مقالة منهجية

تحسين أسلوب لإنشاء في المختبر حاجز الدم – المخ نموذج استناداً إلى خلايا المخ الخنزيري بطانية

DOI:

10.3791/56277

⸱

سبتمبر 24, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, 3HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهدف البروتوكول تقديم إجراء محسنة لإنشاء في المختبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) نموذجا يستند إلى خلايا المخ الخنزيري الابتدائي غشائي (ببيكس). نموذج يظهر إمكانية تكرار نتائج عالية، ضيق عالية، وهي مناسبة للدراسات المتعلقة بالنقل والاتجار داخل الخلايا في اكتشاف الأدوية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من هذا البروتوكول ويعرض إجراء أمثل لتنقية وزراعة ببيكس و في المختبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) وضع نماذج تستند إلى ببيكس في مونو-الثقافة (MC)، مولودية مع مكيفة astrocyte المتوسطة (ACM)، و عدم الاتصال ثقافة المشارك (NCC) مع أستروسيتيس من الخنزير أو الفئران المنشأ. ببيكس كانت معزولة ومثقف من شظايا من الشعيرات الدموية من كورتيسيس الدماغ من الخنازير المحلية 5-6 أشهر من العمر. تم تنقية هذه الأجزاء بعناية بإزالة السحايا والعزلة وتجانس المادة الرمادية، والترشيح، والهضم الأنزيمي، والطرد المركزي. لمواصلة القضاء على الخلايا تلويث، كان مثقف الشظايا الشعرية مع المحتوية على بوروميسين المتوسطة. عند روافد 60-95%، كانت باساجيد ببيكس المتزايد من الشظايا الشعرية لإدراج تصفية نفاذية الأغشية والمنشأة في النماذج. زيادة حاجز ضيق والنمط الظاهري مميزة BBB من ببيكس، تعامل الخلايا مع عوامل التمايز التالي: غشاء بيرمينت 8-CPT-المخيم (مخيم المختصر هنا) والهيدروكورتيزون المانع فوسفوديستريس، رو-20-1724 (RO). الإجراء الذي أجرى خلال فترة من 9-11 يوما، وعند إنشاء نموذج لجنة التنسيق الوطنية، أستروسيتيس كانت مثقف 2-8 أسابيع مقدما. التقيد بالإجراءات الموصوفة في البروتوكول قد سمح بإنشاء طبقات بطانية ذات النفاذية باراسيلولار مقيدة للغاية، ومع لجنة التنسيق الوطنية نموذج عرض ترانسيندوثيليال متوسط مقاومة كهربائية (طير) 1249 ± 80 سم Ω 2، وباراسيلولار نفاذية (فالتطبيق) "إبليس الأصفر" من 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 سم-1 ثانية (يعني ± ووزارة شؤون المرأة، n = 55). أظهرت مزيد من التقييم لهذا النمط الظاهري المجلس التعبير الجيد عن كلودين البروتينات هالة ضيق 5، زوي-1، كاتينين p120 البروتين مفرق أوككلودين وأدهيرينس. ويمكن استخدام نموذج عرض لمجموعة من دراسات BBB في الصحة والمرض، ومع نفاذية باراسيلولار الشديدة التقييد، وهذا النموذج مناسبة للدراسات المتعلقة بالنقل والاتجار داخل الخلايا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البنية الخلوية ووظيفة حاجز الدم في الدماغ

في واجهة جهاز الدورة الدموية والمركزي العصبي (CNS)، أعمال BBB كموقع تنظيمية رئيسية للسيطرة على هومووستاتيك المكروية الجهاز العصبي المركزي، هو أمر ضروري لوظيفة مناسبة وحماية للجهاز العصبي. هو موقع BBB خلايا بطانية بطانة التجويف الأوعية الدموية. في الشعيرات الدموية في الدماغ، تشكيل خلايا بطانية تقاطعات ضيق بين الخلايا المعقدة وأنماط التعبير بقوة الاستقطاب من الناقلين تدفق و efflux خاصة ضمان النقل جزيئية محددة للغاية بين الدم و الدماغ 1. العناصر الهيكلية للمجمعات مفرق ضيق تشمل البروتينات من الأسرة أوككلودين وكلاودين، أوككلودينس زونولا (زوي) البروتينات، سينجولين، وترتبط جزيئات الالتصاق هالة (المربيات). 5 كلودين مهم بشكل خاص في تقييد هالة باراسيلولار. التعريفي، والحفاظ على هذا النمط الظاهري غشائي BBB مميزة تنطوي على التفاعلات الديناميكية مع الخلايا المحيطة بها، بما في ذلك بيريسيتيس، أستروسيتيس، والخلايا العصبية والأغشية الطابق السفلي، الذي جنبا إلى جنب مع الدماغ غشائي الخلايا النموذج نيوروفاسكولار وحدة (NVU)2،3. الآليات التي تشارك في هذه التفاعلات لا بعد فهم فهما كاملا، ولكن تشمل تبادل الإشارات الكيميائية بين الخلايا، والذي يسمح بتحوير نفاذية BBB في الأجل القصير والحث على ميزات BBB طويل الأجل4. Astrocytes خاصة معروفة للمساهمة في النمط الظاهري خلية غشائي الدماغ وهي مصدر للعوامل التنظيمية مثل نيوروتروفيك الدبقية مشتقة عامل (يؤثر في مخيم داخل الخلايا)5، عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية6، الهيدروكورتيزون7، وتحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)8. بيد أن تأثير TGF-β، كانت موضع نقاش9.

من في فيفو إلى في المختبر BBB

في فيفو دراسات عن الاستمرار في تقديم معلومات قيمة عن البيولوجيا BBB. ومع ذلك، نماذج الثقافة خلية يمكن تقدم أفكاراً إضافية وتشكل أدوات مفيدة لفهم الجوانب الجزيئية ووظيفية مفصلة من BBB في الصحة والمرض. على الرغم من صعوبة تحقيق كامل في نماذج في المختبر التفاعلات المعقدة بين أنواع الخلايا والمكونة من BBB، كان هناك، منذ أول تنقية خلايا الدماغ بطانية وتطبيق هذه في مونو-الثقافات 10 , 11 , 12، وتنمية واسعة النطاق لتنقية إجراءات وشروط النمو من BBB الخلية نماذج الثقافة، أدى إلى تشابه أكبر للحاجز في فيفو . الخلايا الأولية من أصل القوارض والخنزير والأبقار، وفي خطوط الخلايا مخلدة تستند النماذج BBB استخداماً في المختبر . يحتوي كل نموذج مختلف المزايا والعيوب. لاختيار نموذج والمقارنة، تستخدم علامات التحقق من الصحة مثل التعبير عن الإنزيمات BBB والناقلين والمستقبلات والبروتينات الهيكلية لإنشاء لمحات عامة عن النماذج المتبعة حاليا1.

وهدف البروتوكول

هو إحدى السمات الهامة ل BBB حاجز ضيق وطير عالية، ومع ذلك عدد كبير من النماذج المتاحة لا تعكس جيدا على مستويات في فيفو . إدراج مساهمات التنمية والتحسين من عدة مختبرات، والهدف من هذا البروتوكول تقديم أسلوب لإنشاء نموذج طير عالية في المختبر BBB استناداً إلى ببيكس الأولية في MC مع أو بدون أية سي أم، أو في لجنة التنسيق الوطنية مع الابتدائية أستروسيتيس الفئران أو أصل الخنزير. وتشمل الجهود الرامية إلى القضاء على خلايا تلويث وتحسين تمايز ببيكس في النمط الظاهري BBB الإجراءات التطبيقية وإنشاء نموذج. وقد نتج عن هذا العمل في إنشاء نماذج طير موثوقة وعالية مع باراسيلولار منخفضة النفاذية وحسن التعبير الوظيفية الرئيسية البروتينات هالة ضيقة والناقلين، ومستقبلات. بيد كما astrocytes عاملاً مساهما في النمط الظاهري خلية غشائي الدماغ، تمثل ثلاثة شروط مختلفة للثقافة تعمل مختلف ثلاث خلايا غشائي الدماغ. نموذج NCC مفيدة على وجه الخصوص لإجراء دراسات لبعض الآليات المتخصصة التي تشارك في اكتشاف المخدرات، ودراسات النقل والاتجار بها داخل الخلايا، وكذلك للتحقيق من التفاعلات خلية خلية حيث التعبير القصوى من الميزات BBB فائدة.

أصل وتاريخ البروتوكول

نموذج المجلس الموصوفة هنا يستند أساسا إلى نموذج الخنزيري الذي وضع في "مختبرات وايساي" (لندن) الدكتور لويز مورغان والزملاء، استناداً إلى نجاح سابق الدماغ بقرى خلية بطانية نموذجي13whichis. طريقة إعداد الخلية الأصلي كان ترشيح مرحلتين استخدام النايلون تنسجم للقبض على ميكروفيسيلس، تليها خطوة سوبكولتورينج لتحسين نقاء. في تطوير الأسلوب سابق، قد تحققت الأمثل BBB النمط الظاهري وحاجز ضيق بالنمو في المتوسط المستكملة، بما في ذلك مواد تحتوي على الأسبستوس. وأدلى المزيد من التعديلات على الأسلوب سكينر R. في مختبر البروفيسور أ. فنادق في مانشستر المملكة المتحدة14،15. الأسلوب الذي اعتمدته مختبر أبوت، لندن بوكل، حيث جعلت باتابينديجي من أبسط بكثير للتحضير بتجنب استخدام astrocytes أو مواد تحتوي على الأسبستوس، والقضاء على خلايا تلويث مثل بيريسيتيس مع بوروميسين. وأكدت الورقات الأولى الحفاظ على نموذج MC العديد من الميزات الهامة في فيفو بي بي بي، بما في ذلك تقاطعات ضيق فعالة ونظم النقل الغشاء بوساطة مستقبلات ترانسسيتوسيس16،17 , 18 , 19 , 20-يوسف س. "في وقت لاحق" مرة أخرى اختبار ثقافة المشارك astrocyte ووجد أنها تحسن كبير طير، حيث أن هذا هو البديل المفضل المستخدمة حاليا في مختبر أبوت21. النموذج الآن تم بنجاح نقل إلى نيلسن م. عرض مختبر في آرهوس، حيث تم إجراء المزيد من التعديلات (هذا البروتوكول)، بما في ذلك تبسيط غراي يهم استخراج واستخدام شبكة واحدة فقط خطوة الترشيح، وخطوة طلاء تصفية واحد الجمع بين الكولاجين وفيبرونيكتين. تستند الإجراءات التطبيقية لعزل الخنزير أستروسيتيس (هذا البروتوكول) البروتوكولات الذي وضعه مختبر Moos ت. في البورغ، وصف Thomsen et al22. في طير وخصائص أخرى للنموذج التي تم إنشاؤها في لندن وارهوس مماثلة، مما يعطي الثقة للفكرة القائلة بأن هذا النموذج سهولة نقلها بين مختبرات ويستجيب جيدا لرصد دقيق وترشيد أسلوب الخطوات. في الواقع، أنشأ يوسف س. الآن نموذج MC في البلاد المدارية (ماليزيا)23، التي تنطوي على مزيد من التكيف للظروف المحلية ومصادر الأنسجة.

مزايا أكثر الأساليب البديلة وحاليا إنشاء النماذج

بالمقارنة مع خلايا الدماغ بطانية المنشأ البقري والقوارض، ببيكس توفر ميزة وجود معدل أقل من الخسارة في فيفو BBB النمط الظاهري بعد عزل24. وعلاوة على ذلك، ببيكس قادرون على تشكيل الحواجز غشائي ضيق نسبيا، حتى عندما تزرع في MC (800 Ω سم2)16 مقارنة بالمستويات المبلغ عنها شيوعاً مونولاييرس خطوط الخلايا مثل bEND.5 و bEND.3 (سم Ω 502) 25 , 26 , 27وسند (300-800 Ω سم2)28،،من2930، و31،29،سيريبيند (سم Ω 5002)32والدماغ الأولية خلايا بطانية للماوس (100-300 سم Ω2)[س] = "xref" > 33،34،،من3536 والفئران (100-300 سم Ω2)37،38. بيد أظهرت طير التبعية على إجراءات تنقية والثقافة. في معظم الحالات، يظهر إضافة مواد تحتوي على الأسبستوس أو الثقافة المشتركة مع astrocytes آثار التفريق في خلايا بطانية وزيادة في ضيق من طبقات غشائي1. ومع ذلك، مع الجهود المبذولة لتحسين ظروف تثقيف، فقط النماذج المستندة إلى الأبقار أظهرت القيم طير قابلة للمقارنة للنماذج المستندة إلى الخنزير (متوسطات 800 Ω سم2 في MC، تصل إلى 2500 Ω سم2 في ثقافة المشارك أستروسيتي)13 39، ،،من4042،41،43،،من4445. كنماذج تستند إلى الدماغ البقري الأولية أظهرت خلايا بطانية تفاوتاً كبيرا، بين وداخل المختبرات14،45،46،،من4748، يمكن أن تكون إمكانية تكرار نتائج قضية. في نموذج المجلس ذكرت هنا، حققت المختبرات المساهمة طير مشابهة جداً وقيم النفاذية باراسيلولار مع تقلب منخفض، على حد سواء في وبين المختبرات. ومن ثم، سيكون من الممكن لمختبرات أخرى إلى إقامة نموذج قوي مع تقلب منخفضة باستخدام الطريقة المعروضة هنا. بالإضافة إلى تكوين طبقات غشائي ضيق، سبق صحة النماذج مع ببيكس بالتعبير عن البروتينات مفرق ضيق ووظيفية BBB الناقلين والمستقبلات والأنزيمات وأظهرت مدى ملاءمتها لمجموعة من الدراسات15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59-وعلاوة على ذلك، تظهر البيانات الترنسكربيتوم غير منشورة في ثقافات ببيكس المشارك الشخصية المتوقعة من الناقلين BBB والمستقبلات (لم تنشر النتائج، نيلسن et al.).

نموذج BBB المستندة إلى الخنزير يتمتع بميزة إضافية الجينوم، والتشريح، وعلم وظائف الأعضاء، وتعكس تطور المرض من الخنازير البيولوجيا البشرية بدرجة أعلى من نماذج أخرى ثابتة ويضم60، التي مواتية صناعة المستحضرات الصيدلانية. كما العقول الخنزير منتج ثانوي مشترك لصناعة اللحوم، أنها تشكل مصدر يمكن الوصول بسهولة للدماغ خلايا بطانية، تقليل عدد الحيوانات اللازمة للتجارب، وتوفير تنقية عالية غلة من المخ الخنزيري واحد. على الرغم من أن زراعة الخلايا الأولية وتنقية تستغرق وقتاً طويلاً إلى حد ما وتتطلب خبرة للتوحيد القياسي في إعداد النموذج، تولد الخلايا الابتدائية نماذج BBB الأكثر موثوقية. خطوط خلية مخلدة لا يمكن أن يكون بديلاً، كخصائص هامة مثل ضيق الحاجز وملامح التعبير الناقل، والتنظيم المكروية لا تعكس النتائج التجريبية في فيفو61، 62-تقديم نماذج في المختبر وميزة خلية يعيش التصوير بدقة أعلى، مما يجعل من الممكن تصور للعمليات داخل الخلايا بالسماح لاتباع نهج مقربة إلى الخلايا عينات أو الملاحظة، باستخدام الأهداف مع تضخم أعلى وأفضل نوعية البصرية63. هذه ليست الحال بالنسبة لاستخدام اثنين-فوتون مجهرية في الحيوانات الحية. وعلاوة على ذلك، توفر نماذج في المختبر القدرة على ترانسفيكت الخلايا، مما يسمح لتصور بروتينات المعلمة والتحقيق في الاتجار بها.

تطبيقات نموذج

وظيفة BBB ليست ثابتة ويمكن أن يكون بشكل حيوي والتضمين في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض. في الكثير من الأمراض العصبية، بما في ذلك الأعصاب، والالتهابات والأمراض المعدية، واضطراب وزيادة نفاذية BBB يلاحظ64،،من6566،67 . من أجل تقليل ومنع تطور المرض والأضرار اللاحقة، يتم تحديد وتوصيف الآليات الجزيئية الكامنة وراء تحوير BBB أهمية كبرى. وفي هذا السياق، يمكن الاعتماد عليها في المختبر نماذج هي في ارتفاع الطلب في صناعة المستحضرات الصيدلانية، وتلعب أدواراً هامة في التنبؤ نفاذية BBB من المخدرات على الجهاز العصبي المركزي وعلاوة على ذلك. يجب عرض نموذج في المختبر أي يخدم كشاشة نفاذية طريقا باراسيلولار تقييدية، والعمارة خلية فسيولوجيا واقعية والتعبير الوظيفي ل آليات نقل68. أثبتت في الدراسات السابقة16،،من1757، وباراسيلولار النفاذية والتعبير عن بروتينات تي جي وجعفر هنا، نموذج عرض يفي بجميع معايير هذه وهي مناسبة لمجموعة من بي بي بي دراسات في كلا الفسيولوجيا العادية وفي علم الأمراض. نقاط قوة طريقة تنقية وزراعة المقدمة تشمل مزيجاً من البساطة وإمكانية تكرار نتائج والقدرة على تضمين أستروسيتيك التأثير الناتج قوية وموثوق بها عالية طير في المختبر BBB نموذجا. لهذا الغرض، أستروسيتيس من الخنزير والفئران أظهرت المنشأ زيادة النمط الظاهري BBB من ببيكس طريقة مماثلة22.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على العقول الخنزير كمشتقات صناعة الأغذية الدانمركية. المجازر الدانمركية تحت إشراف صارم ومراقبة وزارة البيئة الدانمركية والأغذية-

ولدت الفئران المستخدمة لعزل astrocytes ويضم الفريق في مرفق الحيوانات المحلية في درجة حرارة المحيطة من 22 درجة مئوية-23 درجة مئوية وعلى دورة ضوء الظلام/ح 12/12 تحت التفتيش البيطري وحسب الدانمركية اللوائح لمختبر الحيوانات. وقد euthanized الفئران قبل أنهم قد ضحى بها وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية على استخدام الأخلاقية للحيوانات (توجيه مجلس الجماعات الأوروبية من 24 نوفمبر 1986؛ 86/609/EEC) والمبادئ التوجيهية الدانمركية. لا يوجد في فيفو تجارب على الحيوانات أو المواد البشرية واستخدمت في هذه التجارب-

ملاحظة: التالي بروتوكول المجلس الرئيسي تصف تنقية (الخطوة 1) والزراعة (الخطوة 2) والقياسات (الخطوة 3) طير. للإعداد للبلدان المتبرعة الصافية مع أستروسيتيس، يرد بروتكول بديل (الخطوة 4) تصف تنقية وزراعة الفئران والخنزير أستروسيتيس.

1-"تنقية الشعيرات المخ الخنزيري"

  1. جمع العقول 8-10 من 5-6-شهرا المحلية الخنازير (مثلاً من المسالخ قريبة) ونقل لهم على الجليد للمختبر. نحن نوصي ببدء الإجراء تنقية التالية ضمن ح 2-3 الإنهاء للحيوان.
  2. ضع العقل المدبر في مقاعد البدلاء تدفق عقيمة وغسلها برفق مع برنامج تلفزيوني 1 لتر في كوب على مدت
  3. بعناية إزالة السحايا من الدماغ واحدة في وقت باستخدام الملقط نصيحة غرامة ونقل أدمغة السحايا خالية أخرى ل 1 كوب مع برنامج تلفزيوني على الجليد. تمديد الوقت الذي يمكن أن يعقد الإزالة. ينبغي أن يكون الوقت التقريبي الذي يستخدم للدماغ كل 10-15 دقيقة
  4. استخدام مشرط، كشط قبالة المادة الرمادية من الدماغ واحدة في وقت واحد، ونقل المواد المعزولة إلى أطباق بتري (8.8 سم 2) الذي يحتوي على 20 مل "مزيج المغذيات دميم" F-12 (دميم/و-12) على الجليد. عزل كالمادة الرمادية كثير ممكن دون سحب المواد المسألة الأبيض. من خلال حقنه 50 مل دون إبرة لتجزئة الأولية، تشغيل المواد المادة الرمادية. مواصلة لجميع العقول وتجميع المواد التي جمعت المادة الرمادية. تمديد الوقت الذي يمكن أن يعقد الإزالة. ينبغي أن يكون الوقت التقريبي الذي يستخدم للدماغ كل 10-15 دقيقة
  5. نقل مواد متفرقة المادة الرمادية إلى أنبوب مطحنة من الخالطون الأنسجة باليد نسبة 50/50 مع وسائط الإعلام دميم/و-12. مجانسة المواد بجعل 8 صعودا وهبوطاً السكتات الدماغية مع مدقة فضفاضة، تليها 8 صعودا وهبوطاً السكتات الدماغية مع مدقة ضيق. يستمر جميع معزولة قد تم تجانس المواد، ثم نقل هوموجيناتي باستخدام زجاجة 500 مل وتمييع مع دميم/و-12 إلى حوالي 450 مل الحجم الإجمالي-
  6. تصفية هوموجيناتي استخدام زجاجة كاب أزرق 500 مل مع الفلتر و 140 عامل التصفية-ميكرون، وعزل الشعيرات الدموية عن طريق تشغيل الأنسجة من خلال عامل تصفية. استخدام عامل تصفية واحد كل 50 مل هوموجيناتي وتغسل كل مرشح مع دميم/و-12 بعد ذلك.
  7. المكان الشعرية التي تحتوي على مرشحات في أطباق بتري مع حل هضم التربسين/يدتا (2.5% التربسين، 0.1 nM يدتا في برنامج تلفزيوني)، كولاجيناز CLS2 (2,000 U/mL) والدناز 1 (3,400 U/mL) في دميم/و-12. استخدام طبق بتري 1 (8.8 سم 2، حل 20 مل) كل 3 تصفية تنسجم.
  8. وضع أطباق بيتري في 37 درجة مئوية ح 1 على شاكر مداري 180 لفة في الدقيقة أو إثارة لهم بلطف كل 10 دقيقة. بعد ح 1، يغسل الشعيرات الدموية من عوامل التصفية مع تعليق من طبق بيتري استخدام ماصة 1 مل.
  9. تقسيم التعليق من الأطباق 3 إلى 2 50 مل الأنابيب وتتوقف عملية الهضم بإضافة 10 مل دميم/و-12 لكل أنبوب 50 مل.
  10. الطرد المركزي أن الخلية الإيقاف في 250 x ز، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 نضح في supernatants وإعادة تعليق كل بيليه في 10 مل من دميم/و-12. إضافة 20 مل مزيد من DMEM/F12 لكل أنبوبة. كرر هذه الخطوة للطرد المركزي مرتين.
  11. السماح الأنابيب يبرد على الجليد لمدة 5 دقائق ونقل الحلول لأنابيب 50 مل جديدة 2-
  12. الطرد المركزي أن الخلية الإيقاف في 250 x ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإعادة تعليق كل بيليه في 8-10 مل (حوالي 1 مل/الدماغ المستخدمة) لتجميد حل يتكون من 10% [دمس] في FBS-
  13. نقل تعليق الخلية إلى كريوفيالس، باستخدام 1 مل كل كريوفيال. وفي المتوسط، على تنقية النتائج في 1 القنينة الواحدة الدماغ المستخدمة، في المتوسط توفير خلايا بطانية لإدراج 12-16. ضع القنينات في مربع تجميد في-80 درجة مئوية على الأقل 4 ح حتى بين عشية وضحاها. بعد ذلك، تخزين كريوفيالس في كريوتانك مع النيتروجين السائل-
    تنبيه: نيتروجين سائل بدرجات حرارة منخفضة للغاية. يرجى ارتداء حماية ملائمة.

