نحن وصف إجراءات مفصلة واستراتيجيات لقياس الخواص الميكانيكية والميكانيكية مسارات تتكشف من الجزيئات البروتينية مفرد باستخدام مجهر قوة ذرية. ونحن أيضا إظهار نتائج الممثل كمرجع للتحديد وتبرير لتسجيلات جزيء بروتين واحد جيد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تصميم عملية قابلة للطي للبروتينات من تسلسل الأحماض الأمينية بها إلى بنيتها ثلاثية الأبعاد الأصلية تعتبر مشكلة هامة في مجال البيولوجيا. مجهر القوة الذرية (AFM) ويمكن معالجة هذه المشكلة عن طريق تمكين التمدد والاسترخاء من جزيئات البروتين وحيد، الذي يعطي الأدلة المباشرة تتكشف وريفولدينج خصائص محددة. المستندة إلى فؤاد جزيء واحد القوة-التحليل الطيفي (فؤاد-SMFS) يوفر وسيلة لقياس ثبات والتشكلات الجسيمات ذات الطاقة العالية في البروتينات التي غير ممكنة في القياسات التقليدية الأكبر (البيوكيميائية). رغم أنه تم نشر العديد من الأوراق لإظهار مبادئ فؤاد SMFS، فإنه ليس من السهل إجراء تجارب SMFS نظراً لعدم وجود بروتوكول استفاضة كاملة. في هذه الدراسة، ونحن بإيجاز توضيح مبادئ فؤاد وتفاصيل البروتوكولات والإجراءات، وتحليل البيانات على نطاق واسع كمبدأ توجيهي لتحقيق نتائج جيدة من تجارب SMFS. نظهر الممثل SMFS نتائج القياسات التي تتكشف الميكانيكية البروتين وحيد ونحن نقدم استكشاف استراتيجيات لبعض شيوعاً واجه مشاكل.
المقدمة
وقد مكنت السلف في جزيء واحد قوة التحليل الطيفي (SMFS) بفؤاد التلاعب الميكانيكية وتوصيف دقيق لجزيئات البروتين وحيد. وهذا الوصف قد أنتجت رؤى رواية عن البروتين ميكانيكا1،2، البروتين قابلة للطي3، البروتين-يجند التفاعلات4، تفاعلات البروتين البروتين5، والقائم على البروتين المهندسة المواد6،،من78. SMFS مفيد بشكل خاص لدراسة البروتين تتكشف، كما تمتد من فؤاد يسمح السندات الكيميائية والفيزيائية في جزيء البروتين تدريجيا تمديد وفقا صلابة، مما يثير بطول كفاف متز....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-إعداد البروتين
- استنساخ الحمض النووي.
- تجميع تسلسل الحمض النووي للاهتمام، على سبيل المثال، تسلسل الحمض النووي ني10ج10، أو عزل عن طريق PCR من الكائن الحي المضيف باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية11. الجناح في الجينات للفائدة مع تقييد مواقع خلال التوليف أو عن طريق مواقع في 5 '-نهاية الإشعال PCR لتتوافق مع وحدة نمطية في pEMI91 بلازميد (أدجيني #74888)12.
- هضم كل على حدة pEMI91 بلازميد12 وتسلسل الحمض النووي للفائدة مع زوج من تقييد المواقع حيث أن تسلسل الفائدة سوف يكون محاط جنبا إلى جنب ويكرر I91 (انظر
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وتظهر نتائج تمثيلية من هذا البروتوكول في الشكل 2. إظهار كلا الفريقين منحنيات تمديد القوة التمثيلية من البروتينات. يظهر الأعلى النتائج من بوليبروتين I91، بينما يظهر الأسفل البروتين I91 المرافقة بروتين من فائدة، جزيء10ج ني. هذه التسجيلات إظهار القوة المميزة من I91 (200 pN) وكفاف زيادة طول (28 nm) مما يشير إلى أن المحاذاة والمعايرة لفؤاد كان ناجحاً. يمكن ثم تحليل هذه المنحنيات القوة-ملحق بسلاسل مثل دودة (خط متقطع) التي تساعد في تحديد طول الجزيء قوة مس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
خطوة حاسمة في البروتوكول هو استخدام بوليبروتين، الموضحة في الخطوة 1-1-2، الذي يعمل كعنصر تحكم إيجابية "البصمات" الأحداث جزيء واحد. عموما، هناك يجب أن تكون تتكشف أحداث البروتينات بوليبروتين (ل I91، وهذا يعني قوة تتكشف لزيادة طول السند الإذني وكفاف حوالي 200 من حوالي 28 nm) تختتم دون لبس أن بروتين الاهتمام قد تكشفت. على سبيل المثال، عند بروتين اهتمام يحيط به ثلاثة مجالات I91 من أي من الجانبين، ثم يجب أن مالا يقل عن أربعة من الأحداث I91 أن نخلص إلى أن ذلك إيجابيا حدث جزيء واحد. إذا لم يكن هناك عنصر إيجابي من خلال بوليبروتين.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
كان يدعمها هذا العمل على منح "المؤسسة الوطنية للعلوم" 1244297 المجلس والمجلس-1517245 ليم.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أقراص عينة AFM ، قطر 15 مم | Ted Pella، Inc. | 16218 | بمثابة قاعدة للركيزة الزجاجية |
| أغطية زجاجية مستديرة ، قطر 15 مم رقم 1 سميكة | تيد بيلا ، إنك. | 26024 | بمثابة ركيزة زجاجية وقاعدة لطلاء الذهب |
| علامات التبويب اللاصقة | تيد بيلا ، Inc. | 16079 | لصق على أقراص عينة AFM لتوفير وجه لزج لربط أغطية زجاجية مجموعة |
| رأس STD متعددة | الأوضاع Bruker Nano Inc. | 1B75C | AFM رأس |
| حامل مسبار زجاجي | Bruker Nano Inc. | MTFML-V2 | للمسح الضوئي في السوائل باستخدام MultiMode AFM. |
| Microlever AFM يجبار | Bruker Nano Inc. | ناتئ نيتريد السيليكون MLCT مع أطراف نيتريد السيليكون ، مثالي لأوضاع التصوير التلامس | |
| مجسات AFM مع أطراف مطلية ب | Au Bruker Nano Inc. | OBL-10 | لسحب البروتينات ذات القوة المنخفضة |
| الحصول على البيانات متعددة الوظائف (DAQ) ، 16 بت ، 1 مللي ثانية / ثانية (متعددة القنوات) ، 1.25 مللي ثانية / ثانية (قناة واحدة) ، 32 مدخلات تناظرية | الوطنية | PCI-6259 | الحصول على البيانات للإشارات من رأس AFM ومشغلات بيزو |
| LISA مشغلات مرحلة بيزو | الخطية Physik Instrumente LP | P-753.11C | مشغل بيزو للتحكم في موضع الركيزة وإجراء قياسات السحب XY |
| Piezo Stage | Physik Instrumente LP | P-541.2CD | Piezo Actuator للتحكم في موضع الركيزة والمسح الضوئي على سطح الركيزة |
المراجع
- Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
- Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. Th....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
