأنابيب 2 ملInvitrogen12321Dأو ما يعادله
من Agencourt AMPure XP 60 مل مجموعةBeckman Coulter GenomicsA63881
Tris-HCl 10 ملي مولار ، درجة الحموضة 8.5مورد
Agilent 2200 TapeStation systemAgilent TechnologiesG2964AAأو ما يعادلها
D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5582أو ما يعادلها
من D1000 ReagentsAgilent Technologies5067-5583أو ما يعادلها
من مجموعة القياس الكمي لمكتبة KAPA لمنصات Illumina (ABI Prism)KAPA BiosystemsKK4835
ABI Prism 7900HT نظام PCR سريع في الوقت الحقيقيأنظمة حيوية تطبيقية4329003
هيدروكسيد الصوديوم 1.0 نيوتن ، جزيئية المختبر العام
HT1 (Hybridization Buffer)Illumina كاشف MiSeq
MiSeq Recode Kit v3 (150 دورة)نظام IlluminaMS-102-3001
MiSeqSystem IlluminaSY-410-1003
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
العام مورد العام buffer المختبر العام للمياه من الدرجةعام رابط مورد العام مورد عام LTR العام مورد المختبر العام Illumina المختبر العامالمختبر العام مورد من الدرجة البيولوجيةمتوفر في مجموعة

المراجع

  1. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  5. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  6. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  7. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
  8. Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
  9. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
  10. LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
  11. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
  12. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
  13. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
  14. Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724(2016).
  15. Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
  16. Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
  17. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688(2010).
  18. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151(2013).
  19. Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158(2013).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة