تحليل شبه الآلي للماوس الهيكل العظمى والعضلات مورفولوجيا وتكوين نوع الألياف

ملخص

المناعي تلطيخ من isoforms السلسلة الثقيلة الميوسين نشأ المميز من أحدث من نوع الألياف العضلية الهيكلية (أيالنوع الأول، اكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين، واكتب منظمة شات، اكتب الثاني باء). نقدم هنا، بروتوكول المصبوغة جنبا إلى جنب مع خوارزمية رواية شبه إليه التي تسهل تقييم سريع مورفولوجية نوع الألياف والألياف.

الملخص

لسنوات، كانت أفضل تصور الفروق بين أنواع الألياف العضلية الهيكلية تلطيخ الميوسين-ATPase. في الآونة الأخيرة، برز المناعي تلطيخ من isoforms السلسلة الثقيلة (ميك) الميوسين كمميز الدقيقة لنوع الألياف. النوع الأول، اكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين، اكتب منظمة شات ويمكن الآن تحديد نوع ألياف IIB بدقة استناداً إلى التشكيل الجانبي ميك؛ ومع ذلك، دليل تحليل هذه البيانات يمكن أن تكون بطيئة وأسفل يمين مملة. وفي هذا الصدد، تقييم سريعة ودقيقة لتكوين نوع الألياف ومورفولوجيا أداة مرغوب فيه جداً. نقدم هنا، على بروتوكول للدولة من أحدث المناعي تلطيخ من ميكس في الأجزاء المجمدة التي تم الحصول عليها من الماوس اللكتات العضلات في الحفل مع خوارزمية شبه الآلي رواية أن يسرع تحليلاً مورفولوجيا نوع الألياف والألياف. كما هو متوقع، عرض العضلات سوليوس تلطيخ للنوع الأول والنوع ألياف معهد مراجعي الحسابات الداخليين، ولكن ليس لنوع منظمة شات أو نوع ألياف IIB. من ناحية أخرى، كانت تتألف أساسا من الألياف نوع منظمة شات والنوع الثاني باء، جزء صغير من نوع الألياف معهد مراجعي الحسابات الداخليين العضلات الظنبوبي الأمامي وقليلاً أو لا النوع الأول من الألياف. واستخدمت عدة تحولات الصورة لتوليد خرائط احتمال غرض قياس جوانب مختلفة من الألياف مورفولوجيا (أيمساحة مقطعية (CSA)، قطرها فيرت القصوى والدنيا). القيم التي تم الحصول عليها لهذه المعلمات ثم قورنت مع القيم التي تم الحصول عليها يدوياً. لوحظت لا توجد اختلافات كبيرة بين أما طريقة التحليل فيما يتعلق بوكالة الفضاء الكندية، قطرها فيرت القصوى أو الدنيا (كل ف > 0.05)، مما يشير إلى دقة أسلوبنا. وبالتالي، يمكن تطبيق لدينا بروتوكول تحليل إيمونوستاينينج للتحقيق في الآثار على تكوين العضلات في العديد من النماذج للشيخوخة وعضلي.

المقدمة

كان معروفا لبعض الوقت أن الهيكل العظمى والعضلات وتتألف من ألياف واحدة من العديد من أنواع¹. في البداية، تميزت مجموعتان من الألياف استناداً إلى خصائصها الهوس واسمه، على النحو المناسب، بطيء نشل (النوع الأول) وسريع نشل (النوع الثاني). كذلك تتميز هذه الفئات على أساس التمثيل الغذائي من الألياف. النوع الأول من منذ ذلك الحين ألياف غنية في الميتوكوندريا وتعتمد على الأيض الأكسدة، تم توضيح ديافوراسي ريدكتيز (NADH-أون) tetrazolium نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide قوة إيجابية² أو succinate نازعة (SDH)³ تلوين. وفي المقابل، عرضت ألياف النوع الثاني أقل ودرجات متفاوتة من ديافوراسي NADH-TR أو المحددات تلطيخ، وتنقسم....

البروتوكول

جميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران أقرتها لجنة جامعة كولورادو-انشوتز الحرم الجامعي المؤسسي الحيوان الرعاية الطبية واستخدام (91813(05)1D).

