مرنا إنتيراكتوم التقاط من بروتوبلاستس النبات

Zhicheng Zhang; Kurt Boonen; Meixia Li; Koen Geuten

doi:10.3791/56011

مقالة منهجية

مرنا إنتيراكتوم التقاط من بروتوبلاستس النبات

DOI:

10.3791/56011

⸱

يوليو 28, 2017

Zhicheng Zhang¹ , Kurt Boonen¹ , Meixia Li¹ , Koen Geuten¹

¹Department of Biology, KU Leuven

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكول الالتقاط إنتيراكتوم تطبيقها على أرابيدوبسيس ثاليانا أوراق ميسوفيل ورقة بروتوبلاستس. هذه الطريقة تعتمد بشكل حاسم على في الجسم الحي الأشعة فوق البنفسجية يشابك ويسمح لعزل وتحديد البروتينات مرنا مرتبط النبات من بيئة فسيولوجية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتينات ملزمة رنا (ربس) تحديد مصائر رنا. وهم يشاركون في جميع مسارات بيوانيسيس الحمض النووي الريبي ويساهم بشكل خاص في تنظيم الجينات بعد النسخي (بتغر) من رنا رسول (مرناس). في السنوات القليلة الماضية، تم عزل عدد من بروتيوم مرنا ملزمة من الخميرة وخلايا الثدييات خطوط بنجاح من خلال استخدام طريقة جديدة تسمى "مرنا التقاط إنتيراكتوم"، والذي يسمح لتحديد البروتينات مرنا ملزمة (مربس) مباشرة من بيئة فسيولوجية. وتتكون هذه الطريقة من في الجسم الحي فوق البنفسجية (أوف) يشابك، سحب إلى أسفل وتنقية المجمعات ريبونوكلوبروتين رسول (مرنبس) من قبل حبات صغيرة (دت)، وتحديد اللاحقة للبروتينات كروسلينكد بواسطة مطياف الكتلة (مس). في الآونة الأخيرة، من خلال تطبيق نفس الطريقة، وقد تم الإبلاغ عن العديد من النباتات مرنا مرتبط بروتيوم في وقت واحد من مختلف مصادر الأنسجة أرابيدوبسيس : شتلات عتيقة،أوراق بروتينات الميزوفيل الورقية، والخلايا الجذرية المستزرعة. هنا، نقدم الأمثل مرنا طريقة التفاعل إنتيراكوموم ل أرابيدوبسيس ثاليانا أوراق بروتوبلاستس ميسوفيل ورقة، وهو نوع الخلية التي تعمل كأداة تنوعا للتجارب التي تشمل المقايسات الخلوية المختلفة. الشروط للحصول على أفضل محصول البروتين تشمل كمية من الأنسجة بدءا ومدة أشعة فوق البنفسجية. في بروتيوم مرنا ملزمة التي تم الحصول عليها من تجربة متوسطة النطاق (10 ⁷ خلايا)، لاحظت ربس أن تم العثور على قدرة ملزم رنا أن تكون ممثلة تمثيلا زائدا، وتم تحديد العديد من الممارسات التجارية التقييدية الجديدة. ويمكن توسيع نطاق التجربة (10 ⁹ خلايا)، ويمكن تطبيق الطريقة المثلى على أنواع الخلايا النباتية الأخرى والأنواع لعزل واسع، الكتالوج، ومقارنة بروتيوم مرنا المرتبطة في النباتات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم اليوكاريوتس مسارات تنظيمية متعددة ل رنا بيوجينيسيس للحفاظ على العمليات البيولوجية الخلوية. من بين الأنواع المعروفة من الحمض النووي الريبي، مرنا متنوعة جدا ويحمل القدرة على الترميز من البروتينات و إسوفورمز ¹ .The بتغر مسار يوجه مصير ما قبل مرناس ² ^، ³ . الممارسات التجارية التقييدية من مختلف الأسر الجينات السيطرة على تنظيم الحمض النووي الريبي، وفي بتغر، مربس محددة دليل مرناس من خلال التفاعلات المادية المباشرة، تشكيل مرنبس وظيفية. لذلك، تحديد و مربس وصفها و مرنبس أمر بالغ الأهمية لفهم تنظيم استقلاب مرنا الخلوي ^2. على مدى العقود الثلاثة الماضية، ومختلف في الطرق المختبرية - بما في ذلك الحمض النووي الريبي التحولات التحول (ريمزا) المقايسات، والتطور المنهجي للروابط بواسطة المقايسات الإثراء الأسي (سيليكس) استنادا إلى البنى المستمدة من المكتبة، رنا بيند-n-سيق (ربنز)، راديولبلد أو الكميةومضامين ملزمة الحمض النووي الريبي مضان، والبلورات بالأشعة السينية، وطيفي الرنين المغناطيسي النووي ⁴ ^، ⁵ ^، ⁶ ^، ⁷ ^، ⁸ ^، ⁹ - تم تطبيقها على نطاق واسع لدراسات الممارسات التجارية التقييدية، وذلك أساسا من خلايا الثدييات. ويمكن البحث عن نتائج هذه الدراسات من الممارسات التجارية التقييدية الثدييات عن طريق قاعدة بيانات البروتين ملزم رنا (رببدب)، الذي يجمع الملاحظات المنشورة ¹⁰ .

على الرغم من أن هذه النهج في المختبر هي أدوات قوية، فإنها تحدد الحواف الحمض النووي الريبي ملزمة من تجمع الحمض النووي الريبي معين من تسلسل، وبالتالي فهي محدودة في قدرتها على اكتشاف رنا المستهدفة الجديدة. وينطبق الشيء نفسه على الاستراتيجيات الحسابية للتنبؤ بالممارسات التجارية التقييدية على نطاق الجينوم، والتي تقوم على حفظ تسلسل البروتين والبنية ¹⁵ . للتغلب على هذا، طريقة تجريبية جديدة هاتم تأسيسها التي تسمح لتحديد زخارف الحمض النووي الريبي أن تتفاعل ربب الفائدة مع، وكذلك لتحديد الموقع الدقيق للالتزام. هذه الطريقة، ودعا "يشابك ومناعي" (كليب)، ويتألف من في الجسم الحي الأشعة فوق البنفسجية يشابها تليها مناعي ¹¹ . وقد أظهرت الدراسات المبكرة أن فوتواكتيفاتيون من الحمض النووي والنيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي يمكن أن تحدث في موجات الأشعة فوق البنفسجية الإثارة أكبر من 245 نانومتر. التفاعل من خلال ثيميدين يبدو أن يفضل (رتبة في الترتيب من انخفاض النشاط الضوئي: دت ≥ دك> رو> رك، دا، دغ) ¹² . باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع طول موجة من 254 نانومتر (أوف-C)، لوحظ أن الروابط التساهمية بين النيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي ومخلفات البروتين يتم إنشاؤها عندما يكون في مجموعة من عدد قليل من أنغسترومز (Å). وبالتالي تسمى هذه الظاهرة "الصفر طول" تشابك رنا و ربب. هذا يمكن أن يتبعها بروسيس التنقية الصارمة ديور ويث ليتل باكغروند ¹³ ^، ¹⁴ .

وهناك استراتيجية مكملة ل كليب هو الجمع بين في الجسم الحي الأشعة فوق البنفسجية يشابك مع تحديد البروتين لوصف المشهد من الممارسات التجارية التقييدية. وقد تم عزل عدد من هذه البروتينات المرتبطة مرنا الجينوم على نطاق واسع من خلايا الخميرة والخلايا الجذعية الجنينية (إيسس)، وخلايا الخلايا البشرية ( أي HEK293 و هيلا) باستخدام هذا النهج التجريبي الرواية، ودعا "مرنا إنتيراكتوم التقاط" ¹⁸ ^، ¹⁹ ^، ²⁰ ^، ²¹ . وتتكون هذه الطريقة من في الجسم الحي الأشعة فوق البنفسجية يشابها تليها تنقية مرنب والبروتيوميات المستندة إلى مس. من خلال تطبيق هذه الاستراتيجية، تم اكتشاف العديد من رواية "مونلايتينغ" ربس التي تحتوي على ربد غير متعارف عليها، وأصبح من الواضح أن المزيد من البروتينات لديها قدرات ملزمة رنا مما كان مفترضا سابقا"> 15 ^، ¹⁶ ^، ^17. استخدام هذا الأسلوب يسمح للتطبيقات الجديدة والقدرة على الإجابة على الأسئلة البيولوجية الجديدة عند التحقيق الممارسات التجارية على سبيل المثال، على سبيل المثال، وقد بحثت دراسة حديثة لحفظ بروتيوم مرنا ملزمة (ربب الأساسية بروتيوم) بين الخميرة والخلايا البشرية ²² .

وقد وجد بالفعل أن الممارسات التجارية التقييدية النباتية تشارك في النمو والتنمية (على سبيل المثال ، في التنظيم اللاحق للوقت المزهر، والساعة البيولوجية، والتعبير الجيني في الميتوكوندريا والبلاستيك) ²⁴ ^و ²⁵ ^و ²⁶ ^و ²⁷ ^و ²⁸ ^و ²⁹ . وعلاوة على ذلك، يعتقد أنها تؤدي وظائف في العمليات الخلوية التي تستجيب للإجهاد اللاأحيائي (على سبيل المثال، البرد، الجفاف، سالينيتي، و أبسيسيك أسيد (أبا)) ³¹ ^، ³² ^، ³³ ^، ³⁴ . هناك أكثر من 200 الجينات ربب المتوقع في الجينوم أرابيدوبسيس ثاليانا ، استنادا إلى رنا الاعتراف عزر (رم) و K التماثل (خ) تسلسل مجال المجال. في الأرز، لوحظ ما يقرب من 250 ^، ³⁵ ^، ³⁶ . ومن الجدير بالذكر أن العديد من التنبؤات المحتوية على البروتينات تبدو فريدة من نوعها للنباتات (على سبيل المثال، لا أورثولوغ ميتازوان إلى ما يقرب من 50٪ من اربيدوبسيس تنبؤات ربس التي تحتوي على مجال رم) ³⁵ ، مما يشير إلى أن العديد قد تخدم وظائف جديدة. ولا تزال وظائف معظم الممارسات التجارية التقييدية المتوقعة غير معهودة ²³ .

عزل بروتيوم مرنا المرتبطة من شتلات أرابيدوبسيس أتيولاتد، الأنسجة ورقة، الخلايا الجذرية مثقف، و بروتوبلاستس ورقة ميسوفيل من خلال استخداموقد تم الإبلاغ عن مرنا تفاعلية التقاط مؤخرا ³⁸ ^، ³⁹ . وتدل هذه الدراسات على الإمكانية القوية للفهرسة المنهجية للممارسات التجارية التقييدية الوظيفية في النباتات في المستقبل القريب. هنا، نقدم بروتوكول لالتقاط مرنا التفاعلي من بروتوبلاستس النبات ( أي الخلايا دون جدران الخلايا). أرابيدوبسيس ثاليانا ليفس ميسوفيل بروتوبلاستس هي النوع الرئيسي من الخلايا الورقية. بروتوبلاستس معزولة تسمح الوصول الأمثل للضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى الخلايا. ويمكن استخدام هذا النوع من الخلايا في المقايسات التي تعبر عن عابرة البروتينات لتوصيف وظيفي ⁴⁰ ^، ⁴¹ . وعلاوة على ذلك، تم تطبيق بروتوبلاستينغ على العديد من أنواع الخلايا النباتية الأخرى والأنواع ⁴² ^، ⁴³ ^، ⁴⁴ (على سبيل المثال، بيترسون وآخرون ، 2009؛ بارغمان وبيرنبوم، 2010؛ وهونغ وآخرون ، 2012).

تتضمن الطريقة ما مجموعه 11 خطوة ( الشكل 1A ). أرابيدوبسيس أوراق بروتوبلاستس ميسوفيل معزولة أولا (الخطوة 1)، وبالتالي الأشعة فوق البنفسجية المشع لتشكيل مرنبس كروسلينكد (الخطوة 2). عندما يتم تحلل بروتوبلاستس تحت ظروف تغيير طبيعة (الخطوة 3)، يتم الافراج عن مرنبس كروسلينكد في تحلل / العازلة ملزمة وسحبت من قبل أوليغو د (T) ₂₅ الخرز (الخطوة 4). بعد عدة جولات من يغسل صارمة، يتم تنقية مرنبس وتحليلها. يتم هضم الببتيدات التشويه والتحريف من مربس بواسطة بروتين K قبل تنقية مرناس كروسلينكد ويتم التحقق من جودة الحمض النووي الريبي بواسطة كرت-ير (الخطوات 5 و 6). بعد العلاج ريبونوكلياز وتركيز البروتين (الخطوة 7)، يتم التحكم في جودة البروتين بواسطة سدز بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (سدز-بادج) والفضة تلطيخ (الخطوة 8). الفرق في أنماط الفرقة البروتين يمكن بسهولة أن تصور بين عينة كروسلينكد (كل) وعينة غير كروسلينكد (غير كل؛عينة السيطرة السلبية من بروتوبلاستس التي لا تتعرض للأشعة فوق البنفسجية التشعيع). ويتحقق تحديد البروتينات من خلال البروتيوميات التي تستند إلى مس. يتم فصل البروتينات من عينة كل من هلام بولي أكريلاميد الكهربائي واحد الأبعاد (1D-بادج) لإزالة التلوث الخلفية المحتملة، هي "في هلام هضمها" إلى الببتيدات قصيرة باستخدام التربسين، وتنقيتها (الخطوة 9). نانو عكس المرحلة اللوني السائل إلى جانب مطياف الكتلة (نانو-لك-مس) يسمح لتحديد كمية من البروتينات نهائية في بروتيوم مرنا ملزمة (الخطوة 10). وأخيرا، يتم وصف المربس المحددة وفهرسة باستخدام التحليل المعلوماتية الحيوية (الخطوة 11).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. أرابيدوبسيس ليف ميسوفيل بروتوبلاست العزلة

ملاحظة: بروتوبلاستس نبات أرابيدوبسيس ميسوفيل معزولة أساسا كما وصفها يو وآخرون ، 2007، مع العديد من التعديلات ⁴⁰ .

نمو النباتات
1. نقع ما يقرب من 200 أرابيدوبسيس ثاليانا كول-0 البذور النمط الايكولوجي في الماء المعقم لمدة 2 أيام عند 4 درجات مئوية في الظلام لطبقية.
  ملاحظة: هذا العدد من البذور يكفي لعينة واحدة غير كل عينة واحدة كل (انظر الخطوة 1.3).
2. إعداد الأواني مع 50٪ ( الخامس / الخامس ) خليط من التربة والفيرميكوليت ونقع الأواني بالماء المقطر في علبة لترطيب التربة.
3. زرع وتوزيع البذور الطبقية على التربة الرطبة. لا تغطي البذور مع التربة إضافية لأن بذور أرابيدوبسيس تحتاج إلى ضوء لإنبات.
  ملاحظة: ظروف نمو النبات هي 12 ساعة ضوء / 12 ساعة في الظلام دورة في 23 درجة مئوية،مع شدة الضوء من 100 ميكرومول م ^-2 ث ^-1 ، في غرفة نمو لمدة 5 أسابيع قبل المزهرة. ويمكن أيضا أن تستخدم النباتات 4 أسابيع من العمر ⁴⁰ .
  ملاحظة: جميع المواد الموصوفة والكواشف من الخطوة 1.2.1 إلى الخطوة 3.2.3 هي لعينتين ( أي عينة واحدة غير كل (عينة السيطرة التي لا تتعرض للأشعة فوق البنفسجية-C التشعيع) وعينة واحدة كل (البحث العينة التي تتعرض للأشعة فوق البنفسجية- C التشعيع)).
إعداد حل إنزيم متساوي التوتر
1. جعل 80 مل من محلول انزيم متساوي التوتر الأساسي (400 ملي مانيتول، 20 ملي بوكل، و 20 ملي العازلة ميس (الرقم الهيدروجيني 5.7)) وعلى الفور تسخين الحل في حاضنة 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
2. إضافة 1.2 غرام من سيلولاز R10 ( ث / V 1.5٪) و 0.32 غرام من ماكيروزيمي R10 ( ث / V 0.4٪) مسحوق إلى حل الإنزيم متساوي التوتر الأساسي الدافئ.
3. تقديم بعناية مسحوق الانزيم إلى حل عن طريق تطبيق التحريك لطيف. موسيقى الرابتسخين الخمول الحل في حاضنة 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة حتى أن حل الإنزيم هو البني الفاتح واضحة.
4. تبريد الحل على الجليد لمدة 3 دقائق وإضافة 800 ميكرولتر من 1 M كاكل ₂ و 800 ميكرولتر من 10٪ ( ث / ت ) بسا إلى الحل.
5. تجانس الحل عن طريق بيبتينغ والتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون. قسامة هذا الحل انزيم متساوي التوتر النهائي إلى اثنين من أطباق بتري على نطاق واسع (150 ملم × 20 ملم).
إعداد أرابيدوبسيس شرائط ورقة روزيت
ملاحظة: ينصح 150 أوراق لكل طبق بتري لعينة واحدة غير كل أو عينة كل واحد.
1. اختيار وخفض ما مجموعه 300 توسعت بشكل كامل 2 ^ند - أو 3 ^أردي -pair صحيح يترك (متوسط: 3 - 4 في روزيت) إلى 0.5- إلى 1 ملم شرائط ورقة باستخدام رازوربليد جديدة وحادة.
2. نقل وغمر شرائط على الفور في حل انزيم متساوي التوتر.
  ملاحظة: لتجنب أي اتصال مع الضوء، دائما تغطية رانه أطباق بتري مع رقائق الألومنيوم. لا سحق الأوراق. تأكد من أن جميع الشرائط مغمورة في الحل ولا تطفو على السطح.
عزل أرابيدوبسيس ورقة الأوراق ميسوفيل
1. وضع رقائق الألومنيوم بتري المغطاة أطباق في فراغ ديسيكاتورس والتسلل شرائط ورقة تحت فراغ لمدة 30 دقيقة. وفي وقت لاحق، احتضان أطباق بتري في الظلام دون اهتزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 2.5 ساعة.
2. بلطف وإيجاز يهز الأطباق أفقيا باليد، في محاولة للافراج عن بروتوبلاستس تماما في حل الانزيم.
حصاد و عد بروتوبلاستس
1. تصفية تعليق بروتوبلاست من خلال شبكة 35 إلى 75 ميكرون النايلون. قسامة الترشيح من كل عينة إلى اثنين من 50 مل أنابيب جولة القاع (حوالي 20 مل من الترشيح في كل أنبوب).
2. شطف كل طبق بتري مع 10 مل من العازلة W5 (154 ملي كلوريد الصوديوم، 125 ملي كاكل 2، 5 ملي بوكل، و 2 ملي العازلة ميس (الرقم الهيدروجيني 5.7)) لنقل بقية بروتوبلاستس إلى حل الانزيم. إضافة هذا الترشيح 10 مل من كل عينة إلى الأنابيب. تغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم والاحتفاظ بها على الجليد.
3. تدور جميع الأنابيب الأربعة لمدة 5 دقائق في 100 x ج إلى بيليه بروتوبلاستس. تجاهل طاف و ريسوسبيند بلطف الكريات بروتوبلاست في كل أنبوب مع 10 مل من W5 العازلة.
  ملاحظة: عند إعادة تعليق الكريات بروتوبلاست، عكس بلطف أنبوب رأسا على عقب وتدور بلطف الأنبوب باليد حتى الكريات قد اختفت. لا ماصة بيليه مباشرة لتجنب إتلاف الخلايا.
4. كرر الخطوة 1.5.3 مرة واحدة والجمع بين تعليق بروتوبلاست من أنبوبين من كل عينة في أنبوب 50-مل جولة القاع. إبقاء الأنابيب على الجليد.
5. عد بروتوبلاستس باستخدام عدادة الكريات.
  ملاحظة: كل 20 خلايا داخل 25 مكعبات يساوي 2 × 10 ⁵ بروتوبلاستس / مل. يجب أن يترك 150 أوراق ما يقرب من 1 × 10 ⁷ خلايا.تعديل للحصول على عدد إجمالي متساوية من بروتوبلاستس في عينات غير كل و كل.
6. الحفاظ على بروتوبلاستس على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، تدور الأنابيب لمدة 5 دقائق في 100 × ز. تجاهل طاف و ريسوسبيند بروتوبلاستس في كل أنبوب مع 20 مل من محلول مغ (400 ملي مانيتول، 15 ملي مغكل ₂ ، و 4 ملي ميس العازلة (درجة الحموضة 5.7)).

2. في فيفو مرنا البروتين كروسلينكينغ بواسطة الأشعة فوق البنفسجية التشعيع

ملاحظة: الحفاظ على أنبوب العينة غير كل على الجليد. يجب أن تكون العينة كل على الفور الأشعة فوق البنفسجية المشع.

نقل تعليق بروتوبلاست تحتوي على 1 × 10 ⁷ خلايا من أنبوب عينة كل إلى طبق بتري جديد على نطاق واسع (150 مم × 20 مم) وإضافة 30 مل من محلول مغ الباردة الجليد لتغطية سطح اللوحة. نشر الخلايا في المخزن المؤقت مغ كله عن طريق بيبتينغ لطيف. وضع على الفور طبق بتري دون الغطاء العلوي في جهاز يشابك الأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة: الارتفاع بين مصباح الأشعة فوق البنفسجيةوطبق بتري هو 8 سم.
إشعاع العينة مع 254 نانومتر الطول الموجي ضوء الأشعة فوق البنفسجية و 0.00875 W / سم ² كثافة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 1 دقيقة، 3 دقائق، أو 5 دقائق. بعد التشعيع، قسامة بسرعة تعليق بروتوبلاست إلى اثنين جديدة 50 مل أنابيب جولة القاع. غسل الجزء السفلي من الطبق مع 5 مل إضافية من محلول مغ الباردة الجليد لجمع ما تبقى من بروتوبلاستس وإضافة تعليق الخلية لهذه الأنابيب اثنين.
ملاحظة: تم اختيار 1 دقيقة كشرط الأمثل. ويمكن الاطلاع على التفسير في النتائج ممثل .

3. تحلل بروتوبلاست تحت ظروف تغيير طبيعة

إعداد الكريات بروتوبلاست لتحلل
1. تدور أنبوب العينة غير كل جنبا إلى جنب مع اثنين من أنابيب عينة كل من الخطوة 2 في 100 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. وضع أنبوب من غير كل عينة بروتوبلاست بيليه مرة أخرى على الجليد.
2. إضافة 10 مل من محلول مغ الباردة الجليد لكل أنبوب عينة كل، جينتلي ريسوسبيند الكريات، والجمع بينهما مرة أخرى في واحد 50 مل أنبوب جولة القاع. تدور الأنبوب في 100 x ج لمدة 5 دقائق. بعد إزالة طاف، والحفاظ على كل عينة أنبوب بروتوبلاست بيليه على الجليد.
بروتوبلاست تحلل و التجانس بروتوبلاست المحللة
1. إضافة 9 مل من الجليد تحلل الباردة / ملزمة عازلة (500 ملي ليكل، 0.5٪ ( ث / ت ) ليثيوم دوديسيل كبريتات (ليدز)، 5 ملي ديثيوثريتول (دت)، 20 ملي تريس هكل (درجة الحموضة 7.5)، و 1 ملم إدتا (الرقم الهيدروجيني 8.0)) إلى بيليه الخلية من كل عينة. تقريبا ليز بروتوبلاستس التي بيبتينغ صعودا وهبوطا حوالي 20 مرة حتى تعليق أخضر متجانس الضوء.
2. تمرير المحللة بروتوبلاست مرتين من خلال حقنة الزجاج 50 مل مع إبرة ضيقة (0.9 × 25 مم ² ) للتجانس. احتضان المحللة على الجليد لمدة 10 دقيقة. تجميد المحللات في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.

4. مرنب سحب إلى أسفل وتنقيةمن قبل أوليغو-د (T) ₂₅ الخرز

ملاحظة: جميع المواد الموصوفة التالية والكواشف، من الخطوة 4.1 إلى الخطوة 4.4، هي فقط لعينة واحدة ( أي عينة واحدة غير كل أو عينة كل واحد). يجب أن يضاف المحللة بروتوبلاست فورا إلى الأنابيب التي تحتوي على الخرز بعد تحلل طاف حبة / المخزن المؤقت ملزمة.

إعداد أوليغو-د (T) ₂₅ الخرز المغناطيسي لل أوليغو (دت) التقاط
1. ذوبان الجليد المجمدة بروتبلاست المحللة في درجة حرارة الغرفة. عندما يتم ذوبان المحللة تماما، والحفاظ على أنبوب من المحللة على الجليد.
2. قسامة 1.8 مل من أوليغو-د (T) ₂₅ الخرز المغناطيسي (5 ملغ / مل) في 6 أنابيب 2-مل جولة ميكروسنتريفوج جديدة جولة على الجليد. في كل أنبوب، وغسل تعليق حبة متجانس مع 600 ميكرولتر من تحلل / العازلة ملزمة قبل بيبتينغ لفترة وجيزة صعودا وهبوطا وتدوير بلطف في 4 درجات مئوية لمدة 2 دقيقة. الحفاظ على الخرز على الجليد.
ربط
1. مكانكل 6 أنابيب تحتوي على الخرز في رف المغناطيسي في 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق، الأمر الذي سيؤدي إلى التقاط المغناطيسي من الخرز وتطهير التعليق.
  ملاحظة: عندما توضع الأنابيب في رف المغناطيسي، والانتظار حتى يتم القبض على الخرز تماما، على الأقل 3 دقائق.
2. تجاهل طاف وعلى الفور قسامة 9 مل من المحللة بروتوبلاست في هذه الأنابيب 6. تخلط جيدا من قبل بيبتينغ حتى يظهر تعليق البني متجانسة واحتضان الخرز في المحللة بروتوبلاست في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة عن طريق تطبيق دوران لطيف.
  ملاحظة: يوصى وقت الحضانة من 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
غسل
1. وضع أنابيب مرة أخرى في الرف المغناطيسي في 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. عندما يتم القبض على جميع الخرز على الجانب من الأنابيب، وجمع المحللة بروتوبلاست في 6 أنابيب 2-مل جولة ميكروسنتريفوج جديدة القاع وتخزينها مؤقتا في 4 درجات مئوية. لا تجاهل بروستوبلاست المحللة على الفور. والحفاظ على المحللةعند 4 درجات مئوية.
2. إضافة 1.5 مل من العازلة غسل الجليد الباردة 1 (500 ملي ليكل، 0.1٪ ( ث / ت ) ليدس، 5 ملي دت، 20 ملي تريس هكل (درجة الحموضة 7.5)، و 1 ملي إدتا (الرقم الهيدروجيني 8.0)) إلى الخرز في كل أنبوب. ريسوسبيند الخرز وتطبيق دوران لطيف لمدة 1 دقيقة. وضع أنابيب مرة أخرى في الرف المغناطيسي في 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق وتجاهل طاف. كرر هذه الخطوة غسل مع غسل العازلة مرة واحدة.
3. كرر نفس الإجراء من هذه الخطوة غسل مرتين باستخدام 1.5 مل من الجليد غسل الباردة العازلة 2 (500 ملي ليكل، 5 ملي دت، 20 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.5)، و 1 ملي إدتا (الرقم الهيدروجيني 8.0)) وبمجرد استخدام 1.5 مل من الجليد الباردة منخفضة الملح العازلة (200 ملي ليكل، 20 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.5)، و 1 ملي إدتا (الرقم الهيدروجيني 8.0)).
  ملاحظة: إذا تم عزل مرنبس بكفاءة من المحللة بروتوبلاست، يجب أن يكون هناك "هالة" مرئية حول بيليه حبة في العينة كل خلال خطوة غسل مع غسل العازلة 2 ( الشكل 1B ).
شطف
1. إضافة 500 ميكرولترمن العازلة شطف (20 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.5) و 1 ملي إدتا (الرقم الهيدروجيني 8.0)) إلى الخرز في كل أنبوب. ريسوسبيند بلطف الخرز واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 3 دقائق للافراج عن بولي (A) رنا-تايليد. ريسوسبيند بلطف الخرز مرة واحدة بيبتينغ. وضع أنابيب مرة أخرى في الرف المغناطيسي في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
2. نقل والجمع بين جميع خيوط (حوالي 3 مل في المجموع) إلى نظيفة، معقم ريبونوكلياز الحرة، 15 مل أنبوب مخروطي القاع على الجليد.
  ملاحظة: يمكن تحديد نوعية وكمية من الحمض النووي الريبي على الفور باستخدام جهاز الطيف الضوئي.
  ملاحظة: تركيز الحمض النووي الريبي لكل عينة حوالي 10 نانوغرام / ميكرولتر، مع A ₂₆₀ / A ₂₈₀ نسبة 1.9. وينبغي أن تكون نسبة A ₂₆₀ / A ₂₈₀ بين 1.6 و 2.0 لأن رنا المعزولة بولي (A) -Tilted عادة ما تكون أكبر من 70٪ نقية. إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي منخفض جدا، وزيادة عدد بروتوبلاستس بدءا إلى حد أقصى قدره 10 ⁹ . عيناتيمكن تجميدها في النيتروجين السائل والاحتفاظ بها في 80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
3. كرر الخطوة 4.2 إلى الخطوة 4.4 لجولتين إضافية وإعادة استخدام حبات صغيرة (T) ₂₅ لاستنفاد رنا من بولي (A) -Tilted من المحللة بروتوبلاست.
  ملاحظة: بعد ثلاث جولات من الإجراء المنسدلة، يجب أن يكون هناك ما مجموعه 9 مل من إلونت لكل عينة غير كل أو كل. أداء جميع الأعمال في 4 درجات مئوية لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي. اتبع الخطوة 4.5 أو الخطوة 4.6 لإعادة استخدام أو تجديد الخرز.
إعداد إعادة استخدامها أوليغو-د (T) ₂₅ الخرز
1. غسل الخرز مرتين مع 1 مل من العازلة شطف الجليد الباردة ومرة واحدة مع 1 مل من الجليد الباردة تحلل / العازلة ملزمة لضبط تركيز الملح ليكل العودة إلى 500 ملم.
2. اتبع الخطوة 4.1، تجاهل طاف، ونقل المحللة بروتوبلاست المخزنة في كل أنبوب، وكرر الإجراء برمته من الخطوة 4.2 إلى الخطوة 4.4 لجولتين إضافيتين.
تجديد أوليغو-د (T) ₂₅ الخرز
ملاحظة: يمكن تخزين الخرز واستخدامها لتجربة أخرى (الحد الأقصى لإعادة استخدام ثلاث مرات).
1. اتبع الخطوة 4.4، إضافة 1 مل من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى الخرز، واحتضان عن طريق تناوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. لكل أنبوب، وغسل مرتين مع 1 مل من غسل العازلة 1 وثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X (الرقم الهيدروجيني 7.4) تحتوي على 0.1٪ توين 20 لموازنة. الحفاظ على الخرز من كل أنبوب في 300 ميكرولتر من المعقم ريبونوكلياز 1X بس (الرقم الهيدروجيني 7.4) تحتوي على 0.1٪ توين 20 في 4 درجات مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  ملاحظة: الخرز المستخدمة ل أرابيدوبسيس كل عينات في هذه التجربة لا يمكن إلا أن تستخدم لنفس العينات النباتية في المرة القادمة.

5. بروتين K العلاج و مرنا تنقية

بروتين K العلاج
1. إضافة 8 ميكرولتر من محلول بروتين K (2 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى 1 مل من إلوينت من كل عينة لهضم بروتينات الأشعة فوق البنفسجية كروسلينكد. رإيفي دوامة.
مرنا تنقية
1. احتضان شبح في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي لإزالة الملوثات المتبقية.
  ملاحظة: بعد تنقية، و رنا مستعدون لاختبار جودة الحمض النووي الريبي باستخدام فحص كرت-ير.
  ملاحظة: مجموعات أخرى، مثل رنا كيت مصغرة وكاشف تريزول، ويمكن أيضا أن تستخدم ¹⁴ .

