يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

النمذجة سمية اميلويد-β42 ونيوروديجينيريشن في المخ الزرد الكبار

10.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56014

⸱

أكتوبر 25, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1German Centre for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Dresden within Helmholtz Association, 2B CUBE, Center for Molecular Bioengineering, Technische Universität Dresden, 3Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD), TU Dresden

في هذه المقالة

ملخص

ويصف هذا البروتوكول التوليف، وتوصيف، وحقن من الببتيدات β42 اميلويد أحادي لتوليد سمية اميلويد في الزرد الكبار وضع نموذج مرض الزهايمر، تليها تحليلات غذائها والكشف عن التجميعات.

الملخص

مرض الزهايمر (ميلادي) هو المنهكة المرض الأعصاب التي تراكم السامة اميلويد-β42 الببتيدات (Aβ42) يؤدي إلى انحطاط متشابك، التهاب، موت الخلايا العصبية، وتعلم العجز. البشر لا يمكن تجديد الخلايا العصبية المفقودة في حالة الإعلان جزئيا بسبب ضعف القدرات التكاثري للخلايا الجذعية العصبية/السلف (نسبكس) والخلايا تخفيض. ولذلك، ينبغي أيضا أن يعزز كفاءة العلاجات التجدد الانتشار وقدرة العصبية نسبكس. الزرد (دانيو rerio) كائن التجدد، ويمكننا أن نتعلم البرامج الجزيئية الأساسية التي يمكن أن نصمم النهج العلاجي للتصدي للإعلانات. ولهذا السبب، من الضروري توليد نموذج مثل الإعلان في الزرد. استخدام منهجيتنا، يمكننا إدخال المشتقات الاصطناعية من الببتيد Aβ42 مع القدرة على اختراق أنسجة الدماغ الزرد الكبار، وتحليلها باثولوجيا المرض والاستجابة التجدد. ميزة على الطرق القائمة أو نماذج حيوانية الزرد تلك يمكن أن تعلمنا كيف يمكن بطبيعة الحال تجديد دماغ فقاريات، ومما يساعدنا على علاج أمراض الأعصاب البشرية أفضل من خلال استهداف نسبكس الذاتية. ولذلك، طراز اميلويد-سمية في الدماغ الزرد الكبار قد فتح آفاقاً جديدة للبحث في مجال علم الأعصاب والطب السريري. بالإضافة إلى ذلك، يسمح تنفيذ هذا الأسلوب بسيطة لتقييم تجريبية فعالة من حيث التكلفة والكفاءة. ويصف هذه المخطوطة التوليف وحقن من الببتيدات Aβ42 في الدماغ الزرد.

المقدمة

الإعلان هو مرض مزمن تدريجي تتسم بفقدان الخلايا العصبية وسينابسيس في قشرة الدماغ1،2،3،،من45. بصمات لاثيل الكلاسيكي للإعلان هي ترسب الببتيدات اميلويد والتشابك تشكيل نيوروفيبريلاري (NFTs)6. خرف لويحات، يعرف أيضا باسم لويحات اميلويد، تتألف من الببتيدات اميلويد-بيتا (Aβ) التي تشكل هياكل الطيات بيتا في الدماغ حمة5. تراكم Aβ42 في المرضى الإعلانية دور مبكر وحاسم في تطور المرض. إعلان يطلق سلسلة أحداث التي أدت إلى خلل متشابك اللدونة البصر وفقدان الخلايا العصبية7،8،،من910.

الدماغ الكبار من الزرد تيليوست بمثابة نموذجا ممتازا لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية اللدونة11،،من1213،،من1415، 16،،من1718،،من1920 والأمراض المختلفة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، بما في ذلك الإعلان21،22،23 ،24. ونظرا لمجموعة واسعة من الأساليب التجريبية المتاحة19،،من2025،26،27،،من2829، 30 , 31، من هذه الدراسات مفيدة ومجدية. ويمكن تجديد الزرد الجهاز العصبي المركزي13،15،32،،من3334،35،36،37، 38، في جزء منه باستخدام البرامج الجزيئية تفعيلها بعد فقدان الخلايا العصبية19،39،،من4041،،من4243، 44. ولذلك يمكن أن يساعد وضع نموذج مرض الأعصاب في الزرد عنوان رواية أسئلة بشأن التجدد البيولوجيا القدرة، والخلايا الجذعية في أدمغة الفقاريات.

في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير نموذج سمية اميلويد في الدماغ الزرد الكبار عن طريق حقن الاصطناعية Aβ42 الببتيدات (الجدول 1)39. تسبب هذه الحقن تعمل نيوروديجينيريشن يذكرنا بأمراض المخ البشري (مثلموت الخلية، التنشيط ميكروجليال، وانحطاط متشابك والعجز في الذاكرة)، مما يشير إلى أن الزرد يمكن استخدامها للحصول على نيوروديجينيريشن في المخ الزرد، حددت Aβ42 يمكن اكتشاف الببتيدات مع ستاينينجس المناعي، والآليات الجزيئية للتجدد في الزرد البالغين يمكن أن يكون الجهاز العصبي المركزي39. في هذا البروتوكول، ونظهر حقن الببتيدات اميلويد الاصطناعية في الدماغ الزرد استخدام سيريبروفينتريكولار حقن (كفمي) أسلوب27،39،،من4546 لتقليد ترسب اميلويد (الشكل 1). كفمي يوفر طريقة جديدة لإيصال الببتيدات، تجميع عند الحقن كهياكل β-ورقة وممارسة السمية. الببتيدات توزع بالتساوي في جميع أنحاء الدماغ، واستهداف منطقة البطين على طول محور rostro والذيلية كامل45. بالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب لتحليل استجابة الجزيئية والمورفولوجية نسبكس في المخ الزرد الكبار عقب تضمينات اميلويد. هذه الدراسات سوف يتيح لنا نظرة ثاقبة لإصلاح الدماغ الناجح في الثدييات. يمكن استخدام لدينا طريقة لفهم إليه استجابة التجديد الناجح الجزيئية الضرورية بعد الإعلان تشبه أعراض للحث على تجديد الخلايا العصبية المفقودة واستعادة الوظيفية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

هذا البروتوكول إجراء موحد اقترح المبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي (2010/63) و "الجمعية الأوروبية" "نماذج الأسماك" في علم الأحياء والطب (يوفيشبيوميد) في كارلسروه معهد للتكنولوجيا (مجموعة). جميع الأساليب الموصوفة هنا بعد موافقة لجنة الأخلاقيات (درسدن لانديسديريكشن؛ والوثيقة رقم تفف-52/2015)-

1. إعداد الببتيد Aβ42

  1. Synthesize الببتيدات (انظر الجدول 1) باستخدام الكيمياء قياسي 9-فلورينيلميثوكسيكاربونيل (معتدلاً) مع 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- تيتراميثيلورونويومهيكسافلورفوسفاتي (هبتو) ككاشف اقتران المعني المزج الآلي المرحلة الصلبة ببتيد 52. وكان نطاق التوليف 100 µmol-
    2. تحميل
  2. المزج الآلي الببتيد مع 500 ملغ الراتنج المحمية معتدلاً في المرحلة الصلبة (تحميل قدرة 0.2 ميللي مول/غرام). تحميل المذاب الأحماض الأمينية المحمية معتدلاً بتركيز 0.5 متر في الحجم المطلوب ومحسوبة لمركب كل منهما.
    ملاحظة: الحسابات مصنوعة لتمكين اقتران كل من الأحماض الأمينية المحمية معتدلاً مرتين مع فائض 5 مرات في كل كتلة راتنج 47.
  3. حل الكواشف اللازمة لتوليف الببتيد في ديميثليفورماميدي (DMF). على سبيل المثال، إعداد المنشط، هبتو، بتركيز 0.48 م، 45% v/v ميثيلمورفوليني ن (نم) (القاعدة)، و 5% v/v "أنهيدريد الخل" (خليط متوجا) كاب المجموعات الأمينية غير رد.
  4. تهزم جميع الببتيدات من الراتنج بالاختلاط باستمرار دعم متين استخدام المحرض في خليط انقسام طازجة تتكون من حامض Trifluoroacetic (تفا): Triisopropylsilane(TIS): المياه: ديثيوثريتول (DTT) في 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2.5 (m/v)، ل 4 h. استخدام 10 مل لتوليف جدول 100 µmol-
  5. يعجل المنتج ملصوق بإضافة خليط الانقسام إلى 100 مل المثلج إثيل الاثير. تمرير من خلال وحدة ترشيح التي تحتوي على عامل تصفية تترافلوروايثيلين (PTFE) مع حجم مسام ميكرومتر 0.45 والغسيل مع مل 20 المثلج إثيل الاثير.
  6. جمع الببتيد التي تمت تصفيتها من ورق الترشيح وتذوب 100 مغ من سرع من الببتيد في 5 مل منزوع الماء المقطر: الاسيتو الانيتريل 1:1.
  7. نق عن طريق عكس المرحلة اللوني السائل عالي الضغط ([هبلك]) على [هبلك] شبه محضرة مزودة بعمود ديفينيلبينزيني البوليستيرين مسامية من حبة حجم 10 ميكرون.
    1. قبل الحرارة العمود والحفاظ على الأقل 50 درجة مئوية باستخدام عمود تدفئة الجهاز. جمع جميع الكسور الرئيسية استخدام جامع كسر الآلي بتطبيق تدرج من 5% إلى 100% المذيب ب أكثر من 25 دقيقة في 4 مل/دقيقة
      ملاحظة: (أ) المذيبات هو 0.1% هو تفا في الماء والمذيبات ب 0.1% تفا في الاسيتو الانيتريل 52.
    2. رصد chromatogram 220 نانومتر، جمع قمم مناسبة، وتحليل استخدام LC-السيدة
  8. تأكيد النقاء بعكس التحليلي المرحلة العالية الضغط السائل اللوني (أوبلك) 220 نانومتر بالرصد مع جهاز "كشف الأشعة فوق البنفسجية" أثناء مروره العينة من خلال عمود C18 تحليلية (حبة حجم 1.7 ميكرومتر). تأكيد المنتج الببتيد بواسطة الكتلي.
    ملاحظة: يقترن في أوبلك إلى اليكتروسبراي التأين الكتلي (أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد) و "كشف الرباعي جنبا إلى جنب".
  9. ليوفيليزي الصحيح كسور الببتيد المرجوة في قارورة قاع جولة، بتطبيق فراغ من 0.052 [مبر]، على شكل مسحوق رقيق. زوجان مضخة فراغ لوحدة تجميد للاحتفاظ في مخزن ° C.-78 في-80 درجة مئوية، إلى أجل غير مسمى-
  10. استخدام الببتيد المجففة بالتبريد لتحضير حلاً أسهم من 1 ملم في خليط من الاسيتو الانيتريل: DMF: المياه المرتبة التحليلية في 1:1:1 للتجارب. ويمكن تخزين هذا الحل لمدة 6 أشهر على الأقل، كما لا تجميع الببتيدات في هذا الحل-

2. إعداد "الخليط حقن"

  1. إعداد المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) (كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، 10 مم نا 2 هبو 4، 2 مم خ 2 ص 4، ودرجة الحموضة 7.4 ملم 137) لتمييع الببتيدات المجففة بالتبريد.
  2. حل الببتيد بتركيز نهائي من 20 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني. إعداد هذا الحل الطازجة. يخلط جيدا وتخزينها على الجليد حتى الحقن. لا تتجاوز 30 دقيقة لمنع التراكم في الحل-

3. التخدير

  1. تحضير الحل الأسهم من المسكنات، 0.1% إيثيل-m-أمينوبينزواتي ميثانيسولفوناتي (ميساب)، في المياه الأسماك العادية من تعميم النظام. إعداد حل التنويم بتركيز نهائي 0.0025% (v/v)-
  2. إزالة العدد المطلوب من الأسماك من دباباتهم في حاوية نقل مع 5 لتر الماء النظام.
  3. النصف-التعبئة بلاستيكية طبق بتري (90 ملم) مع 40 مل المسكنات. استخدم هذا الطبق لحقن.
  4. احتضان السمك في المسكنات حتى توقف حركة أوبيركولار-

4. Microinjection سيريبروفينتريكولار

  1. إعداد جهاز حقن
    1. تحضير الزجاج حقن الشعيرات الدموية باستخدام ساحبة إبرة مع المعلمات التالية: تدفئة دورة، 537؛ سحب دورة، 250؛ والسرعة، 1.5 s; الوقت، والسيدة 80
    2. جلب إعداد الضغط على مصدر الضغط إلى 25 رطل/بوصة مربعة.
    3. تعيين المعلمات ميكروينجيكتور على ما يلي: إجراء ضغط 20 رطل/بوصة مربعة؛ وإخراج الضغط 10 psi؛ قيمة فترة 2.5 النابضة القيمة 100 السيدة
      4. تحميل
    4. الشعرية الزجاج مع الحل الحقن. إدراج حامل microinjection الشعرية الزجاج. ضبط زاوية الحقن إلى 45°.
      ملاحظة: يمكن بروتوكولات أكثر تفصيلاً كما هو موضح في مراجع 27 ، 46-
  2. الأسماك مكان واحد في طبق بتري جديدة مليئة بالحل التنويم (كما هو الحال في الخطوة 3، 3)-
  3. عقد الأسماك بالملقط والمشرق لحقن.
  4. توليد شق استخدام تلميح إبرة ز 30 في الجمجمة عبر tectum الألياف البصرية حيث تلتقي الألواح الجانبية اثنين. لا تقم بإدراج التلميح إلى أنسجة المخ، ويسبب هذا النزيف والأضرار. انظر مراجع 27 ، ، من 45 46 تفاصيل إضافية-
  5. إدراج الشعرية الزجاج في الشق. استخدام سوى غيض الإبرة
    1. ولم تخترق أكثر من 1 مم من خلال الجمجمة. الحفاظ على الضغط الأسماك وإدراج غيض الزجاج الشعرية من خلال موقع شق.
    2. توجيه غيض الزجاج الشعرية نحو تيلينسيفالون بزاوية 45 درجة. حقن 1 ميليلتر من الحل. تسارع شرط السائل فورا بعد الحقن.

5. استرداد

  1. مكان الأسماك مرة أخرى إلى حاوية نقل حتى أنه يتعافى. توصيل الحاوية للمياه الأسماك المتداولة بشكل منتظم لضمان نوعية المياه الأمثل.
    ملاحظة: ينبغي أن الانتعاش عادة 1 دقيقة. إذا كان الأمر يستغرق وقتاً أطول، الأسماك يجب أن يوضع في المسكنات لفترة أقصر (هذا يحتاج إلى أن يكون الأمثل بالمجرب).

    2. 6. إعداد الأنسجة وسيكتيونينج

    1. الانتظار لفترة زمنية قبل التضحية بالسمك المطلوب.
      ملاحظة: هذا يعتمد على مسألة تجريبية. يمكن رؤية ترسب اميلويد لها في أقرب وقت بعد حقن يوم 1-
    2. التضحية الأسماك باستخدام الأسلوب المناسب تبعاً للقواعد الأخلاقية (مثلاً، علاج الأسماك مع 0.1 [م] مصعب)-
    3. قص فتح الجمجمة أعلاه تكتم الألياف البصرية باستخدام فورسيب أشار في الجهة الظهرية، وتشريح الرأس فقط وراء الزعنفة الصدرية استخدام مشرط.
    4. إصلاح رؤساء استخدام 2% بارافورمالدهيد (PFA) بين عشية وضحاها في 4 مل ° 3 استخدام جيم من منهاج عمل بيجين في الرأس في أنبوب بلاستيكي مع غطاء المسمار.
      تنبيه: ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل مع منهاج عمل بيجين-
    5. كريوبروتيكشن وديكالسيفيكيشن، تغسل الرؤساء ثلاث مرات في 0.1 متر العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4)، ثم تحويلها إلى حل الإيثيلين (يدتا) sucrose/20% 20% واحتضان بين عشية وضحاها في 4 ° C.
    6. لتضمين الأنسجة إلى تقطيع الراتنج، تجميد الرؤوس في محلول السكروز gelatin/20% 7.5 ٪ في قوالب بلاستيكية علم الأنسجة على الثلج الجاف (حوالي 3-5 دقيقة لتجميد كتلة). تخزين العينات في-80 درجة مئوية، أو الاستمرار في الخطوة التالية (كريوسيكتيونينج)-
      7. القسم
    7. إلى الرؤساء إلى 12 ميكرومتر سميكة كريوسيكتيونس استخدام كريوستات ك وصف 28 ، 42. نقل كريوسيكشنز مباشرة على الشرائح الزجاجية وتخزينها في-20 درجة مئوية للاستخدام طويل الأجل-

    7. تلوين المناعي والفحص المجهري

    ملاحظة: جميع الخطوات حضانة في دائرة هوميديفيد. وتوجد جميع خطوات الغسيل لمدة 10 دقائق-

    1. الجاف للفروع لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذوبان الجليد، يغسل الفروع مرتين في برنامج تلفزيوني ومرة في ببستكس (برنامج تلفزيوني مع 0.03% تريتون-X-100)-
    2. إينكوباتي مع جسم الأولية (الأجسام المضادة-Aβ42؛ وتمييع 1: 500 في ببستكس) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد اليوم، ويغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني ومرتين في ببستكس-
    3. احتضان الفروع مع جسم الثانوية (إلى جانب الأسفار الكشف، وتمييع 1: 500) جنبا إلى جنب مع DAPI (1 ميكروغرام/مل) في ببستكس ح 2 في درجة حرارة الغرفة-
    4. يغسل ثلاث مرات في ببستكس. بعد الغسيل النهائي، جبل الشرائح مع ساترة استخدام 100 ميكروليتر 70% والغليسيرول.
    5. الحصول على الصور الفلورية استخدام مجهر [كنفوكل] (على سبيل المثال مع الهدف 20 X PL APO N.A. 0.7 مع مجموعة الإثارة 488 وعامل تصفية خضراء قياسية؛ الشكل 2) 39-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

[هبلك] كان يستخدم لتنقية الببتيد المركب وقد استخدمت الكتلي لتوصيف الببتيدات المنقي بيتا اميلويد. كانت ساخنة العمود [هبلك] إلى 50 درجة مئوية لتحسين فصل الببتيدات Aβ وجمعت جميع الكسور. تحديد الببتيد مركباً بشكل صحيح، أجرى التحليل الطيفي الشامل لجميع الكسور. تشروماتوجرام أوبلك يظهر نقاء المجمع. كذلك تمت معالجة الكسر [هبلك] التي تسفر عن ذروة واحدة في أوبلك (أي، الكتلة الصحيحة لشحن نسبة المطلوبة بيتا اميلويد الببتيد) للتجارب (الشكل 2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمكن تعديل الببتيدات اميلويد لتشمل الاختلافات تسلسل أو العلامات المختلفة. على سبيل المثال، يمكن أن تتولد من ببتيد اميلويد مجمعة، ويمكن المسمى بواسطة العلامات الفلورية في ن-المحطة نهاية الببتيد الببتيدات أو معلم مع الناقل الببتيدات39. وبالمثل، هو الببتيد الناقل في هذا البروتوكول، اختراق الخلية الببتيد آر بسبب فعاليته لنقل البضائع العميق في أنسجة الدماغ39. بالإضافة إلى ذلك، لدينا أسلوب يسمح للحقن وتحليلات من الببتيدات المختلفة التي يمكن أن تسبب السمية تجميعات

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

شكر وتقدير

ودعمت هذا العمل دزني ورابطة هلمهولتز (VH-الحرس الوطني-1021)، الاتفاقية، تو درسدن (FZ-111، 043_261518)، و DFG (KI1524/6) (كورونا)؛ ومن رابطة لايبنتز (شهد-2011-الحكومي-2) والألمانية (بيوليثومورفي 03Z2E512) (Y.Z.). كما نود أن نشكر اولريكي هوفمان لتوليف الببتيد، و Asokan نانديني وبريج موراوالا تاناكا اللي للحصول على مساعدة أثناء تصوير هذا الإجراء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأحماض الأمينية المحمية من FMOCIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz ، ألمانيا)الأحماض الأمينية القائمة على Fmoc لتخليق الببتيد في الطور الصلب (SPPS)
N ، N ، N & prime ؛ N & Prime ؛ -Tetramethyl-O- (1H-benzotriazol-1-yl) سداسي فلورو فوسفات اليورونيوم (HBTU) IRISBiotech GmbH (Marktredwitz ، ألمانيا)RL-1030Activator
OxymaIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz ، ألمانيا)RL-1180Racemization supressor
N ، N-DiisopropylethylamineIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz ، ألمانيا)SOL-003Base
DimethylformamideIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz ، ألمانيا)SOL-004Solvent
N-MethylmorpholineThermo Fisher (Kandel) GmbH ، ألمانياA12158Base
1-Hydroxybenzotriazole (HOBT)Sigma-Aldrich Co. LLC. ( سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية)157260 ALDRICHActivator
PiperidineMERCK KGaA (دارمشتات ، ألمانيا)822299كاشف إزالة الحماية من Fmoc
ثنائي كلورو ميثان (DCM) MERCKKGaA (دارمشتات ، ألمانيا)106050مذيب
حمض الفورميك (FA) MERCKKGaA (دارمشتات ، ألمانيا)100264مكون عازل لحمض
HPLC Trifluoroacetic (TFA) MERCKKGaA ( دارمشتات ، ألمانيا)808260كاشف خليط Clevage
Triisopropylsilane (TIS)MERCK KGaA (دارمشتات ، ألمانيا)233781كاشف خليط ALDRICH Clevage
الأسيتونيتريل (ل UPLC / LCMS)Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH34967-1Lمذيب
الأسيتونيتريل (ل HPLC) VWRInternational Ltd ، إنجلترا83639.320مذيب
ثنائي إيثيل إيثرVWR الدولية المحدودة ، إنجلترا23811.326مذيب لترسيب الببتيد
Dithiotritol (DTT)VWR International Ltd ، إنجلترا0281-25Gكاشف خليط Clevage
TentaGel S RAM Fmoc حلبة التزلج راتنج أميدRapp Polymere GmbH (Tuebingen ، ألمانيا)S30023المرحلة الصلبة لتخليق الببتيد SPPS
محاقن 5 مل مع مرشحات مضمنةIntavis AG (كولونيا ، ألمانيا)34.274أنبوب التفاعل ل SPPS وللتصفية من
مرشح البولي تترافلورو إيثيلينSartorius Stedtim (أوبانيا ، فرنسا)11806-50-Nتصفية الببتيدات المترسبة مرشح
حقنة بولي فينيل فلوريد (PVDF)Carl Roth GmbH + Co. KG KarlsruheKC78.1الترشيح المسبق
لمركب الببتيدIntavis ، كولونيا ، ألمانياResPep SLمركب الببتيد الآلي ذو الطور
الصلب Water Alliance HPLCWaters ، ميلفورد ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةWaters 2998 ، Waters e2695الكروماتوغرافيا السائلة ذات الطور العكسي شبه التحضيري (HPLC)
PolymerX ، حجم حبة 10 & mu ؛ م ، 250 × 10 ممPhenomenex Ltd. ألمانيا00G-4328-N0البوليسترين المسامي ديفينيل بنزين عمود HPLC
Milli-Q Advantage A10 ، مع مرشح Milli-QEMD Millipore Corporation ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةLCPAK0001نظام تنقية المياه
وحدة الترشيحSartorius Stedtim (أوباجن ، فرنسا)16307وحدة الترشيح لهطول الأمطار الببتيد
UPLC Aquity مع كاشف الأشعة فوق البنفسجيةووترز ، ميلفورد ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةM09UPA 664Mالطور العكسي التحليلي فائق HPLC ل LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18 ، حجم الخرزة 1.7 & م ، 50 × 2.1 ممووتر ، ميلفورد ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية186002350العمود التحليلي C18
كاشف ACQUITY TQDetector Waters ، ميلفورد ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةQBB908قياس الطيف الكتلي للتأين بالرش الكهربائي (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH ، ألمانيا16706 ، 101542Lyophilizer مع مضخة فراغ
قارئ لوحة Paradigmبيكمان كولتر
MESAB (إيثيل إم أمينوبنزوات ميثان سولفونات)أطباق Sigma-AldrichA5040
PetriSarstedt821.472
تقنيات الحياة الملحية المخزنة بالفوسفات، GIBCO10010-056
إبرةبيكتون ديكنسون305178
تشريح المجهرأوليمبوس ، لايكا ، يختلف Zeissمع الشركة المصنعة
Dumont TweezersWorld Precision Instruments501985
Gillies DissectingFallps World Precision Instruments501265
الشعيرات الدموية لحقن الزجاجWorld PrecisionInstruments TWF10
PicoNozzleWorld Precision Instruments5430-12
أدوات الدقة العالمية PicoPump الهوائيةSYS-PV820
حلقة الإضاءة ؛ دليل الضوء الدائريباركلاند العلميILL-RLG
CryostatLeicaCM1950
ذو الطور الصلب (PTFE) HPLC

المراجع

  1. LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
  3. Serpell, L. C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
  4. Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer's disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
  5. Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
  6. Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
  7. Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer's disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
  8. McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  9. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  10. Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer's disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
  11. Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
  12. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
  13. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
  14. Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
  15. Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
  16. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
  17. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
  18. Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
  19. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  20. Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
  21. Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer's disease? Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
  22. Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer's disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
  23. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
  24. Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
  25. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  26. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  27. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395(2011).
  28. Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
  29. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  30. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
  31. Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
  32. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
  33. Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
  34. Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
  35. Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
  36. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
  37. Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
  38. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  39. Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
  40. Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
  41. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27(2012).
  42. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
  43. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  44. Katz, S., et al. A Nuclear Role for miR-9 and Argonaute Proteins in Balancing Quiescent and Activated Neural Stem Cell States. Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
  45. Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073(2015).
  46. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415(2013).
  47. Sewald, N., Jakubke, H. Peptides: Chemistry and Biology. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. (2009).
  48. Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
  49. Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
  50. Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
  51. Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
  52. Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

أميلويد بيتا 42تخليق الببتيدتقنية الحقن المجهريالمجهر البؤريالخلايا الجذعية العصبيةنموذج مرض ألزهايمرالتنقية باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداءبروتوكول التجفيف بالتجميدالصبغ الفلوري
النمذجة سمية اميلويد-β42 ونيوروديجينيريشن في المخ الزرد الكبار
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.