2. زراعة ببيكس الأولية (8-10 أيام)

  1. الثقافة الأولية (3-5 أيام)
    1 يوم
    1. لتحسين شروط مرفق ببيكس، إجراء طلاء قارورة T75 بإضافة إلى حل مع النهائي تركيزات الكولاجين الرابع (150 ميكروغرام/مل) وفيبرونيكتين (50 ميكروغرام/مل) في ddH 2 س إلى قارورة، التأكد من أن الحل الذي يغطي السطح كله. استخدام 10 مل لكل قارورة T75. احتضان في 37 درجة مئوية حاء 2
      ملاحظة: الطلاء يمكن القيام بها فقط قبل استخدام أو تصل إلى أسبوع قبل وتخزينها مع برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. لا يجب أن تجف الطلاء، أو لم تعد تشكل سطحاً مرفق ونمو مناسب.
      2. وتستكمل المتوسطة
    2. إعداد 16 مل من النمو المجلس تتألف من دميم/و-12 مع 10% مصل المستمدة من البلازما (PDS) البنسلين (100 U/mL)، ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل) والهيبارين (15 U/mL). الملحق المتوسطة مع بوروميسين (4 ميكروغرام/مل) لتحديد للخلايا البطانية. انتبه إلى أن العلاج بوروميسين يمكن استخدامها فقط لمدة أقصاها 5 أيام-
    3. قاسمة المتوسطة مستعدة إلى وحدات تخزين 6 مل و 10 مل في أنبوبين 15 مل.
    4. جلب قنينة مع الشعيرات الدموية من النتروجين السائل (الخطوة 1، 13)، وذوبان الجليد الشعيرات الدموية باستخدام حمام مائي 37 درجة مئوية أو بإضافة 750 ميليلتر من المتوسط استعداد من قاسمة 6 مل. إذا كان ذوبان الجليد بإضافة المتوسطة، بعناية "الماصة؛" صعودا ونزولاً ذوبان الجليد وتجانسه بتعليق. عندما مذاب، نقل تعليق خلية في المتوسط 6 مل الكوة.
    5. لإزالة التجميد المتوسطة، تدور الشعيرات الدموية إلى أسفل في 250 x ز، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 7
    6. نضح المادة طافية بعناية وإعادة تعليق بيليه في 1-2 مل قاسمة 10 مل. عند إعادة تعليق، نقل الحل إلى متوسط 10 مل الكوة.
    7. نقل تعليق الشعرية إلى قارورة T75 المغلفة والميل بلطف قارورة لضمان التوزيع المتساوي على السطح. ضع قارورة T75 عند 37 درجة مئوية، 5% CO 2-
      يوم 2
    8. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، يعد المجلس 10 مل النمو المتوسطة وتستكمل مع بوروميسين (4 ميكروغرام/مل) لأحد T75 قارورة وإجراء تغيير متوسطة. أن تدرك أن جميع الحلول المتوسطة المطبقة على الخلايا يجب أن يكون المعالجون مسبقاً إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، تغيير متوسطة يمكن أن يؤديها 4-6 ح بعد الطلاء عند الشعيرات الدموية ينبغي أن تعلق على السطح. احتضان الخلايا حتى يتحقق التقاء 60-95%، عادة ما تكون من 3-5 أيام من ذوبان الجليد. عدم الوw الخلايا للتوصل إلى التقاء 100% لتجنب إعاقة الاتصال التي يمكن أن توقف الخلية زيادة النمو.
      يوم 4-6
    9. عندما يتم تحقيق كونفلوينسي المطلوب، مرور خلايا بطانية لإدراج نفاذية الأغشية (انظر القسم 2-2). إذا كونفلوينسي المرجوة لم تتحقق في يوم 4، يتم إجراء تغيير في المتوسط. في موعد أقصاه يوم 6، ينبغي أن يكون باساجيد الخلايا إلى إدراج نفاذية الأغشية. وإذا لم يتحقق كونفلوينسي المطلوبة قبل يوم 6، الخلايا غير مناسبة للاستخدام التجريبي.
      ملاحظة: إعداد أستروسيتيس للبلدان المتبرعة الصافية: عند إعداد نموذج ثقافة المشارك، 2-ينبغي إعداد astrocytes الأسبوع عمره 8 في الثقافة (انظر الجزء 4) لنموذج الثقافة المشارك عن طريق إجراء تغيير متوسطة في اليوم قبل باساجينج خلايا بطانية لإدراج. لكل أستروسيتي الاستعداد جيدا، ميليلتر 1500 من متوسط النمو astrocyte تتألف من دميم انخفاض الجلوكوز تستكمل مع 10% FBS والبنسلين (100 U/mL) ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل)، ثم قم بإجراء التغيير المتوسطة-
  2. نمو ببيكس على "نفاذية الغشاء إدراج" (5 أيام)
    يوم 4-6
    1. إدراج تحضير نفاذية الأغشية (لوحة 12-جيدا مع إدراج 1.12 سم 2 مساحة السطح، 0.4 ميكرومتر المسام) ل البذر للمجلس بطلاء مع الكولاجين الرابع (500 ميكروغرام/مل) وفيبرونيكتين (100 ميكروغرام/مل) في ddH 2 ميليلتر O. استخدام ما يقرب من 300 لكل إدراج، والتأكد من أن الحل الذي يغطي كامل سطح المتنامية. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5% CO 2 للحد أدنى من 2 حاء
    2. إعداد 30 مل من المجلس النمو المتوسطة (لتشكيل وسائل الإعلام، الرجوع إلى الفقرة 2.1.2) دون بوروميسين-
    3. نضح أغسل بلطف مرتين مع 5 مل PBS العقيمة في درجة حرارة الغرفة والمتوسطة من الثقافة المجلس في قارورة T75.
    4. تريبسينيزي الخلايا بإضافة 2 مل من محلول يدتا التربسين (2.5% التربسين، 0.1 nM يدتا في برنامج تلفزيوني) إلى T75، ومكان قارورة على 37 درجة مئوية، 5% CO 2 ل 5-7 دقيقة
    5. لفصل خلايا غشائي الدماغ، واضغط برفق على الجانب من قارورة T75 مع أطراف الأصابع، في نهاية المطاف ترك بيريسيتيس الباقين على قيد الحياة وأقوى إرفاق على سطح قارورة. التحقيق بصريا مفرزة تحت مجهر. عندما يلاحظ مفرزة 80%، وقف تريبسينيزيشن بإضافة 5 مل متوسطة.
    6. نقل الحل خلية إلى أنبوب 15 مل باستخدام الماصة 10 مل وتدور أسفل الخلايا غشائي الدماغ بالطرد المركزي في 250 x ز، 4 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    7. بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في المتوسط 1 مل. عندما علقت، إضافة مل 2 مزيد من المتوسطة تحقيق الحجم الإجمالي إلى 3 مل
    8. حساب عدد الخلايا يدوياً باستخدام خلية العد الدائرة أو خلية تلقائي عد النظام. تعد حلاً خلية 2.2 x 5 10 خلايا/مل المتوسطة، نتج عنه كثافة بذر نهائية 1.1 × 10 5 خلايا/إدراج.
      9. إزالة الحل الطلاء من إدراج نفاذية الأغشية
    9. ونقل 500 ميليلتر من تعليق خلية لكل إدراج. على واحد من إدراج، إضافة المتوسطة فقط واستخدم هذا الإدراج ' تصفية فقط ' التحكم للقياسات طير.
    10. إنشاء خلايا بطانية مولودية, مولودية مع ACM، أو في لجنة التنسيق الوطنية مع أستروسيتيس بالطريقة التالية:
      1. "لمولودية": ميليلتر 1500 إضافة المجلس النمو المتوسطة/الأسبستوس كل من لوحة 12-البئر تحت إدراج نفاذية الأغشية جيدا. مكان إدراج نفاذية الأغشية في 37 درجة مئوية، 5% CO 2 واحتضانها لأيام 2-
      2. "للبلدان المتبرعة الصافية": إدراج نقل إلى الآبار مع astrocytes منتعشة مع متوسط النمو astrocyte في اليوم السابق. مكان إدراج نفاذية الأغشية في 37 درجة مئوية، 5% CO 2 واحتضانها لأيام 2-
        ملاحظة: احذر من استخدام أنواع وسائل الإعلام المختلفة في الآبار السفلي من النماذج الثلاثة-
        يوم 6-8
    11. في اليوم 2، تغيير وسائط الإعلام بشأن إدراج نفاذية الأغشية مع ببيكس. إعداد 500 ميليلتر من المجلس النمو المتوسطة الواحدة وإدراج، وإجراء التغيير إلى تقليل تعطل طبقة الخلية بعناية. احتضان الخلايا لمدة يومين. انتبه إلى أن يتم إجراء تغيير وسائل الإعلام على إدراج فقط، وليس على الآبار أسفل.
  3. التحفيز مع "عوامل التمايز" (1-2 أيام)
    يوم 8-10
    1. لكل من نماذج مختلفة، وينبغي إعداد تحفيز وسائل الإعلام كما يلي:
      1. ل MC: لكل إدراج والاستعداد جيدا، 500 ميليلتر من المجلس النمو المتوسطة المحتوية على معسكر (250 ميكرومتر)، الهيدروكورتيزون (550 نانومتر) وريال عماني (17.5 ميكرومتر).
        MC: إعداد بالإضافة إلى ذلك 1500 ميليلتر من المجلس النمو المتوسطة المحتوية على معسكر (250 ميكرومتر)، الهيدروكورتيزون (550 نانومتر) وريال عماني (17.5 ميكرومتر).
        مولودية مع ACM: ذوبان الجليد ميليلتر 1500 الأسبستوس واستكمالها بمعسكر (250 ميكرومتر)، الهيدروكورتيزون (550 نانومتر) وريال عماني (17.5 ميكرومتر).
      2. "للبلدان المتبرعة الصافية": لكل إدراج، إعداد 500 ميليلتر من المجلس النمو المتوسطة المحتوية على معسكر (250 ميكرومتر)، الهيدروكورتيزون (550 نانومتر) وريال عماني (17.5 ميكرومتر). لكل أستروسيتي جيدا، وإعداد 1500 ميليلتر من دميم/و-12 وتستكمل مع البنسلين (100 U/mL) وستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل)، الهيبارين (يو 15/mL)، معسكر (250 ميكرومتر)، الهيدروكورتيزون (550 نانومتر) وريال عماني (17.5 ميكرومتر).
    2. لكل من نماذج مختلفة، إجراء تبادل وسائل الإعلام كما يلي:
      1. "لمولودية": بعناية نضح المتوسطة من الآبار وإدراج وإضافة متوسطة التمايز إلى كل الأجزاء الأخرى، استخدام 500 ميليلتر لكل إدراج و 1500 ميليلتر لكل بئر. أن تدرك أن تعطل على جانبي للإدراج يمكن أن تؤثر على وتعطيل طبقة الخلية.
      2. "للبلدان المتبرعة الصافية": بعناية نضح المتوسطة من الآبار وإضافة 750 متوسطة التمايز ميليلتر كل بئر. نضح المتوسطة من إدراج وإضافة 500 ميليلتر التمايز المتوسطة كل إدراج بعناية. ثم أضف متوسطة التمايز ميليلتر 750 المتبقية لكل أستروسيتي جيدا.
    3. لجميع الموديلات: وضع الخلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO 2 واحتضان مع متوسطة التمايز حتى اليوم التالي-
      ملاحظة: يمكن تدرك أن للمركز مع أستروسيتيس، أستروسيتيس من هذه النقطة في المتوسط خالية من المصل.