6. كرت-ير الفحص

النسخ العكسي
1. تحقيق توليفة فعالة من أول حبلا [كدنا] باستخدام نظام النسخ العكسي، مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي كنموذج. تمييع العينة إلى 5 نانوغرام / ميكرولتر مع المياه نوكليس خالية.
[كدنا] كميا باستخدام [كرت-ير]
1. تضخيم وقياس كدنا باستخدام مزيج الرئيسي قر وفي الوقت الحقيقي سيكلر ير، مع 10 نانوغرام من [كدنا] كقالب. استخدام برنامج ير التالية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة(المرحلة 1، دورة واحدة) و 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (المرحلة 2، 40 دورات).
  ملاحظة: الجين المرجعي المستخدمة هنا كان الجين التحكم الداخلي الذاتية، UBQ10 (AT4G05320). تم وصف الاشعال كرت -ير ل UBQ10 و 18S الريباسي في لي وآخرون ، 2014 ودوروت وآخرون ، 2014، على التوالي ⁴⁵ ^، ⁴⁶ . يتم سرد متواليات التمهيدي في جدول المواد .

7. ريبونوكلياز العلاج و مرب تركيز

العلاج ريبونوكلياز
1. إضافة ما يقرب من 100 U من الكوكتيل ريبونوكلياز التي تحتوي على رناس A و T1 رنيس في 8 مل من إلوينت. وتشمل عينة السيطرة السلبية مع كوكتيل ريبونوكلياز التي يتم استبدالها بخيوط من قبل نوكليس خالية من المياه. دوامة لفترة وجيزة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
تركيز مرب
1. بعد ريبونوكلياز الهضم، والتركيز ونسين وفيرةg وحدات تصفية الطرد المركزي. حجم النهاية هو 75 ميكرولتر، مع العائد الكلي من البروتين ما يقرب من 2 ميكروغرام من كل عينة بعد التركيز. وضع العينات في -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

8. سدز-بادج وفضية تلطيخ

SDS-PAGE
1. مزيج 25 ميكرولتر من خبيرة مركزة (عينة كل) أو عينة السيطرة (عينة غير كل) مع 15 ميكرولتر من 2X صبغ التحميل. تسخين العينة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتحميله على هلام سدز-بادج تحتوي على 5٪ التراص هلام و 12٪ حل هلام، بما في ذلك علامة البروتين.
2. تكثيف البروتينات في 60 V لمدة 40 دقيقة وفصل في 160 V لمدة 1 ساعة تقريبا حتى تصل صبغ التحميل نهاية هلام حل.
الفضة تلطيخ الفحص
1. غسل هلام سدز-بادج مرتين مع الماء عالى النقاء لمدة 5 دقائق في كل مرة. إجراء تلطيخ الفضة من البروتينات باستخدام مجموعة فضية فضية التجارية.
  ملاحظة: يجب أن تظهر العصابات البروتين في غضون 5 دقائق. إذا كانت العصابات مرئية بعد 5 دقائق مع لون خفيف جدا، ويقترح لزيادة عدد بروتوبلاستس بدءا تصل إلى الحد الأقصى من 10 ⁹ .

9. التربسين ديجيست من بروتين العصابات وتنقية الببتيد

تريبسين هضم
ملاحظة: تشغيل هلام 1D-بادج الثاني عن طريق اتخاذ 25 ميكرولتر آخر من محلول مرب المركزة من كل عينة لتحديد مرب؛ لا يمكن استخدام المواد الهلامية الملطخة بالفضة لأنها غير متوافقة مع تحليل مس.
1. بعد تشغيل هلام 1D-بادج، إصلاح هلام في حل التثبيت (50٪ ( V / V ) الميثانول و 10٪ ( الخامس / الخامس ) حمض الخليك) لمدة 1 ساعة. وصمة عار هلام في محلول وصمة عار (0.1٪ ( ث / ت ) كوماسي بريليانت الأزرق R-250، 50٪ ( V / V ) الميثانول، و 10٪ ( V / V ) حمض الخليك) لمدة 20 دقيقة مع الهز لطيف. إزالة الجل في محلول ديستين (40٪ ( v / v ) الميثانول و 10٪ ( v/ v) حمض الخليك) لمدة 1 ساعة. بعد ديستينينغ، والحفاظ على هلام في 5٪ ( الخامس / الخامس ) حمض الخليك.
  ملاحظة: خلال ديستينينغ، ديستين الحل الجديد يمكن استبدالها حتى الخلفية تماما.
2. قطع العصابات من الفائدة من هلام. قطع العصابات أبعد من ذلك إلى قطع من حوالي 1 ملم ³ لالاحقة التريبسين الأمثل الهضم واستخراج الببتيدات. هيدرات قطع هلام مع 50 ميكرولتر من 100 ملي بيكربونات الأمونيوم (نه ₄ هكو ₃ ) لمدة 10 دقيقة. تغطية قطع هلام تماما.
  1. إزالة الحل مرطب بعناية وتجفيف قطع هلام مع أسيتونتريل (تش ₃ ن) لمدة 10 دقيقة. إزالة بعناية حل أسيتونتريل.
  2. كرر العملية من الترطيب إلى الجفاف مرتين. أخيرا، إزالة الحل أسيتونتريل.
    ملاحظة: وقت تشغيل هلام يعتمد على الغرض من التجربة. على المدى الطويل مرات يسمح فصل جيد من البروتينات، وبالتالي فإن هلام محدد ملون الحظردس يمكن قطع لمزيد من التحليل. إذا كان الغرض هو الحفاظ على البروتينات وإزالة الملوثات، وقت قصير يكفي.
3. إضافة 500 ميكرولتر من 6.6 ملي حل دت واحتضان قطع هلام لمدة 10 دقيقة. إزالة حل دت وغسل قطع هلام مرتين مع 500 ميكرولتر من 95٪ ( الخامس / الخامس ) حل أسيتونتريل.
  1. بعد الغسيل، وإزالة الحل أسيتونتريل واحتضان قطع هلام مع 500 ميكرولتر من 55 ملي حمض اليودواسيتيك (إيا) حل لمدة 10 دقيقة في الظلام.
  2. بعد الحضانة، وإزالة الحل وغسل قطع هلام مرة أخرى مع 500 ميكرولتر من 95٪ ( الخامس / الخامس ) حل أسيتونتريل. تجفيف قطع هلام.
4. تضمين قطع هلام تماما مع 25 ميكرولتر من الهضم العازلة (50 ملي نه ₄ هكو ₃ ، 5 ملي كاكل ₂ ، و 6 نانوغرام / ميكرولتر التربسين) والحفاظ على الجليد لمدة 45 دقيقة للسماح لل التربسين تتخلل في هلام. احتضان قطع هلام بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ل أر الهضم الزماوي.
تنقية الببتيد
1. إضافة 80 ميكرولتر من 50 ملي نه ₄ هكو ₃ إلى قطع هلام في العازلة الهضم ودوامة مرارا لاستخراج الببتيدات التربرية. جمع استخراج. كرر هذه الخطوة استخراج مرتين مع 80 ميكرولتر من 50٪ ( الخامس / الخامس ) تش ₃ ن و 5٪ ( ت / ت ) حمض الفورميك (فا).
  ملاحظة: يجب أن يكون مجموع استخراج النهائي حوالي 240 ميكرولتر.
2. تجمع وتركيز مقتطفات إلى ما يقرب من 10 ميكرولتر من تركيز فراغ أو ليوفيليزاتيون وإضافة 25 ميكرولتر من 0.1٪ ( الخامس / الخامس ) محلول تريفلورواسيتيك مائي (تفا) الحل. ديسالت العينات مع أعمدة μ-C18، بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
3. أزل الببتيدات مع 4 - 10 ميكرولتر من 60٪ ( ث / ت ) تش ₃ ن و 0.1٪ ( ت / ت ) فا. يجفد (تجميد الجافة) الببتيدات وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى التحليل.

