يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

مورين الكولين تعاني من نقص، تستكمل اثيونيني (الرفيق) النظام الغذائي النموذجي لإصابة الكبد المزمنة

11.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56138

⸱

أكتوبر 21, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences & Curtin Health Innovation Research Institute, Curtin University, 2School of Public Health & Curtin Health Innovation Research Institute, Curtin University, 3Institute of Biochemistry, Christian-Albrechts-University, 4School of Veterinary and Life Sciences, Murdoch University, 5Centenary Institute of Cancer Medicine and Cell Biology, The University of Sydney, 6Royal Prince Alfred Hospital, 7A.W. Morrow Gastroenterology and Liver Centre, 8QIMR Berghofer Medical Research Institute, 9Faculty of Medicine and Biomedical Sciences, The University of Queensland, 10Fiona Stanley and Fremantle Hospitals, 11School of Medical and Health Sciences, Edith Cowan University, 12School of Medicine and Pharmacology, University of Western Australia

في هذه المقالة

ملخص

هنا يصف لنا طريقة شائعة للحث على إصابة الكبد المزمنة في الفئران عن طريق تغذية غذائي (الرفيق) تفتقر إلى مادة الكولين وتستكمل اثيونيني. ندلل على رصد الصحة، نضح الكبد، والعزلة، والحفاظ على. يمكن إطلاع مرة دورة لمدة ستة أسابيع في إصابة الكبد، باثوهيستولوجي، والتليف، والالتهابات، واستجابات الخلايا السلف الكبد.

الملخص

أمراض الكبد المزمنة، مثل التهاب الكبد الفيروسي، وأمراض الكبد الكحولية، أو مرض الكبد الدهني غير الكحولية، وتتميز بالتهاب مستمر والتدمير التدريجي والتجديد للخلية السلف لحمه الكبد، الكبد الانتشار، والتليف. المرحلة النهائية لكل أمراض الكبد المزمنة هو تليف الكبد، عامل خطر رئيسي لتنمية سرطانه الخلية الكبدية. دراسة العمليات التي تنظم بدء المرض، وإنشاء، وتقدم، تستخدم العديد من النماذج الحيوانية في المختبرات. هنا يصف لنا دورة وقت ستة أسابيع من طراز الماوس (الرفيق) تفتقر إلى مادة الكولين وتستكمل اثيونيني الذي ينطوي على تغذية القديم الأسبوع-ستة ذكور الفئران C57BL/6J مع نقص الكولين تشاو 0.15% DL--اثيونيني--استكملت مياه الشرب و. وأوضح رصد صحة الحيوان ومنحني فقدان وزن جسم نموذجية. البروتوكول يوضح إجمالي دراسة مجموعة الكبد والدم تعامل الرفيق بثقب القلب لتحليلات المصل اللاحقة. المقبل، هي تقنية التروية الكبد وجمع الفصوص الكبدية المختلفة فيما يتعلق بالتقييمات القياسية الأنسجة الكبد أظهرت، بما في ذلك التقييمات التي توضع وويوزين أو ستينينجس "الأحمر سيريوس"، الكشف عن إيمونوفلوريسسينت من السكان الخلية الكبدية كذلك الترنسكربيتوم التنميط من المكروية الكبد. هذا الطراز الماوس مناسبة لدراسة الالتهابات والتليف وخلية الكبد السلف الديناميات التي يتسبب فيها عن طريق أمراض الكبد المزمنة، ويمكن استخدامها لاختبار العوامل العلاجية المحتملة التي قد تعدل هذه العمليات.