1. 1 يوم: الابتدائي (1°) إيمونوستاينينج مع حجب ألبومين المصل البقري (BSA)

1. أيردري المقاطع المجمدة للماوس اللكتات العضلات (مثلاً، الظنبوبي الأمامي، سوليوس) التي شنت على الشرائح مشحونة ل ~ 30 دقيقة ¹¹-رسم حد حول مقاطع باستخدام قلم PAP حاجز مسعور.
2. مكان ~ 250 ميليلتر من 5% جيش صرب البوسنة/الفوسفات مخزنة المالحة (جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني) على كتلة جسم غير محددة ملزمة لكل شريحة. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة حاء 1
3. حين وقف، إعداد 01....

النتائج

وكانت العضلات اللكتات (أي، الظنبوبي الأمامي، سولاس) تشريح من ماوس C57BL/6 ذكور في سن غير معروفة فلاش المجمدة بغرق العفن بلاستيكية تحتوي على العضلات في أكتوبر مجمع في إيسوبينتاني تبريد النيتروجين السائل. ثم، استخدام كريوتومي، قطع في-20 درجة مئوية وتحويلها إلى شرائح مختلفة من الزجاج مشحونة بشكل إيجابي¹²8-10 ميكرون مقاطع المسلسل.

اخترنا الظنبوبي الأمامي وسولاس لهذه العضلات تتكون أساسا من سريع وبطيء-.......

المناقشة

هنا، وقد قدمنا الاتجاه مفيدة للتعرف على أنواع الألياف العضلية الهيكلية. في القيام بذلك، يمكننا وصف خوارزمية جديدة لتحليل البيانات.

نظراً للنتائج التي توصلنا إليها إلى حد بعيد تأكيد تلك التقارير السابقة^5،،من⁸¹⁰ وتعكس القياسات اليدوية الخاصة بنا، يبدو الخوارزمية دقيقة. ومع ذلك، واجهنا بعض المزالق التجريبية نادرة بما في ذلك الحدود غير واضحة الألياف الناتجة عن تقطيع القطع الأثرية. يمكن التقليل من أثر هذه .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مصل الأبقار الألبومين	Sigma Aldrich	A9418-100G	5٪ في PBS
مختبر الأجهزة العلمية للحاجز الكارهة للماء		9804-02
شرائح المجهر	Globe Scientific	1358W
Coverglass	Fisher Scientific	12-544-E
Immumount	Thermo Scientific	9990402
طلاء الأظافر	L'Oreal
Nikon Eclipse TE-200 المجهر المقلوب الفلوري واللامع Brightfield	تم إيقاف
			1:50
SC-71 الدراسات التنموية الأولية للأجسام المضادة	بنك الورم الهجين في		IgG1 ؛ 1:50
BF-F3 دراسات نمو الأجسام المضادة الأولية	بنك الورم الهجين في	الفأر أحادي النسيلة بجامعة أيوا
6H1 دراسات نمو الأجسام المضادة الأولية	بنك الورم الهجين في	الفأر أحادي النسيلة بجامعة أيوا
Alexa Fluor 594 Anti-IgG2b	Invitrogen	A21145	الماعز المضاد للفأر ؛ 1: 200
Alexa Fluor 488 المضاد ل IgG1	Invitrogen	A21121	الماعز المضاد للفأر ؛ 1:200
Alexa Fluor 594 مضاد ل IgGM	Invitrogen	A21044	مضاد للفأر ؛ 1:200
أكتوبر	ساكورا فينيتيك	4583
إيزوبنتان	فيشر Scientific	O3551-4	بارد مع النيتروجين
السائل PBS	فيشر الكواشف الحيوية	BP665-1	10x ، مخفف إلى 1x
مناديل كيم المبللة	كيمبرلي كلارك	06-666A

حلول التصوير الموضعية RT / KE RT940 Dell Optiplex BA-F8 دراسات نمو الأجسام المضادة الأولية بنك الورم الهجين في الفأر أحادي النسيلة بجامعة أيوا IgG2b ؛ الفأر الوحشي بجامعة أيوا IgGM ؛ 1:50 IgGM ؛ 1:50