3. قياسات طير

  1. في اليوم بعد تحفيز الخلايا بالتمايز المتوسطة، إعداد نظام الدائرة قياس مقاومة الأنسجة للقياسات طير قبل الشطف الدائرة مرتين مع ddH 2 س، مرة واحدة مع 70% EtOH لمدة 5 دقائق و 2 مرات أكثر مع ddH 2 أولمبيك
  2. إضافة 4 مل من دميم/و-12 إلى دائرة قياس مقاومة الأنسجة وتوصيله إلى النظام ومعايرة لما يقرب من 30 دقيقة حسب الإعدادات التالية: R = 0، اختبار R = 1000، وضع = ر.
  3. إجراء القياسات طير بعناية وضع تدرج في قاعة قياس مقاومة الأنسجة. لكل إدراج، إجراء قياسات في ثلاث نسخ، وحساب متوسط Ω سم 2.
    ملاحظة: من المتوقع لنموذج الثقافة المشارك، قيم طير للوصول إلى > Ω 500 سم 2. إذا لم يتم التوصل إلى المستوى المناسب طير اليوم الأول لقياس طير، إضافة عوامل التمايز جديدة (معسكر (250 ميكرومتر)، الهيدروكورتيزون (550 نانومتر) وريال عماني (17.5 ميكرومتر)) وقياس طير مرة أخرى في اليوم التالي. عندما يتم تحقيق مستويات مناسبة، ينبغي أن يكون النموذج جاهز للتجربة المزمعة. كن على علم أن الخلايا يجب أن تقع على الأقل 3 ح قبل إجراء التجربة لاسترداد بعد قياسات طير. بعد التحفيز، وقيم طير عموما تظل مقبولة ح 24-48 بعد التحفيز.
    ملاحظة: أسلوب بديل وأسرع باستخدام زوج القطب STX-100 ج جامدة أيضا سجلات طير عالية في هذا النموذج 81. إيلي STX2 مرنةزوج كترودي يعطي قراءات أقل موثوقية.

4. ASTROCYTES التحضير لثقافة عدم الاتصال المشارك: أسلوب بديل

  1. تنقية أستروسيتيس
    1. لكل الفئران الدماغ المستخدمة، معطف قوارير T75 2 بإضافة 10 مل من بولي-L-يسين (5 ميكروغرام/مل) في ddH 2 س إلى كل قارورة T75. احتضان قوارير في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30
    2. عزلة astrocytes يمكن أن يؤديها كما يلي:
      1. فأر أستروسيتيس:
        1. ديكابيتاتي 2 1-2 يوم من العمر الفئران باستخدام أسلوب معتمدة.
        2. قطع الجلد خارج الجمجمة بدءاً من الرقبة نحو الآنف، وقطع العظام مع شق السهمي.
        3. فتح الجمجمة مع منحنى ملقط وتأخذ بها الدماغ ووضعه في أنبوب 15 مل (أنبوب 1) مع 11 مل من دميم الجلوكوز منخفضة وتستكمل مع 10% FBS ومع الجنتامايسين كبريتات (125 ميكروغرام/مل).
        4. بعناية إزالة السحايا استخدام الملقط غرامة-نصيحة وتعليق مواد الدماغ باستخدام ماصة 1 مل.
      2. أستروسيتيس الخنزيري:
        1. 1 الحصول على الدماغ من خنزير المحلي البالغ من العمر 5-6 أشهر-
        2. بعناية إزالة السحايا من الدماغ باستخدام الملقط نصيحة غرامة و/أو الأيدي-
        3. ز 4 جمع رمادية المسألة من الدماغ ومكان القطع في 1-2 مل دميم الجلوكوز منخفضة وتستكمل مع 10% كبريتات FBS ومع الجنتامايسين (125 ميكروغرام/مل) في طبق بتري. إذا كانت القطع كبيرة، فرم مع المشارط أو الملقط.
        4. تعليق المواد المعزولة باستخدام ماصة 1 مل، نقله إلى أنبوب 15 مل (أنبوب 1) والتعبئة مع الجلوكوز منخفضة دميم وتستكمل مع 10% كبريتات FBS ومع الجنتامايسين (125 ميكروغرام/مل) لوحدة تخزين إجمالي 11 مل.
          5. مواصلة المجانسة المواد المعزولة بإبرة طويلة تعلق على حقنه 10 مل
        5. وتعليق صعودا وهبوطاً 3 مرات. انتظر حتى استقروا القطع الكبيرة في الجزء السفلي من الأنبوب، ثم جمع متوسطة 7 مل من الجزء العلوي من الأنبوب (أنبوب 1)-
        6. تصفية تعليق خلية 7 مل من خلال عامل تصفية نايلون 40 ميكرومتر في أنبوب 50 مل جديدة (أنبوب 2)-
          7. متوسطة
        7. مل 7 إضافة أنبوب 1 مع الدماغ. مواصلة تحقيق التجانس والترشيح من الخطوات 4.1.2.2.5-6 حتى حجم تعليق الخلية التي تم تصفيتها في أنبوب 2 ما يقرب من 35 مل.
    3. إزالة الحل الطلاء من قوارير T75 [خطوة 4.1.1]. غسيل سريع مع 5 مل برنامج تلفزيوني بعد الحضانة مع بولي-L-يسين يمكن استخدامها للتأكد من أن الخلايا هي لا يتضرر أي آثار سمية للحل الطلاء.
      4. تقسيم
    4. والبذور الحل astrocyte معزولة التساوي بين قوارير T75. احتضان قوارير في 37 درجة مئوية، 5% CO 2 لمدة 3-5 أيام-
  2. أستروسيتيس استزراع وإعداد NCC مع "خلايا بطانية" (3 أسابيع)
    1. الثقافة الأولية
      1. بعد 3-5 أيام للحضانة، إجراء تغيير متوسطة بعناية يسفط المتوسطة وإضافة 10 مل دميم الجلوكوز منخفضة وتستكمل مع 10% FBS ومع الجنتامايسين كبريتات (125 ميكروغرام/مل).
        ملاحظة: بعد التغيير المتوسطة الأولى المتوسطة يجب تغيير كل 5 أيام. خلال الأسبوعين الأولين، اهتز قوارير وغسل الخلايا تماما مع برنامج تلفزيوني عند تغيير المتوسطة. وهذا يساعد في إزالة تلويث microglia.
      2. بعد 3 أسابيع زراعة، تريبسينيزي الخلايا بإضافة 2 مل من محلول التربسين أدتا إلى الجزء السفلي من كل قارورة T75، واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية، 5% CO 2 ل 5-7 دقيقة
      3. وقف تريبسينيزيشن بإضافة 5 مل متوسطة ونقل حل خلية أنبوب 15 مل والطرد المركزي astrocytes في 250 x g، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 7
      4. بعناية إزالة المادة طافية وتعليق إعادة الخلايا في تجميد حل يتكون من 10% [دمس] في FBS-
        5. حساب عدد الخلايا
      5. وإعداد حل خلية 4.0 × 10 6 خلايا/مل. تجميد الخلايا في إضافة 1 مل كل قنينة كريوفيالس.
    2. النمو في "نفاذية الغشاء إدراج نظام أسفل الآبار" (2-12 أسبوعا)
      1. إعداد لوحات 12-جيدا لنمو أستروسيتيس بإضافة 1 مل من بولي-L-يسين (5 ميكروغرام/مل) في ddH 2 س لكل بئر. وضع اللوحات في 37 درجة مئوية حاء 2
      2. لكل لوح 12-جيدا، وإعداد 25 مل من أستروسيتي النمو المتوسطة (دميم الجلوكوز منخفضة وتستكمل مع 10% FBS والبنسلين (100 U/mL) وستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل))-
      3. جلب قنينة أستروسيتيس من النتروجين السائل وإذابة الخلايا بإضافة 750 ميليلتر دميم الجلوكوز منخفضة متوسطة. بدقة "الماصة؛" صعودا ونزولاً ذوبان الجليد وتجانسه بتعليق. عندما مذاب، نقل الخلية-التعليق على أنبوب 15 مل وإضافة المتوسطة إلى إجمالي حجم مل 7-
        تنبيه: نيتروجين سائل درجة حرارة منخفضة للغاية، وحتى ملابس الحماية الشخصية مثل القفازات.
      4. لإزالة التجميد المتوسطة، تدور الشعيرات الدموية إلى أسفل في 250 x ز، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 7
      5. نضح المادة طافية بعناية وتعليق إعادة الخلايا في المتوسط-
        6. إزالة الطلاء من آبار لوحات جيدا 12
      6. ونقل تعليق خلية إلى الآبار استخدام 1 مل لكل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5% CO 2-
      7. تحديث في المتوسط كل يوم ثالث والثقافة الخلايا للحد أدنى من 2 أسابيع قبل استخدام الخلايا لثقافة التعاون مع خلايا بطانية. يمكن أن تستخدم الخلايا لثقافة المشارك لمدة تصل إلى 12 أسبوعا بعد ذوبان الجليد، مع سن الأمثل حاليا 2-8 أسابيع-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إنشاء BBB نماذج في المختبر

في أسلوب عرضها، والأمثل، أجريت زراعة ببيكس وإنشاء نظام إدراج نفاذية الأغشية مع MC أو دون ACM أو NCC مع أستروسيتيس (الشكل 1) لفترة من 9-11 يوما (الشكل 2). لاختيار خلايا بطانية، اقترن ثقافة أولية من الشظايا الشعرية المنقي بالعلاج بوروميسين لمدة أقصاها 5 أيام، والقضاء على معظم الخلايا تلويث وتشجيع نمو الخلايا البطانية على شكل المغزل من الشظ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنقية وانتشار للمجلس

أثناء إجراء تنقية، تشمل الخطوات الحاسمة الإزالة السريعة والفعالة للسحايا والفصل بين المسألة الأبيض والرمادي، ومهمة لتنقية الغلة والنقاء وإنشاء النموذج الصحيح. لعرضها في المختبر BBB الطراز باستخدام ببيكس، تحسين وتبسيط إجراء تنقية استناداً إلى تجانس الميكانيكية للمادة الرمادية معزولة، حجم انتقائية التصفية لعزل ميكروفيسيلس، الهضم مع كولاجيناز ، الدناز والتربسين، مع ثقافة الشظايا ميكروفيسيل أولى. بشكل عام، واحداً من التحديات الرئيسية التي تواجه أثناء تنقية وزراعة الخلايا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واضعي التقرير لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يود أن يعترف بروون هيلانة إليزابيث وسارة كريستين كريستنسن نيلز كريستيانسن م. للحصول على المساعدة التقنية، ومنح مؤسسة Lundbeck رقم R155-2013-14113.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فيبرونيكتينسيجما ألدريتشF1141
الكولاجين الرابعسيجما ألدريتشC5533
بولي إل ليسينسيجما ألدريتشP1524
DMEM / F-12لونزاBE12-719F
DMEM / منخفض الجلوكوزسيجما ألدريتشD6046
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو إنفيتروجين15140
مصل مشتق من البلازما (PDS)First Link UK Ltd.60-00-89
مصل الأبقار الجنين (FBS)جيبكو إنفيتروجين10-270-106
التربسين / EDTAجيبكو إنفيتروجين15090-046
الهيبارينسيجما ألدريتشH3393
بورومايسينسيجما ألدريتشP8833
هيدروكورتيزونسيجما ألدريتشH4001
8-CPT-cAMPBiologC010
RO 20-1724Sigma-AldrichB8279
جنتاميسين كبريتاتلونزا17-518Z
DMSOSigma-Aldrich34896
PBSSigma-AldrichD8537
EtOHVWR20،824،296امزج محلول 70٪ من 96٪ EtOH
DNAse 1Sigma-AldrichD4513
كولاجيناز CLS2سيجما ألدريتشC6885
ddH2< / sub>Oمصنوع من قوارير Elga
System T75 إدراجThermo Scientific156499
Costar Transwell (إدراج غشاء نفاذية للخلية)كوستارCLS3401صفيحة 12 بئر ، قطر 12 مم ، 0.4 مو ؛ غشاء بولي كربونات
15 مل أنابيب طرد مركزيCellstar188271
50 مل أنابيب طرد مركزيCellstar227261
أطباق بتريThermo Scientific150350
قوارير Cryoزجاجة Thermo Scientific377224
500 ملThermo Scientific159910/159920
مشارطSwann-MortenREF021124
مجانس الأنسجةSigmaD9188
140 & مرشحات mMERCKNY4H04700
40 & mu ؛ مرشحات mنظام غرفة Corning431750
EndOhmPrecision InstrumentsENDOHM-12غرفة EndOhm لنظام
القطب الكهربائي EVOM2Precision Instruments300523 + STX100Cقياس TEER مع زوج قطب كهربائي صلب STX-100C
إبرة طويلةSigmaنعلق على حقنة
ملقط منحني بطرف دقيقKLS Martin12-409-12-07
ملقط عريض الرأسVWR82027-390
حامل فلترMERCK MiliporeSwinnex-47
50 مل حقنةبراون4617509F
10 مل حقنةTerumoSSt20ESI
المضادة للجسم المضاد للإكلودينAbcamab317211:100
Anti-p120 مختبرات نقل الأجسام المضادة للكاتينينBD6101331: 200
الأجسام المضادة المضادة ل ZO-1Invitrogen61-73001: 200
الأجسام المضادة المضادة للكلودين 5سيجما ألدريتشSAB45029811:100
الحمار المضاد للأرانب IgG مقترن بدقيق Alexa 568Thermo ScientificA100421: 500
الحمار المضاد للفأر IgG مقترن بدقيق Alexa 488Thermo ScientificA212021: 500
السكروزبيركين إلمرNEC100X250UC0.15 & micro ؛ لتر / مل العمل النهائي conc
Lucifer YellowSigmaL014410 & micro ؛ جم / مل العمل النهائي conc
نوع World World نظام