العنوان "> 10. نانو-لك-مس

نانو عكس المرحلة اللوني السائل
ملاحظة: إجراء تحليل لك-مس مع مطياف الكتلة التي هي على الانترنت إلى جانب أداة كروماتوغرافيا السائل. وينبغي أن تكون مجهزة هذا الصك مع عمود C18 (2 ميكرون الجسيمات، 100 Å حجم المسام، و 50 ميكرون × 15 سم في البعد).
1. ريسوسبيند الببتيدات مجفف بالتجميد في 16 ميكرولتر من محلول (2٪ ( الخامس / الخامس ) تش ₃ ن و 0.1٪ ( ت / ت ) فا). حقن وتحميل 5 ميكرولتر من محلول الببتيد بمعدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة على بريكولومن C18 (3 ميكرون حجم الجسيمات، 100 Å حجم المسام، نانوفيبر، و 75 ميكرون × 2 سم في البعد).
2. 10.1.2. فصل الببتيدات باستخدام التدرج 95 دقيقة مع معدل تدفق 300 نل / دقيقة. خلال هذا الفصل التدرج، وزيادة المرحلة المتنقلة B من 4٪ إلى 10٪، 10٪ إلى 25٪، و 25٪ إلى 45٪ في 5 دقائق و 50 دقيقة و 18 دقيقة، على التوالي. وأخيرا، زيادة حاد في المرحلة المتنقلة B إلى 95٪ في 1 دقيقة. بعدكل التدرج الانفصال 95 دقيقة، وتطبيق خطوة شطف المتأصلة التي تحتوي على التدرج 10 دقيقة من 4٪ إلى 95٪ في 5 دقائق.
  ملاحظة: المرحلة تليفون A هي 99.9٪ H ₂ O و 0.1٪ (ت / ت) اتحاد كرة القدم، والمرحلة المحمول B هو 19.92٪ H ₂ O، و 80٪ (ث / ت) CH ₃ CN، و 0.08٪ (ت / ت ) فا.
قياس الطيف الكتلي
1. تشغيل مطياف الكتلة في وضع تعتمد على البيانات مع مجموعة واسعة من 400 إلى 1600 متر / ض.
2. حدد ما يصل إلى عشرة من الأيونات الأكثر كثافة في MS1 لتوليد أطياف تجزؤ. تعيين القرار إلى 70،000 عرض كامل في نصف أقصى (فوهم) ل MS1 و 17،000 ل MS2، مع هدف التحكم التلقائي (أغك) من 3،000،000 و 1،000،000 الأيونات والحد الأقصى لوقت الحقن أيون (إيت) من 256 و 64 مللي ثانية ل MS1 و MS2، على التوالي.
3. تعيين استبعاد الديناميكي إلى 10 ثانية لتجنب تكرار تجزئة الأيونات الأكثر وفرة.
  ملاحظة: هنا، الأيونات مع واحد أو أكثر من ست رسوم هي همستبعدة ل MS2.
بروتيوميكس النوعي: الببتيد والبروتين تحديد الهوية
1. تحليل أطياف تجزئة باستخدام البرمجيات مثل الذروة استوديو البرمجيات ⁴⁷ ^، ⁴⁸ ^، ⁴⁹ .
  ملاحظة: حزم البرامج الأخرى وتتوفر أيضا لتحديد الببتيد، مثل نوفوهم ³⁰ و بيبنوفو ³⁷ للتسلسل دي نوفو و سيكست ⁵⁴ و ماسكوت ⁵⁵ للبحث قاعدة البيانات.
2. الجمع بين الأطياف مع نفس الكتلة (<2 جزء في المليون الفرق) والاحتفاظ مرات (<2 دقيقة) والاحتفاظ فقط أطياف مع عتبة الجودة أعلى من 0.65 للبحث في قاعدة بيانات السويسري بروت (الإصدار: ديسمبر 2013) لمجموعة التصنيف إلى نموذج نبات أرابيدوبسيس ثاليانا . استخدام معلمات البحث التالية: التسامح الشامل السلائف من 10 جزء في المليون من خلال استخدام مونكتلة النظائر. والتسامح الشامل جزء من 20 مليمو؛ التربسين كما انزيم الهضم، بحد أقصى 2 غاب الانقسامات. الكرباميدوميثيلين السيستين كما تعديل ثابت. الأكسدة الميثيونين كما تعديل متغير. و بحد أقصى 3 تعديلات متغيرة بعد الترجمة لكل الببتيد. بعد تحديد، تعيين يدويا عتبات النتيجة لتحديد موثوق بها الببتيد والبروتين بحيث يتم اكتشاف معدل اكتشاف كاذبة (فدر) <5٪.
بروتيوميكس الكمية: التحليل الإحصائي لبيانات قياس الطيف الكتلي
1. استخدام لك-مس (على سبيل المثال بروجينيسيس) للكمية خالية من التسمية من البيانات البروتينات.
  ملاحظة: ترتبط المناطق ذروة الببتيد MS1 (أو شدة) إلى الببتيدات التي حددها برنامج الاستوديو وفقا لكتلتها، مع الخطأ المسموح به في الحد الأقصى من 10 جزء في المليون.
  ملاحظة: هذا البرنامج بحساب وفرة من الببتيد من خلال دمج مناطق الذروة من جميع الدول تهمة بين 2 <سوب> + و 8 ⁺ . وترتبط البيانات الكمية لتحديد بيكس الببتيد من قبل النصي الداخل (مطابقة كتلة مع الخطأ المسموح به في الحد الأقصى من 10 جزء في المليون).
2. حساب متوسط التغييرات log2 أضعاف (كل / غير كل) لكل الببتيد. مجموعة طيات التغييرات من الببتيدات الفريدة من البروتين.
  ملاحظة: في كل مجموعة، والتغيير النهائي طية من البروتين يساوي متوسط طيات التغييرات من الببتيدات لها.
3. حساب قيمة p باستخدام t -test الطالب لكل مجموعة لتقييم الدلالة الإحصائية. تطبيق حزمة البرامج R (الإصدار 3.3.0) لتصحيح قيم p ل فدر لجميع المجموعات باستخدام طريقة بينجاميني-هوكبرغ (ب).
4. رسم مؤامرة البركان باستخدام حزمة "معايرة" وظيفة (الإصدار 1.7.2) متوافقة مع حزمة البرمجيات R (الإصدار 3.3.0).
  ملاحظة: هنا، قيم-p10 المعدلة -log10 (-log10 (أدج p- قيمة)) هي وظيفة من التغييرات log2 أضعاف جميع البروتينات التي تم تحديدها. البروتينات هيتعامل كضربات إيجابية في بروتيوم مرنا ملزمة إذا كانت التغييرات log2 أضعاف أكبر من 2، مع أو بدون أهمية.

11. كتالوج بروتيوم مرنا محددة التي تم تحديدها

تصنيف البروتينات المحددة من الخطوة 10 إلى ثلاث فئات على أساس عناصر "وظائف الجزيئية والعملية البيولوجية" عن طريق قاعدة بيانات الجينات أونتولوغي (غو) و "الأسرة والمجال" عبر قاعدة بيانات إنتيربرو.
كما تحتوي الفئة الأولى، أو "البروتينات الريبوسومية"، على جميع البروتينات الريبوسومية الكشف عنها، وتحديد البروتينات من الفئة الثانية، أو "ربس الرئيسية"، كما تحتوي على المجالات البروتين المشروح التي تتفاعل مع رنا أو ربط رنا ملزمة مع وظائف معروفة أو غير معروفة في علم الأحياء الحمض النووي الريبي .
كما البروتينات مع وظائف معروفة أو غير معروفة في علم الأحياء الحمض النووي الريبي دون مجالات مشحونة رنا ملزمة توضع في الفئة الثالثة، أو "المرشحين ربس"، تحديد الإنزيمات من الفئة الثالثة على أساس الشروح من Iقاعدة بيانات نتنز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لاحظنا هالة مميزة، الذي يحيط بيليه حبة في العينة كل، في غسل الخطوة 4.3 مع غسل العازلة 2 ( الشكل 1B ). على الرغم من أنه لم يتم التحقيق، ويمكن تفسير هذه الظاهرة ربما من خلال تدخل المجمعات مرنب كروسلينكد مع حبة التجميع خلال التقاط المغناطيسي، مما تسبب في أكثر انتشارا لتشكيل الكلي. وهو يشير إلى أن أوليغو-د (T) ₂₅ التقاط حبة كانت فعالة ¹⁴ .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طبقنا بنجاح مرنا التقاط إنتيراكتوم، وضعت للخميرة والخلايا البشرية، لزراعة بروتوبلاستس ميسوفيل ورقة. خلايا ميسوفيل ليف هي النوع الرئيسي من الأنسجة الأرضية في أوراق النبات. الميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه يستخدم في الجسم الحي كروسلينكينغ لاكتشاف البروتينات من بيئة فسيولوجية.

