ويصف هذا البروتوكول التوليف، وتوصيف، وحقن من الببتيدات β42 اميلويد أحادي لتوليد سمية اميلويد في الزرد الكبار وضع نموذج مرض الزهايمر، تليها تحليلات غذائها والكشف عن التجميعات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
النمذجة سمية اميلويد-β42 ونيوروديجينيريشن في المخ الزرد الكبار
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مرض الزهايمر (ميلادي) هو المنهكة المرض الأعصاب التي تراكم السامة اميلويد-β42 الببتيدات (Aβ42) يؤدي إلى انحطاط متشابك، التهاب، موت الخلايا العصبية، وتعلم العجز. البشر لا يمكن تجديد الخلايا العصبية المفقودة في حالة الإعلان جزئيا بسبب ضعف القدرات التكاثري للخلايا الجذعية العصبية/السلف (نسبكس) والخلايا تخفيض. ولذلك، ينبغي أيضا أن يعزز كفاءة العلاجات التجدد الانتشار وقدرة العصبية نسبكس. الزرد (دانيو rerio) كائن التجدد، ويمكننا أن نتعلم البرامج الجزيئية الأساسية التي يمكن أن نصمم النهج العلاجي للتصدي للإعلانات. ولهذا السبب، من الضروري توليد نموذج مثل الإعلان في الزرد. استخدام منهجيتنا، يمكننا إدخال المشتقات الاصطناعية من الببتيد Aβ42 مع القدرة على اختراق أنسجة الدماغ الزرد الكبار، وتحليلها باثولوجيا المرض والاستجابة التجدد. ميزة على الطرق القائمة أو نماذج حيوانية الزرد تلك يمكن أن تعلمنا كيف يمكن بطبيعة الحال تجديد دماغ فقاريات، ومما يساعدنا على علاج أمراض الأعصاب البشرية أفضل من خلال استهداف نسبكس الذاتية. ولذلك، طراز اميلويد-سمية في الدماغ الزرد الكبار قد فتح آفاقاً جديدة للبحث في مجال علم الأعصاب والطب السريري. بالإضافة إلى ذلك، يسمح تنفيذ هذا الأسلوب بسيطة لتقييم تجريبية فعالة من حيث التكلفة والكفاءة. ويصف هذه المخطوطة التوليف وحقن من الببتيدات Aβ42 في الدماغ الزرد.
المقدمة
الإعلان هو مرض مزمن تدريجي تتسم بفقدان الخلايا العصبية وسينابسيس في قشرة الدماغ1،2،3،،من45. بصمات لاثيل الكلاسيكي للإعلان هي ترسب الببتيدات اميلويد والتشابك تشكيل نيوروفيبريلاري (NFTs)6. خرف لويحات، يعرف أيضا باسم لويحات اميلويد، تتألف من الببتيدات اميلويد-بيتا (Aβ) التي تشكل هياكل الطيات بيتا في الدماغ حمة5. تراكم Aβ42 في المرضى الإعلانية دور مبكر وحاسم في تطور المرض. إعلان يطلق سلسلة أحداث التي أدت إلى خلل متشابك اللدونة البصر وفقدان الخلايا العصبية
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
هذا البروتوكول إجراء موحد اقترح المبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي (2010/63) و "الجمعية الأوروبية" "نماذج الأسماك" في علم الأحياء والطب (يوفيشبيوميد) في كارلسروه معهد للتكنولوجيا (مجموعة). جميع الأساليب الموصوفة هنا بعد موافقة لجنة الأخلاقيات (درسدن لانديسديريكشن؛ والوثيقة رقم تفف-52/2015)-
1. إعداد الببتيد Aβ42
- Synthesize الببتيدات (انظر الجدول 1) باستخدام الكيمياء قياسي 9-فلورينيلميثوكسيكاربونيل (معتدلاً) مع 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- تيتراميثيلورونويومهيكسافلورفوسفاتي (هبتو) ككاشف اقتران المعني المزج الآلي المرحلة الصلبة ببتيد 52. وكان نطاق التوليف 100 µmol- تحميل
- الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
[هبلك] كان يستخدم لتنقية الببتيد المركب وقد استخدمت الكتلي لتوصيف الببتيدات المنقي بيتا اميلويد. كانت ساخنة العمود [هبلك] إلى 50 درجة مئوية لتحسين فصل الببتيدات Aβ وجمعت جميع الكسور. تحديد الببتيد مركباً بشكل صحيح، أجرى التحليل الطيفي الشامل لجميع الكسور. تشروماتوجرام أوبلك يظهر نقاء المجمع. كذلك تمت معالجة الكسر [هبلك] التي تسفر عن ذروة واحدة في أوبلك (أي، الكتلة الصحيحة لشحن نسبة المطلوبة بيتا اميلويد الببتيد) للتجارب (الشكل 2).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن تعديل الببتيدات اميلويد لتشمل الاختلافات تسلسل أو العلامات المختلفة. على سبيل المثال، يمكن أن تتولد من ببتيد اميلويد مجمعة، ويمكن المسمى بواسطة العلامات الفلورية في ن-المحطة نهاية الببتيد الببتيدات أو معلم مع الناقل الببتيدات39. وبالمثل، هو الببتيد الناقل في هذا البروتوكول، اختراق الخلية الببتيد آر بسبب فعاليته لنقل البضائع العميق في أنسجة الدماغ39. بالإضافة إلى ذلك، لدينا أسلوب يسمح للحقن وتحليلات من الببتيدات المختلفة التي يمكن أن تسبب السمية تجميعات
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
شكر وتقدير
ودعمت هذا العمل دزني ورابطة هلمهولتز (VH-الحرس الوطني-1021)، الاتفاقية، تو درسدن (FZ-111، 043_261518)، و DFG (KI1524/6) (كورونا)؛ ومن رابطة لايبنتز (شهد-2011-الحكومي-2) والألمانية (بيوليثومورفي 03Z2E512) (Y.Z.). كما نود أن نشكر اولريكي هوفمان لتوليف الببتيد، و Asokan نانديني وبريج موراوالا تاناكا اللي للحصول على مساعدة أثناء تصوير هذا الإجراء.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأحماض الأمينية المحمية من FMOC | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz ، ألمانيا) | الأحماض الأمينية القائمة على Fmoc لتخليق الببتيد في الطور الصلب (SPPS) | |
| N ، N ، N & prime ؛ N & Prime ؛ -Tetramethyl-O- (1H-benzotriazol-1-yl) سداسي فلورو فوسفات اليورونيوم (HBTU) IRIS | Biotech GmbH (Marktredwitz ، ألمانيا) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz ، ألمانيا) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N ، N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz ، ألمانيا) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz ، ألمانيا) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH ، ألمانيا | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. ( سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (دارمشتات ، ألمانيا) | 822299 | كاشف إزالة الحماية من Fmoc |
| ثنائي كلورو ميثان (DCM) MERCK | KGaA (دارمشتات ، ألمانيا) | 106050 | مذيب |
| حمض الفورميك (FA) MERCK | KGaA (دارمشتات ، ألمانيا) | 100264 | مكون عازل لحمض |
| HPLC Trifluoroacetic (TFA) MERCK | KGaA ( دارمشتات ، ألمانيا) | 808260 | كاشف خليط Clevage |
| Triisopropylsilane (TIS) | MERCK KGaA (دارمشتات ، ألمانيا) | 233781 | كاشف خليط ALDRICH Clevage |
| الأسيتونيتريل (ل UPLC / LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | مذيب |
| الأسيتونيتريل (ل HPLC) VWR | International Ltd ، إنجلترا | 83639.320 | مذيب |
| ثنائي إيثيل إيثر | VWR الدولية المحدودة ، إنجلترا | 23811.326 | مذيب لترسيب الببتيد |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd ، إنجلترا | 0281-25G | كاشف خليط Clevage |
| TentaGel S RAM Fmoc حلبة التزلج راتنج أميد | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen ، ألمانيا) | S30023 | المرحلة الصلبة لتخليق الببتيد SPPS |
| محاقن 5 مل مع مرشحات مضمنة | Intavis AG (كولونيا ، ألمانيا) | 34.274 | أنبوب التفاعل ل SPPS وللتصفية من |
| مرشح البولي تترافلورو إيثيلين | Sartorius Stedtim (أوبانيا ، فرنسا) | 11806-50-N | تصفية الببتيدات المترسبة مرشح |
| حقنة بولي فينيل فلوريد (PVDF) | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | الترشيح المسبق |
| لمركب الببتيد | Intavis ، كولونيا ، ألمانيا | ResPep SL | مركب الببتيد الآلي ذو الطور |
| الصلب Water Alliance HPLC | Waters ، ميلفورد ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية | Waters 2998 ، Waters e2695 | الكروماتوغرافيا السائلة ذات الطور العكسي شبه التحضيري (HPLC) |
| PolymerX ، حجم حبة 10 & mu ؛ م ، 250 × 10 مم | Phenomenex Ltd. ألمانيا | 00G-4328-N0 | البوليسترين المسامي ديفينيل بنزين عمود HPLC |
| Milli-Q Advantage A10 ، مع مرشح Milli-Q | EMD Millipore Corporation ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | LCPAK0001 | نظام تنقية المياه |
| وحدة الترشيح | Sartorius Stedtim (أوباجن ، فرنسا) | 16307 | وحدة الترشيح لهطول الأمطار الببتيد |
| UPLC Aquity مع كاشف الأشعة فوق البنفسجية | ووترز ، ميلفورد ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية | M09UPA 664M | الطور العكسي التحليلي فائق HPLC ل LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18 ، حجم الخرزة 1.7 & م ، 50 × 2.1 مم | ووتر ، ميلفورد ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية | 186002350 | العمود التحليلي C18 |
| كاشف ACQUITY TQ | Detector Waters ، ميلفورد ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية | QBB908 | قياس الطيف الكتلي للتأين بالرش الكهربائي (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH ، ألمانيا | 16706 ، 101542 | Lyophilizer مع مضخة فراغ |
| قارئ لوحة Paradigm | بيكمان كولتر | ||
| MESAB (إيثيل إم أمينوبنزوات ميثان سولفونات) | أطباق Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri | Sarstedt | 821.472 | |
| تقنيات الحياة الملحية المخزنة بالفوسفات | ، GIBCO | 10010-056 | |
| إبرة | بيكتون ديكنسون | 305178 | |
| تشريح المجهر | أوليمبوس ، لايكا ، يختلف Zeiss | مع الشركة المصنعة | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting | Fallps World Precision Instruments | 501265 | |
| الشعيرات الدموية لحقن الزجاج | World Precision | Instruments TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| أدوات الدقة العالمية PicoPump الهوائية | SYS-PV820 | ||
| حلقة الإضاءة ؛ دليل الضوء الدائري | باركلاند العلمي | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
المراجع
- LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Serpell, L. C.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