المقدمة

الكبد هو أكبر جهاز غدي الأيضية للجسم والعديد من الوظائف المعقدة. وتشمل الأدوار الرئيسية للكبد الهضم، الأيض، إزالة السموم، وتخزين المواد الغذائية الأساسية، إنتاج مكونات بروتين بلازما الدم، والحصانة بوساطة من خلال الضامة المقيم أو خلايا كوبفر. الكبد له قدرة كبيرة على تجديد حتى لو كان ما يصل إلى 70-90 في المائة كتلتها الإجمالية المفقودة. في حالة إصابة الكبد الحاد، مثل كما رأينا عقب ظهرت جزئية أو التسمم أسيتامينوفين، تتكاثر خلايا الكبد السليمة المتبقية لإصلاح الضرر الذي لحق ب درجة عالية من تنسيق عملية1. ومع ذلك، عندما مزمن يصابون خلايا الكبد سبب العدوى الفيروسية طويلة الأجل، الكحولية أو غير الكحولية مرض الكبد الدهني، المكروية التحريضية تنتج تفعيل القيادة التليف الكبدي الخلايا النجمية تكاثر الخلايا السلف الكبد (لبكس) مع احتمال أن تفرق في تشولانجيوسيتيس أو خلايا الكبد2،3،،من45. الأصل دقيقة، مصير التمايز لبكس، إسهامها في تجديد الكبد، وهيباتوكارسينوجينيسيس كانت مواضيع نقاش مكثف والأرجح تعتمد على شدة الإصابة وسياق2. ترتيب الأحداث المرتبطة بالتجديد المبكر هو ناقش أيضا مثير للجدل، مع بعض المحققين تفيد بأن تنشيط الخلية النجمية الكبد وإعادة عرض مصفوفة غير ضرورية لتوليد تحابي LPC مكانة6، بينما البعض الآخر التقرير أن توسيع LPC و "رد فعل" ما يسمى دوكتولار مطلوبة للمشغل فيبروجينيسيس7. وهناك العديد من النماذج الحيوانية لدراسة جوانب محددة من الإصابة والتجدد، في محاولة لفهم جميع العوامل الكامنة التي تنظم تطور المرض ووضع استراتيجيات جديدة للعلاج للمرضى8في نهاية المطاف.

نموذج الغذائية (الرفيق) تفتقر إلى مادة الكولين وتستكمل اثيونيني وضعت أصلاً للاستخدام في الفئران وتعديلها في وقت لاحق لتحريض إصابة الكبد المزمنة في الفئران9،10. النتائج الغذائية ونقص الكولين في الجمعية البصر وإفراز البروتينات الدهنية low-density جداً. جنبا إلى جنب مع هيباتوكارسينوجين اثيونيني دل، وهذا النظام يؤدي إلى الدهون الكبدية المفرط تحميل، التهاب مستمر، والتليف بيريبورتال، استجابة LPC وطويلة الأجل سرطانه الخلية الكبدية التنمية11،12 . ولكن الأهم من ذلك، يحمل سلالات مختلفة من الماوس أنماط متميزة من التليف التحريضية، ومجلس السلام الليبيري استجابة ديناميات13. ويصف هذا البروتوكول سلالة الماوس التعريفي في الفئران C57BL/6J، الأكثر استخداماً فطري إصابة الكبد المزمنة.

في أبحاث أمراض الكبد المزمنة، تحليلات نموذجية تشمل تقييمات النسيجي الهيماتوكسيلين وويوزين فضلا عن تلطيخ "الأحمر سيريوس" لتصور ترسبات الكولاجين أو المناعي أو الكشف عن إيممونوفلوريسسينت من السكان الخلية الكبدية، وتحليلات ترانسكريبتوميك من المكروية الكبد الذي ينظم التغييرات الخلوية المستحثة من خلال عامل نمو معقدة وسيتوكين شبكات14،15،،من1617 , 18.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. "التجريب الحيوان"

جميع الدراسات الحيوانية الموصوفة في هذا التحقيق كانت أقرته "لجنة أخلاقيات الحيوان جامعة كورتين" (رقم الاعتماد: AEC_2014_28) قبل بدء والتجارب وتنفيذها وفقا للقانون الأسترالي لرعاية واستخدام الحيوانات.