في هذا البروتوكول، ونحن أساسا تقديم عدد من الظروف التجريبية الأمثل (على سبيل المثال، وعدد من بروتوبلاستس لاستخدامها كماد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نعترف مختبر البروفيسور جوريس ويندريككس، الذي قدم الأشعة فوق البنفسجية جهاز يشابك مجهزة مصباح الأشعة فوق البنفسجية التقليدية. ويدعم كغ من قبل صندوق أبحاث جامعة ليوفن ويوافق على الدعم من منحة فو G065713N.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي > كواشف < / قوي > 0.8
م مانيتول	سيجما	M1902-500G	محلول إنزيم متساوي التوتر الأولي & حل MMg
2 M KCl	MERCK	Art. 4935	محلول إنزيم متساوي التوتر الأولي & amp W5 عازلة
0.2 M MES (درجة الحموضة 5.7) (4-حمض المورفوليين إيثان سلفونيك)	Sigma-aldrich	M2933	محلول إنزيم متساوي التوتر الأولي ، W5 عازلة & amp MMg الحل ، تعقيم الترشيح
Cellulase R10	Yakult Pharmaceutical Industry Co.، Ltd.	السليولاز " أونوزوكا" R-10 ، 10 جم	محلول إنزيم متساوي التوتر النهائي
Macerozyme R10	Yakult Pharmaceutical Industry Co.، Ltd.	MACEROZYME R-10 ، 10 جرام	محلول إنزيم متساوي التوتر النهائي
10٪ (w / v< / em>) BSA (ألبومين مصل البقر)	Sigma-aldrich	A7906-100G	إنزيم متساوي التوتر النهائي & تعقيم الترشيح
1 M CaCl _{2< / sub>}	Chem-Lab NV	CL00.0317.1000	محلول إنزيم متساوي التوتر النهائي ، W5 عازلة & amp عازلة الهضم
1 M NaCl	Fisher Chemical	S / 3160/60	W5 buffer
2 M MgCl _{2< / sub>}	Sigma	M8266-100G	MMg
حل 1 M LiCl (كلوريد الليثيوم)	Acros	199885000	تحلل / مخزن مؤقت ملزم ، مخزن مؤقت للغسيل 1، مخزن مؤقت للغسيل 2 & عازلة ملح منخفضة
5٪ (w / v< / em>) LiDS (كبريتات ليثيوم دوديسيل)	Sigma-aldrich	L4632-25G	محلول تحلل / مخزن مؤقت ملزم ، مخزن مؤقت للغسيل 1 & amp تعقيم الترشيح
1 M DTT (Dithiothreitol) Thermo	Fisher Scientific Wash Buffer 1 & amp عازلة غسيل 2	307866	تحلل / مخزن مؤقت ملزم ،
1 م Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) (تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان ، حمض الهيدروكلوريك SG (حمض الهيدروكلوريك))	Acros & amp فيشر كيماويات	167620010 & أمبير H / 1200 / PB15	تحلل / مخزن مؤقت ملزم ، مخزن مؤقت للغسيل 1، عازلة غسيل 2، عازلة ملح منخفضة & محلول المحلول
0.5 M EDTA (درجة الحموضة 8.0) (حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك)	Sigma-aldrich	ED-500G	محلول تحلل / مخزن مؤقت ملزم ، مخزن مؤقت للغسيل 1، عازلة غسيل 2، عازلة ملح منخفضة & Elution buffer
Tween 20	MERCK	8.22184.0500	تجديد حبات oligo-d (T) _{25< / sub>}
0.1 M NaOH	VWR PROLABO	CHEMICALS 28244.295	تجديد حبات oligo-d (T) _{25< / sub>}
1x PBS (درجة الحموضة 7.4) (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) يحتوي على (NaCl ؛ KCl. Na₂HPO₄; KH₂PO₄) Fisher	Chemical, MERCK, Sigma-aldrich & amp; SAFC	S / 3160 / 60 ، المادة 4935 ، 71640-250G & 60230	تجديد أوليغو د (T) _{25< / sub> حبات}
محلول البروتيناز K (2 & mu; ز /&مو; L)	Thermo Fisher Scientific	11789020	البروتين هضم
التحميل صبغة	Invitrogen	LC5925	SDS-PAGE
qPCR ماستر ميكس	Promega	A6001	qRT-PCR
RNase كوكتيل	ثيرمو فيشر العلمي	AM2286	هضم الحمض النووي الريبي
الميثانول	سيجما ألدريتش	322415	الجل وإزالة
حمض الخليك	Sigma-aldrich	537020	تثبيت الجل وإزالة الجل
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Fisher Scientific	20278	تلطيخ
جل 1 M NH_{4< / sub>HCO₃ (بيكربونات الأمونيوم)}	سيجما ألدريتش	09830-500 جرام	ترطيب جل وأمبير عازلة الهضم
CH_{3< / sub>CN (أسيتونيتريل)}	سيجما ألدريتش	34851-100 مل	جل الجفاف & amp محلول إذابة الببتيد
IAA (حمض اليودوأسيتيك)	Sigma-aldrich	I4386-10G	عامل الألكلة
TFA (حمض ثلاثي فلورو أسيتيك)	Sigma-aldrich	302031-10X1ML	محلول إذابة الببتيد
FA (حمض الفورميك)	Sigma-aldrich	06554-5G	استخراج الببتيد
محلول التربسين (6 نانوغرام /&mu ؛ L)	Promega	V5280	العازلة الهضمية
<قوية>الاسم	<قوي>الشركة	<قوي>رقم الكتالوج	تعليقات
EQUIPMENT
Soil	Peltracom	LP2D	نمو النبات
الفيرميكوليت 3	سيبلي طبق	لنمو	النبات 05VERMICULIET
(150 × 20 مم)	Sarstedt	82.1184.500	حامل لتعليق البروتوبلاست
0.22 & mu; مرشح m	Millipore	SE2M229104	تجانس محلول الإنزيم متساوي التوتر النهائي
شرائط أوراق Rosette Razorblade	Agar Scientific	T585
35-75 & mu ؛ م شبكة نايلون	SEFAR NITEX	74010	ترشيح تعليق Protoplast
50 مل أنابيب القاع المستديرة	Sigma-aldrich	T1918-10EA	Carrier لتعليق البروتوبلاست
مقياس الدم (B & uuml ؛ مقياس الدم RKER)	MARIENFELD	650030	جهاز التشابك للأشعة فوق البنفسجية لعدد الخلايا البروتوبلاست
(HL-2000 HybriLinker)	UVP، LLC	UVP95003101	in vivo< / em> مصباح الأشعة فوق البنفسجية المتشابك
(Sankyo-Denki G8T5)	SANKYO DENKI	SD G8T5	in vivo< / em> الأشعة فوق البنفسجية متشابكة
50 مل حقنة زجاجية	FORTUNA Optima	Z314560	تجانس محللة البروتوبلاست
إبرة ضيقة (0.9 × 25 مم)	Becton Dickinson microlance 3	2021-04	تجانس محلول البروتوبلاست
الدوار موديل L26	Labinco BV	26110912	حضانة العينة عن طريق تدوير
الخرز المغناطيسي Oligo-d (T) _{25< / sub> (5 مجم / مل) New}	England BioLabs	S1419S	mRNPs و mRNAs ملزمة و رف مغناطيسي منسدل
	Invitrogen	CS15000	mRNPs و mRNAs ملزمة ومنسدلة
وحدات تصفية الطرد المركزي (وحدات تصفية الطرد المركزي Amicon Ultra-4)	EMD Millipore		تركيز UFC800308 mRBP
بيرس الفضة طقم وصمة عار	Thermo Fisher Scientific	24612	لمقايسة تلطيخ الفضة
(InviTrap Spin Plant RNA مجموعة صغيرة)	الضوئي لتنقية الحمض النووي	الجزيئي 1064100300
STRATEC (مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 1000) جودة			وكمية الحمض النووي الريبي
الحقيقي (StepOne Real-Time PCR cycler)	Thermo Fisher Scientific	4376600	cDNA
القياس الكمي & micro ؛ -C18 columns (Millipore Zip Tip & micro؛ -C18 أعمدة)	Sigma-aldrich	720046-960EA	تنقية الببتيد
مطياف الكتلة (Q هجين Exactive رباعي الأقطاب مطياف الكتلة مطياف الكتلة)	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي
أداة الكروماتوغرافيا السائلة (أداة الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء 3000 Ultimate 3000	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO	البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي
C18 العمود (عمود سهل الرش Pepmap RSLC C18)	Thermo Fisher Scientific	ES800	البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي
C18 العمود المسبق (الإشادة Pepmap 100 C18 precolumn)	Thermo Fisher Scientific	160321	البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي
<قوية > الاسم < / قوية >	<قوية> الشركة	Catalog Number	Comments
Primers for qRT-PCR assay	Sequences
UBQ10 mRNA (Li et al., 2014)	Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTTTTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAGAGATAA
18S rRNA (Durut et al.< / em> ، 2014)	Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA

محلول فحص تثبيت الجل بتري طقم تنقية الحمض النووي الريبي جهاز مقياس الطيف الريبي الحراري في الوقت )

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 533-544 (2015).
Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15 (12), 829-845 (2014).
Lin, Q., Taylor, S. J., Shalloway, D. Specificity and determinants of Sam68 RNA binding. Implications for the biological function of K homology domains. J Biol Chem. 272 (43), 27274-27280 (1997).
Deo, R. C., Bonanno, J. B., Sonenberg, N., Burley, S. K. Recognition of polyadenylate RNA by the poly(A)-binding protein. Cell. 98 (6), 835-845 (1999).
Kattapuram, T., Yang, S., Maki, J. L., Stone, J. R. Protein kinase CK1 alpha regulates mRNA binding by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein c in response to physiologic levels of hydrogen peroxide. J Biol Chem. 280 (15), 15340-15347 (2005).
Patel, G. P., Ma, S., Bag, J. The autoregulatory translational control element of poly(A)-binding protein mRNA forms a heteromeric ribonucleoprotein complex. Nucleic Acids Res. 33 (22), 7074-7089 (2005).
Song, J. K., McGivern, J. V., Nichols, K. W., Markley, J. L., Sheets, M. D. Structural basis for RNA recognition by a type II poly(A)-binding protein. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (40), 15317-15322 (2008).
Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Mol Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
Cook, K. B., Kazan, H., Zuberi, K., Morris, Q., Hughes, T. R. RBPDB: a database of RNA-binding specificities. Nucleic Acids Res. 39, Database issue D301-D308 (2011).
Konig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13 (2), 77-83 (2012).
Hockensmith, J. W., Kubasek, W. L., Vorachek, W. R., von Hippel, P. H. Laser cross-linking of nucleic acids to proteins. Methodology and first applications to the phage T4 DNA replication system. J Biol Chem. 261 (8), 3512-3518 (1986).
Pashev, I. G., Dimitrov, S. I., Angelov, D. Crosslinking proteins to nucleic acids by ultraviolet laser irradiation. Trends Biochem Sci. 16 (9), 323-326 (1991).
Castello, A., et al. System-wide identification of RNA-binding proteins by interactome capture. Nat Protoc. 8 (3), 491-500 (2013).
Nagy, E., Rigby, W. F. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase selectively binds AU-rich RNA in the NAD(+)-binding region (Rossmann fold). J Biol Chem. 270 (6), 2755-2763 (1995).
Hentze, M. W., Preiss, T. The REM phase of gene regulation. Trends Biochem Sci. 35 (8), 423-426 (2010).
Nicholls, C., Li, H., Liu, J. P. GAPDH: a common enzyme with uncommon functions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 39 (8), 674-679 (2012).
Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
Castello, A., et al. Insights into RNA Biology from an Atlas of Mammalian mRNA-Binding Proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 127-133 (2013).
Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6 (10127), 1-9 (2015).
Bailey-Serres, J., Sorenson, R., Juntawong, P. Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complexes. Trends Plant Sci. 14 (8), 443-453 (2009).
Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22 (12), 3142-3152 (2003).
Lim, M. H., et al. A new Arabidopsis gene, FLK, encodes an RNA binding protein with K homology motifs and regulates flowering time via FLOWERING LOCUS C. Plant Cell. 16 (3), 731-740 (2004).
Hornyik, C., Terzi, L. C., Simpson, G. G. The spen family protein FPA controls alternative cleavage and polyadenylation of RNA. Dev Cell. 18 (2), 203-213 (2010).
Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annu Rev Plant Biol. 61, 125-155 (2010).
Schmal, C., Reimann, P., Staiger, D. A circadian clock-regulated toggle switch explains AtGRP7 and AtGRP8 oscillations in Arabidopsis thaliana. PLoS Comput Biol. 9 (3), e1002986(2013).
Staiger, D. RNA-binding proteins and circadian rhythms in Arabidopsis thaliana. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1415), 1755-1759 (2001).
Fischer, B., et al. NovoHMM: a hidden Markov model for de novo peptide sequencing. Anal Chem. 77 (22), 7265-7273 (2005).
Kwak, K. J., Kim, Y. O., Kang, H. Characterization of transgenic Arabidopsis plants overexpressing GR-RBP4 under high salinity, dehydration, or cold stress. J Exp Bot. 56 (421), 3007-3016 (2005).
Raab, S., Toth, Z., de Groot, C., Stamminger, T., Hoth, S. ABA-responsive RNA-binding proteins are involved in chloroplast and stromule function in Arabidopsis seedlings. Planta. 224 (4), 900-914 (2006).
Liu, H. H., et al. Molecular cloning and characterization of a salinity stress-induced gene encoding DEAD-box helicase from the halophyte Apocynum venetum. J Exp Bot. 59 (3), 633-644 (2008).
Wang, S. C., Liang, D., Shi, S. G., Ma, F. W., Shu, H. R., Wang, R. C. Isolation and Characterization of a Novel Drought Responsive Gene Encoding a Glycine-rich RNA-binding Protein in Malus prunifolia (Willd.) Borkh. Plant Mol Biol Report. 29 (1), 125-134 (2011).
Lorkovic, Z. J., Barta, A. Genome analysis: RNA recognition motif (RRM) and K homology (KH) domain RNA-binding proteins from the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 30 (3), 623-635 (2002).
Ambrosone, A., Costa, A., Leone, A., Grillo, S. Beyond transcription: RNA-binding proteins as emerging regulators of plant response to environmental constraints. Plant Science. 182, 12-18 (2012).
Frank, A., Pevzner, P. PepNovo: de novo peptide sequencing via probabilistic network modeling. Anal Chem. 77 (4), 964-973 (2005).
Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Sci Rep. 6 (29766), 1-13 (2016).
Reichel, M., et al. In Planta Determination of the mRNA-Binding Proteome of Arabidopsis Etiolated Seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
Niu, Y., Sheen, J. Transient expression assays for quantifying signaling output. Methods Mol Biol. 876, 195-206 (2012).
Petersson, S. V., et al. An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis. Plant Cell. 21 (6), 1659-1668 (2009).
Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts. J Vis Exp. (36), (2010).
Hong, S. Y., Seo, P. J., Cho, S. H., Park, C. M. Preparation of Leaf Mesophyll Protoplasts for Transient Gene Expression in Brachypodium distachyon. J Plant Biol. 55 (5), 390-397 (2012).
Li, Y., Van den Ende, W., Rolland, F. Sucrose Induction of Anthocyanin Biosynthesis Is Mediated by DELLA. Mol Plant. 7 (3), 570-572 (2014).
Durut, N., et al. A duplicated NUCLEOLIN gene with antagonistic activity is required for chromatin organization of silent 45S rDNA in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (3), 1330-1344 (2014).
Han, Y. H., Ma, B., Zhang, K. Z. SPIDER: Software for protein identification from sequence tags with De Novo sequencing error. J Bioinform Comput Biol. 3 (3), 697-716 (2005).
Han, X., He, L., Xin, L., Shan, B., Ma, B. PeaksPTM: Mass spectrometry-based identification of peptides with unspecified modifications. J Proteome Res. 10 (7), 2930-2936 (2011).
Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Mol Cell Proteomics. 11 (4), 010587(2012).
Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12 (42), 1-12 (2016).
Zhang, Y., et al. Integrative genome-wide analysis reveals HLP1, a novel RNA-binding protein, regulates plant flowering by targeting alternative polyadenylation. CellRes. 25 (7), 864-876 (2015).
Steen, H., Jensen, O. N. Analysis of protein-nucleic acid interactions by photochemical cross-linking and mass spectrometry. Mass Spec Rev. 21 (3), 163-182 (2002).
Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol Syst Biol. 7 (458), 1-13 (2011).
Eng, J., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J Am Soc Mass Spectrom. 5 (11), 976-989 (1994).
Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Oligo dT Arabidopsis Thaliana

مرنا إنتيراكتوم التقاط من بروتوبلاستس النبات

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة