المناعي تلطيخ من isoforms السلسلة الثقيلة الميوسين نشأ المميز من أحدث من نوع الألياف العضلية الهيكلية (أيالنوع الأول، اكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين، واكتب منظمة شات، اكتب الثاني باء). نقدم هنا، بروتوكول المصبوغة جنبا إلى جنب مع خوارزمية رواية شبه إليه التي تسهل تقييم سريع مورفولوجية نوع الألياف والألياف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل شبه الآلي للماوس الهيكل العظمى والعضلات مورفولوجيا وتكوين نوع الألياف
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لسنوات، كانت أفضل تصور الفروق بين أنواع الألياف العضلية الهيكلية تلطيخ الميوسين-ATPase. في الآونة الأخيرة، برز المناعي تلطيخ من isoforms السلسلة الثقيلة (ميك) الميوسين كمميز الدقيقة لنوع الألياف. النوع الأول، اكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين، اكتب منظمة شات ويمكن الآن تحديد نوع ألياف IIB بدقة استناداً إلى التشكيل الجانبي ميك؛ ومع ذلك، دليل تحليل هذه البيانات يمكن أن تكون بطيئة وأسفل يمين مملة. وفي هذا الصدد، تقييم سريعة ودقيقة لتكوين نوع الألياف ومورفولوجيا أداة مرغوب فيه جداً. نقدم هنا، على بروتوكول للدولة من أحدث المناعي تلطيخ من ميكس في الأجزاء المجمدة التي تم الحصول عليها من الماوس اللكتات العضلات في الحفل مع خوارزمية شبه الآلي رواية أن يسرع تحليلاً مورفولوجيا نوع الألياف والألياف. كما هو متوقع، عرض العضلات سوليوس تلطيخ للنوع الأول والنوع ألياف معهد مراجعي الحسابات الداخليين، ولكن ليس لنوع منظمة شات أو نوع ألياف IIB. من ناحية أخرى، كانت تتألف أساسا من الألياف نوع منظمة شات والنوع الثاني باء، جزء صغير من نوع الألياف معهد مراجعي الحسابات الداخليين العضلات الظنبوبي الأمامي وقليلاً أو لا النوع الأول من الألياف. واستخدمت عدة تحولات الصورة لتوليد خرائط احتمال غرض قياس جوانب مختلفة من الألياف مورفولوجيا (أيمساحة مقطعية (CSA)، قطرها فيرت القصوى والدنيا). القيم التي تم الحصول عليها لهذه المعلمات ثم قورنت مع القيم التي تم الحصول عليها يدوياً. لوحظت لا توجد اختلافات كبيرة بين أما طريقة التحليل فيما يتعلق بوكالة الفضاء الكندية، قطرها فيرت القصوى أو الدنيا (كل ف > 0.05)، مما يشير إلى دقة أسلوبنا. وبالتالي، يمكن تطبيق لدينا بروتوكول تحليل إيمونوستاينينج للتحقيق في الآثار على تكوين العضلات في العديد من النماذج للشيخوخة وعضلي.
المقدمة
كان معروفا لبعض الوقت أن الهيكل العظمى والعضلات وتتألف من ألياف واحدة من العديد من أنواع1. في البداية، تميزت مجموعتان من الألياف استناداً إلى خصائصها الهوس واسمه، على النحو المناسب، بطيء نشل (النوع الأول) وسريع نشل (النوع الثاني). كذلك تتميز هذه الفئات على أساس التمثيل الغذائي من الألياف. النوع الأول من منذ ذلك الحين ألياف غنية في الميتوكوندريا وتعتمد على الأيض الأكسدة، تم توضيح ديافوراسي ريدكتيز (NADH-أون) tetrazolium نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide قوة إيجابية2 أو succinate نازعة (SDH)3 تلوين. وفي المقابل، عرضت ألياف النوع الثاني أقل ودرجات متفاوتة من ديافوراسي NADH-TR أو المحددات تلطيخ، وتنقسم إلى مجموعتين فرعيتين سريع نشل (النوع IIA والنوع الثاني باء) نوعا ما بدائية تستند إلى قدراتها الأكسدة النسبي. وقد تم تصور هذه الفروق بين ألياف أكثر فعالية تلطيخ الميوسين-ATPase النوع الأول من حيث الألياف وصمة عار الظلام بعد حضانة قبل في pH 4.0 والنوع الثاني باء الألياف امتصاص المتعجل الحضانة قبل التالية في pH 10.0 مع نوع الألياف معهد مراجعي الحسابات الداخليين تلوين العولم4.
في الآونة الأخيرة، برز المناعي تلطيخ من isoforms السلسلة الثقيلة (ميك) الميوسين كمميز أدق من الألياف من نوع5. النوع الأول، اكتب معهد مراجعي الحسابات الداخليين، والنوع الثاني باء ألياف يمكن الجميع التعرف بدقة استناداً إلى التشكيل الجانبي ميهك. وباﻹضافة إلى ذلك، نوع آخر من الألياف أيضي-متوسط سريع نشل، اكتب منظمة شات، قد حددت6. كما كانت ألياف الهجين معربا عن ميهك أكثر من مؤكدة5،،من78. بعض الأنواع مثل القط والبابون معروفة لا للتعبير عن "النوع الثاني باء ميكس"6. على الرغم من إيمونوستينينج ميك حاليا على تقدير الدولة للفنون لتكوين العضلات، تحليل البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق هذا الأسلوب مرهقة وتستغرق وقتاً طويلاً من دون مساعدة الآلي. وتحقيقا لهذه الغاية، كانت حفنة من أساليب شبه الآلي لتحليل هذه البيانات المتقدمة5،،من910. نقدم هنا، بروتوكول قياسي نسبيا لتحديد نوع الألياف العضلية5،،من78،10، المناعي جنبا إلى جنب مع رواية شبه الآلي الخوارزمية التي تسارع تحليل مورفولوجيا نوع الألياف والألياف بدقة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران أقرتها لجنة جامعة كولورادو-انشوتز الحرم الجامعي المؤسسي الحيوان الرعاية الطبية واستخدام (91813(05)1D).
1. 1 يوم: الابتدائي (1°) إيمونوستاينينج مع حجب ألبومين المصل البقري (BSA)
- أيردري المقاطع المجمدة للماوس اللكتات العضلات (مثلاً، الظنبوبي الأمامي، سوليوس) التي شنت على الشرائح مشحونة ل ~ 30 دقيقة 11-رسم حد حول مقاطع باستخدام قلم PAP حاجز مسعور.
- مكان ~ 250 ميليلتر من 5% جيش صرب البوسنة/الفوسفات مخزنة المالحة (جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني) على كتلة جسم غير محددة ملزمة لكل شريحة. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة حاء 1
- حين وقف، إعداد 01:50 تخفيف جسم 1 ° طافية في 5% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني (كلها بالماوس [مونوكلونل]؛ انظر الجدول 1 6 ، 12)؛ إعداد 250 ميليلتر من حل كل شريحة. الاحتفاظ بمخزون جسم 1° وتخفيف على مدت
الجدول 1: "الأجسام المضادة الأولية" المستخدمة "التمييز بين ميكس".
- عقب التطلع للحل حظر جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني 5 ٪، إضافة 250 ميليلتر لتمييع جسم 1° إلى الشرائح المناسبة. إضافة 250 ميليلتر من 5% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني لمراقبة سلبية جسم فقط الثانوية (2°) الشرائح.
- إينكوباتي في 4 درجات مئوية عن ح 24-48 في بيئة رطبة.
ملاحظة: طبق بيتري المشمولة في رقائق الألومنيوم مع ورق الترشيح المبلل تكون بمثابة غرفة حضانة مناسبة.
2. يوم 2:2 ° إيمونوستينينج مع "الأجسام المضادة الفلورسنت"
- نضح 1° جسم الحل أو السيطرة على حل جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني 5%. أغسل جميع الشرائح ثلاث مرات، 10 دقيقة مع جيش صرب البوسنة 5 ٪.
- أثناء الغسيل، يعد تخفيف 1: 200 من الأجسام المضادة المنقاة، مترافق fluorophore 2 ° في 5% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني (انظر الجدول 2، كلها الماعز المضادة الماوس). إعداد 250 ميليلتر لحل كل شريحة. تبقى الأجسام المضادة مترافق fluorophore 2° في الظلام على مدت
الجدول 2: مترافق Fluorophore "الثانوي الأجسام المضادة" المستخدمة "تصور الابتدائي جسم الاعتراف من ميكس".
- عقب التطلع لتطبيق حل حظر جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني 5% الثالثة، إضافة 250 ميليلتر لتمييع جسم 2° إلى كافة الشرائح. احتضان لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في بيئة رطبة ومظلمة.
- أسبيراتي 2° جسم الحل. أغسل جميع الشرائح ثلاث مرات، 10 دقيقة مع 5% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني-
- شطف مع برنامج تلفزيوني. الجافة للحد الأدنى 10
- جبل كوفيرجلاس بوسط تصاعد مائي غير الدائمة، والمنخفضة اللزوجة.
- عندما تجف، ختم حواف الشريحة مع طلاء الأظافر. الجاف وتخزينها في سليديبوكس الظلام.
3. التصوير الشرائح مع الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي
- تنظيف الشرائح مع صغيرة، 70% غارقة في الإيثانول مختبر المسحة.
- الحصول على الصور الرقمية من أقسام العضلات إيمونوستاينيد استخدام مجهر ابيفلوريسسينسي مزودة بجهاز التصوير فوتوغرافي (انظر الجدول للمواد).
- حدد مساحة حوالي 1 مم 2 (10 X الهدف، نا 1.4).
- عرض مترافق 488 أليكسا 2° جسم الأسفار عن طريق 505 نانومتر طويلة تمرير مرشح. عرض fluorescence المتولدة عن الإثارة من الأجسام المضادة مترافق أليكسا 594 2° عبر مرشح تمرير طويل 595 نانومتر. رقمنة الصور مع كمبيوتر مزودة برامج تصوير متوافقة. إدراج شريط مقياس من التصوير البرمجيات لتحليلها في وقت لاحق.
4. تحليل الصور مع فيجي
ملاحظة: يجب أن يكون مثبتاً قبل الشروع في تحليل، فيجي (متاحة بحرية من "المعاهد الوطنية للصحة في" بيثيسدا، ماريلاند) عن طريق https://imagej.net/Fiji/Downloads. أيضا، يتم توفير الماكرو المستخدمة في هذه العملية في ملف إضافي. ضع الملف الماكرو في دليل الوصول إليها بسهولة.
- تحميل برايتفيلد صورة لمقطع محدد في فيجي. انتقل إلى الإضافات → تجزئة → تجزئة المدربة Weka.
- من أجل المناطق الخلوية للقسم، وتنص على رسم خط على ألياف بصرية، وانقر فوق " إضافة إلى الفئة 1 ". رسم خط في الفضاء بين الألياف، ثم انقر فوق " إضافة إلى فئة 2 " لوضع علامة مجالات خارج الخلية. كرر حتى هناك تسميات 5-10 في كل فئة.
- فوق القطار المصنف. على تراكب الحمراء والخضراء الناتجة عن ذلك، إضافة تسميات أكثر يدوياً (راجع الخطوة 4، 2) لقطع مجزأة بشكل غير صحيح للصورة، وإذا لزم الأمر. كرر حتى يتم فصل الألياف (أحمر) على نحو ملائم من المسافة بين الألياف (الأخضر)-
- انقر فوق " "احتمال الحصول على" " وحفظ الصورة في مجلد مسمى حديثا-
- تكرار الإجراء أعلاه (خطوات 4.2-4.3) مع الصورة الفلورية المأخوذة من نفس الحقل. قم بتسمية ألياف إيمونوستينيد ك " الطبقة 1 " وجميع المناطق غير فلوري ك " الطبقة 2 ". حفظ مخطط الاحتمالات الناتجة في نفس المجلد حيث يتم تخزين الصورة برايتفيلد المجهزة.
- فتح أحد مخططات الاحتمال تم حفظها مسبقاً في فيجي. رسم خط مستقيم في شريط مقياس تقدمها برامج التصوير. الذهاب لتحليل → تعيين المقياس. تغيير المعلمات (أي المسافة المعروفة، وحدة للطول) إلى القيم المناسبة المعطى من قبل شريط مقياس، ثم تحقق من " العالمي " مربع لتوحيد جدول الأنصبة لكل صورة.
- انتقل إلى الإضافات → وحدات الماكرو → تشغيل → تياجى et al. الألياف الكمي macro.ijm (انظر الملف التكميلي). فورا، سوف تظهر في جزء تنقل. فتح الصورة ' s المجلد المضيف؛ سوف يظهر مربع حوار. لكل مربع الحوار، تغيير " الخلفية " قيمة القائمة المنسدلة ل " الضوء. "
ملاحظة: المجلد الآن سوف يتم ملؤها مع الصور للخطوط العريضة الألياف وملفات البرامج جدول النتائج (قطر وكالة الفضاء الكندية وفيرت الأكثر صلة التحديد الكمي مورفولوجية الألياف؛ يمكن تعديل المعلمات المقاسة في تحليل القياسات المحددة). سيتم نقل الألياف مورفولوجيا البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة الدالة المسام-تحليل فيجي تلقائياً لملفات برنامج جدول بيانات لكل الصور الميدانية الفلورسنت ومشرق. - حساب جزء صغير ألياف معربا عن ميك معين في حقل بقسمة عدد ألياف نيون في الميدان بعدد إجمالي الألياف في صورة مشرقة الحقل المطابق.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وكانت العضلات اللكتات (أي، الظنبوبي الأمامي، سولاس) تشريح من ماوس C57BL/6 ذكور في سن غير معروفة فلاش المجمدة بغرق العفن بلاستيكية تحتوي على العضلات في أكتوبر مجمع في إيسوبينتاني تبريد النيتروجين السائل. ثم، استخدام كريوتومي، قطع في-20 درجة مئوية وتحويلها إلى شرائح مختلفة من الزجاج مشحونة بشكل إيجابي128-10 ميكرون مقاطع المسلسل.
اخترنا الظنبوبي الأمامي وسولاس لهذه العضلات تتكون أساسا من سريع وبطيء-...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا، وقد قدمنا الاتجاه مفيدة للتعرف على أنواع الألياف العضلية الهيكلية. في القيام بذلك، يمكننا وصف خوارزمية جديدة لتحليل البيانات.
نظراً للنتائج التي توصلنا إليها إلى حد بعيد تأكيد تلك التقارير السابقة5،،من810 وتعكس القياسات اليدوية الخاصة بنا، يبدو الخوارزمية دقيقة. ومع ذلك، واجهنا بعض المزالق التجريبية نادرة بما في ذلك الحدود غير واضحة الألياف الناتجة عن تقطيع القطع الأثرية. يمكن التقليل من أثر هذه ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب قد لا المصالح المتضاربة الكشف عن.
شكر وتقدير
نحن ممتنون لمؤسسة بوتشير ورابطة التصلب العضلي الجانبي (#17--ثانيا-344) على دعمها لهذا البحث.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مصل الأبقار الألبومين | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5٪ في PBS |
| مختبر الأجهزة العلمية للحاجز الكارهة للماء | 9804-02 | ||
| شرائح المجهر | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| طلاء الأظافر | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 المجهر المقلوب الفلوري واللامع Brightfield | تم إيقاف | ||
| 1:50 | |||
| SC-71 الدراسات التنموية الأولية للأجسام المضادة | بنك الورم الهجين في | IgG1 ؛ 1:50 | |
| BF-F3 دراسات نمو الأجسام المضادة الأولية | بنك الورم الهجين في | الفأر أحادي النسيلة بجامعة أيوا | |
| 6H1 دراسات نمو الأجسام المضادة الأولية | بنك الورم الهجين في | الفأر أحادي النسيلة بجامعة أيوا | |
| Alexa Fluor 594 Anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | الماعز المضاد للفأر ؛ 1: 200 |
| Alexa Fluor 488 المضاد ل IgG1 | Invitrogen | A21121 | الماعز المضاد للفأر ؛ 1:200 |
| Alexa Fluor 594 مضاد ل IgGM | Invitrogen | A21044 | مضاد للفأر ؛ 1:200 |
| أكتوبر | ساكورا فينيتيك | 4583 | |
| إيزوبنتان | فيشر Scientific | O3551-4 | بارد مع النيتروجين |
| السائل PBS | فيشر الكواشف الحيوية | BP665-1 | 10x ، مخفف إلى 1x |
| مناديل كيم المبللة | كيمبرلي كلارك | 06-666A |
المراجع
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254(2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