  1. الحيوانات
    1. استخدام القديم الأسبوع-ستة ذكور الفئران C57BL/6J للتجارب-
  2. التصميم التجريبي
    1. عقب وصوله إلى "مرفق الحيوان"، السماح للفئران التأقلم لمدة أربعة أيام قبل البدء في أي تجارب.
    2. بيت الفئران في الفراش قش قمح، التي استنفدت الحبوب مرئية وسيقان وإبقاء الفئران على مدار 12 ساعة اليوم/ليلة دورات في منفردة التهوية الأقفاص. تغيير الفراش في أيام ثلاثة وسبعة، ثم أسبوعية بعد ذلك.
    3. الفئران تقديم إعلانية libitum الوصول إلى مادة الكولين تعاني من نقص الغذاء ومياه الشرب التي استكملت بنسبة 0.15 في المائة من DL-اثيونيني. الحفاظ DL-اثيونيني-تستكمل الماء عند 4 درجة مئوية واستبدال مياه الشرب كل يوم ثان لضمان نضارة وتشجيع شرب. أعلى يصل تشو الكولين التي تفتقر إلى كل يوم الثاني مع تغيير كامل تشاو مرة واحدة في أسبوع-
    4. مراقبة الفئران في الراحة وأثناء المناولة. رصد علامات قياسية للصحة الحيوانية، بما في ذلك المظهر العام، والموقف، والتفاعل الاجتماعي، والاستمالة، معطف الشرط، ووزن جسم.
      5. هي euthanized
    5. وزن الفئران يوميا خلال الأسبوعين الأولين من هذه التجربة لضمان أي الحيوانات المعرض أكثر من 20% الجسم وفقدان الوزن للحد من معاناة لا داعي لها. عادة هذا هو الحال في أقل من 5% من الحيوانات. وبعد أسبوعين، يمكن خفض تواتر وزنها بثلاث مرات أسبوعيا (مثلاً، الاثنين، الأربعاء، الجمعة).
  3. نضح الكبد والعزلة
    1. تخدير الفئران في النقاط الزمنية المشار إليها (في هذه الدراسة واحد واثنين وستة أسابيع في النظام الغذائي الرفيق) مع الكيتامين (100 مغ/كغ) وإكسيلازيني (10 مغ/كغ) بالحقن داخل. اختبار منعكس سحب دواسة لضمان التخدير الكافي.
    2. الرطب الفراء مع الإيثانول 70% وجعل شق خط الوسط عمودي في جدار البطن تصل إلى الحجاب الحاجز باستخدام مقص مايو كلينيك. يمكن إزالة القفص الصدري لتسهيل الوصول إلى القلب.
    3. جمع الدم ببطء ثقب القلب باستخدام 25 x 1/2 " إبرة الجدار العادية لتفادي انهيار القلب. يسمح الدم إلى تجلط في أنبوب ميكروسينتريفوجي في درجة حرارة الغرفة للحصول على عينات المصل بعد الطرد المركزي في 2,000 س ز لمدة 10 دقائق. وبعد قياس مستويات المصل transaminase ألانين الإجراءات الموحدة في 12-
      4. تحريك المعدة والأمعاء إلى الجانب
    4. وفضح الوريد البابي. قطع القلب باستخدام مقص مايو كلينيك للسماح للسوائل للخروج ونتخلل في الكبد مع الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (pH = 7.4) قبل كانولاتينج الوريد البابي باستخدام 27 x 1/2 " إبرة الجدار العادية. كبد بالتساوي متبيض يشير إلى نضح ناجحة من جميع الفصوص الكبد.
    5. فصل الكبد ووضعه في طبق بتري استخدام ملقط ومقص مايو كلينيك بعناية. إزالة الأنسجة الزائدة، غير الكبد والمرارة.
  4. الحفاظ على الكبد
    1. بعد تم تسجيل إجمالي وزن الكبد، قطع الفص صغير واحد إلى عدة قطع صغيرة من بضعة مليمترات مربعة، نقلها إلى أنابيب العقيمة، وتجميد المفاجئة في النتروجين السائل لوقت لاحق الجيش الملكي النيبالي واستخراج البروتين، وفقا للبروتوكولات القياسية. الأداة الإضافية-تجميد هذه القطع الأنسجة أسرع بعد جمع الجهاز لتجنب أي تدهور الأنسجة.
    2. جمع فلقة واحدة في 10% فورمالين مخزنة محايدة للمعالجة لاحقاً وتضمين البارافين، كما كل البروتوكولات القياسية.
    3. وضع فص واحد في العفن مليئة كريوماتريكس درجة الحرارة المثلى قطع التضمين الراتنج والمفاجئة-التجميد في النيتروجين السائل-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

طوال الوقت ستة أسابيع للإصابة الكبد المزمنة الناجمة عن الرفيق، تم تقييم المعلمات في أيام 7 (المرحلة التعريفي) و 14 و 21 (مرحلة الإنشاء) و 42 (مرحلة الصيانة). مقارنة لمكافحة الفئران، الفئران المعالجة بالرفيق فقد تصل إلى 20% وزن الجسم الأولية في مرحلة تكيف أولية وتميل إلى استعادة الوزن في مراحل إنشاء وصيانة (الشكل 1). وزن الجسم كان ارتباطاً عكسيا مع مستويات المصل transaminase ألانين، مؤشرا لإصابة كبدية (الشكل 2

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أمراض الكبد المزمنة غالباً مرض صامت مع معظم المرضى بأعراض، واحد المساهمين الرئيسيين في المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. إدمان الكحول المزمن والعدوى بفيروس التهاب الكبد الوبائي هي الأسباب الرئيسية. تتميز الإصابة الكبد المزمنة بالتهاب الكبد، تليف وتليف الكبد في الحالات الشديدة وسرطان وفشل الكبد في نهاية المطاف. لا تتوفر حاليا لا علاج وعلى الرغم من أن تقدما كبيرا قد بذلت لفهم آليات مرض الكبد، السبل العلاجية الجديدة لا تزال مطلوبة على وجه الاستعجال.

النظام الغذائي الرفيق نموذج بسيط، اعتبارا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد شيء لكشف مقدمو البلاغ.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل منح مقدمة من "الوطنية للصحة" ومجلس البحوث الطبية (NHMRC) أستراليا (APP1042370، APP1061332، APP1087125). المؤلفون أود أن أشكر موظفي معهد بحوث الابتكار الصحة كورتين للمساعدة التقنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ذكور C57BL / 6J يبلغ من العمر ستة أسابيع  مركز الموارد الحيوانية في غرب أستراليا ، مردوخ ، واشنطن ، & nbsp ؛ أسترالياN / A
10 كجم قشر قمح مقطوع بالبخار الأعلاف المتخصصة ، غلين فورست ، واشنطن ، أستراليا   ؛N / A
مياه للري زجاجة 1000 مل (باكستر)   ؛بيت الجراحة، بيرث، واشنطن، أستراليا AHF7114A
الكولين- نقص النظام الغذائي, معدل (الكريات) MP Biomedicals Australasia Pty Limited ، واشنطن ، أستراليا 02960210
DL-Ethionine  ؛سيجما ألدريتش ، كاسل هيل ، نيو ساوث ويلز ،   ؛ أستراليا E5139-25G
حقن الكيتاميل  Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia N / A
Ilum Xylazil-20 حقن Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia N / A
27G × 1/2 "، إبرة حائط عادية   ؛Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia محاقن NN-2713R
Terumo 1 مل و 10 مل   ؛Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia 1018242, 1018037
مركب Tissue-Tek OCT  VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia 25608-930
الفورمالين المخزن المحايد Amber Scientific ، Midvale ، واشنطن ، أستراليا   ؛NBF-2.5L
الإيثانول المطلق anaLaR normalpur VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia 20821.33
شرائح Superfrost Plus Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia SF41296SP
داكو بروتين بلوك ، خالي من السيروم   ؛Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia   X090930-2
مخفف الأجسام المضادة داكو Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia   s0809
الفئران المضادة ل CD45   ؛eBioscience, سان دييغو, كاليفورنيا, الولايات المتحدة الأمريكية m0701 1/200 تخفيف
أرنب مضاد للبانك Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia   Z06221/300 تخفيف
الماعز المضاد للأرانب (Alexa Fluor 488)Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, AustraliaA-110081/500 تخفيف
الماعز المضاد للفئران IgG (Alexa Fluor 594) Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia  A-110071/500 التخفيف
ProLong الذهب الكاشف المضاد للبهتان مع DAPI   ؛Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia P36935   
Picrosirius Red Stain KitPolysciences Inc. ، Warrington ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية   ؛ab150681 & emsp;

المراجع

  1. Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
  2. Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
  3. Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
  4. Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
  5. Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
  6. Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
  7. Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
  8. Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration - mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
  9. Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
  10. Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
  11. Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
  12. Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
  13. Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
  14. Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39(2014).
  15. Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
  16. Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
  17. Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
  18. Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
  19. Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
  20. Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
  21. Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
  22. Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مورين الكولين تعاني من نقص، تستكمل اثيونيني (الرفيق) النظام الغذائي النموذجي لإصابة الكبد المزمنة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.