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 0 (0), 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  4. Abbott, N. J. Anatomy and Physiology of the Blood-Brain Barriers. Drug Delivery to the Brain SE - 1. 10, 3-21 (2014).
  5. Igarashi, Y., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood-brain barrier. Biochem Biophys Res Commun. 261 (1), 108-112 (1999).
  6. Sobue, K., et al. Induction of blood-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. Neurosci Res. 35 (2), 155-164 (1999).
  7. Hoheisel, D., et al. Hydrocortisone Reinforces the Blood-Brain Barrier Properties in a Serum Free Cell Culture System. Biochem Biophys Res Commun. 244 (1), 312-316 (1998).
  8. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke; a journal of cerebral circulation. 30 (8), 1671-1678 (1999).
  9. Takeshita, T., et al. Cilostazol attenuates ischemia-reperfusion-induced blood-brain barrier dysfunction enhanced by advanced glycation endproducts via transforming growth factor-β1 signaling. Mol cell neurosci. 60, 1-9 (2014).
  10. DeBault, L. E., Kahn, L. E., Frommes, S. P., Cancilla, P. A. Cerebral microvessels and derived cells in tissue culture: Isolation and preliminary characterization. In Vitro. 15 (7), 473-487 (1979).
  11. Bowman, P. D., et al. Primary Culture of Capillary Endothelium from Rat Brain. In Vitro IN VITRO Tissue Culture Association. 17 (4), 353-362 (1981).
  12. Bowman, P. D., Ennis, S. R., Rarey, K. E., Lorris Betz, A., Goldstein, G. W. Brain microvessel endothelial cells in tissue culture: A model for study of blood-brain barrier permeability. Annals of Neurology. 14 (4), 396-402 (1983).
  13. Rubin, L. L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  14. Wang, W., Dentler, W. L., Borchardt, R. T. VEGF increases BMEC monolayer permeability by affecting occludin expression and tight junction assembly. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 280 (1), H434-H440 (2001).
  15. Cantrill, C. A., Skinner, R. A., Rothwell, N. J., Penny, J. I. An immortalised astrocyte cell line maintains the in vivo phenotype of a primary porcine in vitro blood-brain barrier model. Brain Research. 1479, 17-30 (2012).
  16. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Joan Abbott, N. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Research. 1521, 16-30 (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Research. 1521, 1-15 (2013).
  18. Patabendige, A., Abbott, N. J. Primary Porcine Brain Microvessel Endothelial Cell Isolation and Culture. Current Protocols in Neuroscience. 69, 3.27.1-3.27.17 (2014).
  19. Teow, H. M., Zhou, Z., Najlah, M., Yusof, S. R., Abbott, N. J., D'Emanuele, A. Delivery of paclitaxel across cellular barriers using a dendrimer-based nanocarrier. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 701-711 (2013).
  20. Dickens, D., et al. A Multi-System Approach Assessing the Interaction of Anticonvulsants with P-gp. PLoS ONE. 8 (5), e64854(2013).
  21. Yusof, S. R., Avdeef, A., Abbott, N. J. In vitro porcine blood-brain barrier model for permeability studies: pCEL-X software pKaFLUX method for aqueous boundary layer correction and detailed data analysis. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 65, 98-111 (2014).
  22. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A Triple Culture Model of the Blood-Brain Barrier Using Porcine Brain Endothelial cells, Astrocytes and Pericytes. PLOS ONE. 10 (8), e0134765(2015).
  23. Liew, K. -F., Hanapi, N. A., Chan, K. -L., Yusof, S. R., Lee, C. -Y. Assessment of the Blood-Brain Barrier Permeability of Potential Neuroprotective Aurones in Parallel Artificial Membrane Permeability Assay and Porcine Brain Endothelial Cell Models. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (2), 502-510 (2017).
  24. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and molecular neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  25. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990 (1), 95-112 (2003).
  26. Paolinelli, R., et al. Wnt Activation of Immortalized Brain Endothelial Cells as a Tool for Generating a Standardized Model of the Blood Brain Barrier In Vitro. PLoS ONE. 8 (8), e70233(2013).
  27. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of Immortalized bEnd5 and Primary Mouse Brain Microvascular Endothelial Cells as in vitro Blood-Brain Barrier Models for the Study of T Cell Extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 31 (1), 315-327 (2011).
  28. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. The Journal of Physiology. 565 (2), 475-486 (2005).
  29. Silwedel, C., Förster, C. Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli. Journal of Neuroimmunology. 179 (1-2), 37-45 (2006).
  30. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid Insensitivity at the Hypoxic Blood-Brain Barrier Can Be Reversed by Inhibition of the Proteasome. Stroke. 42 (4), 1081-1089 (2011).
  31. Neuhaus, W., et al. Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells. Neuroscience letters. 506 (1), 44-49 (2012).
  32. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Fӧrster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352(2014).
  33. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  34. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Kunkel, S. L., Andjelkovic, A. V. Potential role of MCP-1 in endothelial cell tight junction 'opening': signaling via Rho and Rho kinase. Journal of Cell Science. 116 (22), 4615-4628 (2003).
  35. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Research. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  36. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Niwa, M., Falus, A., et al. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm Res. 52, Suppl 1. S39-S40 (2003).
  37. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  38. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. Journal of Visualized Experiments. (88), e51278(2014).
  39. Rutten, M. J., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Electrical resistance and macromolecular permeability of brain endothelial monolayer cultures. Brain research. 425 (2), 301-310 (1987).
  40. Cecchelli,, et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Advanced drug delivery reviews. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  41. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. Journal of neurochemistry. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  42. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  43. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. The AAPS journal. 12 (4), 759-770 (2010).
  44. Helms, H. C., Madelung, R., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. In vitro evidence for the brain glutamate efflux hypothesis: Brain endothelial cells cocultured with astrocytes display a polarized brain-to-blood transport of glutamate. Glia. 60 (6), 882-893 (2012).
  45. Garberg, P., et al. In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro. 19 (3), 299-334 (2005).
  46. Helms, H. C., Hersom, M., Kuhlmann, L. B., Badolo, L., Nielsen, C. U., Brodin, B. An Electrically Tight In Vitro Blood–Brain Barrier Model Displays Net Brain-to-Blood Efflux of Substrates for the ABC Transporters, P-gp, Bcrp and Mrp-1. The AAPS Journal. 16 (5), 1046-1055 (2014).
  47. van der Sandt, I. C., et al. Assessment of active transport of HIV protease inhibitors in various cell lines and the in vitro blood--brain barrier. AIDS. 15 (4), London, England. 483-491 (2001).
  48. Schaddelee, M. P., et al. Functional role of adenosine receptor subtypes in the regulation of blood-brain barrier permeability: possible implications for the design of synthetic adenosine derivatives. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 19 (1), 13-22 (2003).
  49. Malina, K. C. -K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Research. 1284, 12-21 (2009).
  50. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain research. 818 (1), 65-71 (1999).
  51. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. -J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  52. Thanabalasundaram, G., El-Gindi, J., Lischper, M., Galla, H. -J. Methods to Assess Pericyte-Endothelial Cell Interactions in a Coculture Model. Methods Mol Biol. 686, 379-399 (2011).
  53. von Wedel-Parlow, M., Wölte, P., Galla, H. -J. Regulation of major efflux transporters under inflammatory conditions at the blood-brain barrier in vitro. Journal of Neurochemistry. 111 (1), 111-118 (2009).
  54. Zozulya, A., Weidenfeller, C., Galla, H. -J. Pericyte-endothelial cell interaction increases MMP-9 secretion at the blood-brain barrier in vitro. Brain Research. 1189, 1-11 (2008).
  55. Mahringer, A., Delzer, J., Fricker, G. A fluorescence-based in vitro assay for drug interactions with breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (3), 605-613 (2009).
  56. Gutmann, H., Török, M., Fricker, G., Huwyler, J., Beglinger, C., Drewe, J. Modulation of Multidrug Resistance Protein Expression in Porcine Brain Capillary Endothelial Cells In Vitro. Drug Metabolism and Disposition. 27 (8), (1999).
  57. Skinner, R., Gibson, R., Rothwell, N., Pinteaux, E., Penny, J. Transport of interleukin-1 across cerebromicrovascular endothelial cells. British Journal of Pharmacology. 156 (7), 1115-1123 (2009).
  58. Van Gelder, W., Huijskes-Heins, M. I. E., Van Dijk, J. P., Cleton-Soeteman, M. I., Van Eijk, H. G. Quantification of Different Transferrin Receptor Pools in Primary Cultures of Porcine Blood-Brain Barrier Endothelial Cells. Journal of Neurochemistry. 64 (6), 2708-2715 (2002).
  59. Huwyler, J., Drewe, J., Klusemann, C., Fricker, G. Evidence for P-glycoprotein-modulated penetration of morphine-6-glucuronide into brain capillary endothelium. British journal of pharmacology. 118 (8), 1879-1885 (1996).
  60. Walters, E. M., Agca, Y., Ganjam, V., Evans, T. Animal models got you puzzled?: think pig. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245 (1), 63-64 (2011).
  61. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. -M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Current drug metabolism. 14 (1), 120-136 (2013).
  62. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  63. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. , (2017).
  64. Xu, C. -Y., Zhu, H. -M., Wu, J. -H., Wen, H., Liu, C. -J. Increased permeability of blood-brain barrier is mediated by serine protease during Cryptococcus meningitis. Journal of International Medical Research. 42 (1), 85-92 (2014).
  65. Roberts, D. J., Goralski, K. B. A critical overview of the influence of inflammation and infection on P-glycoprotein expression and activity in the brain. Expert opinion on drug metabolism, toxicology. 4 (10), 1245-1264 (2008).
  66. Correale, J., Villa, A. The blood-brain-barrier in multiple sclerosis: functional roles and therapeutic targeting. Autoimmunity. 40 (2), 148-160 (2007).
  67. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
  68. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 90 (11), 1681-1698 (2001).
  69. Franke, H., Galla, H., Beuckmann, C. T. Primary cultures of brain microvessel endothelial cells: a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro. Brain research. Brain research protocols. 5 (3), 248-256 (2000).
  70. Schulze, C., Smales, C., Rubin, L. L., Staddon, J. M. Lysophosphatidic acid increases tight junction permeability in cultured brain endothelial cells. Journal of neurochemistry. 68 (3), 991-1000 (1997).
  71. Cohen-Kashi-Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Mechanisms of glutamate efflux at the blood-brain barrier: involvement of glial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (1), 177-189 (2012).
  72. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. Journal of cell science. , 23-37 (1992).
  73. Parkinson, F. E., Hacking, C. Pericyte abundance affects sucrose permeability in cultures of rat brain microvascular endothelial cells. Brain Research. 1049 (1), 8-14 (2005).
  74. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. Journal of Neurochemistry. 93 (2), 279-289 (2005).
  75. Dobrogowska, D. H., Lossinsky, A. S., Tarnawski, M., Vorbrodt, A. W. Increased blood-brain barrier permeability and endothelial abnormalities induced by vascular endothelial growth factor. Journal of neurocytology. 27 (3), 163-173 (1998).
  76. Harhaj, N. S., Barber, A. J., Antonetti, D. A. Platelet-derived growth factor mediates tight junction redistribution and increases permeability in MDCK cells. Journal of Cellular Physiology. 193 (3), 349-364 (2002).
  77. Wang, W., Merrill, M. J., Borchardt, R. T. Vascular endothelial growth factor affects permeability of brain microvessel endothelial cells in vitro. The American journal of physiology. 271 (6 Pt 1), C1973-C1980 (1996).
  78. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of neurochemistry. 71 (3), 1151-1157 (1998).
  79. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Research. 1150, 1-13 (2007).
  80. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28 (1), 135-148 (2008).
  81. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved In Vitro Blood-Brain Barrier Model: Rat Brain Endothelial Cells Co-cultured with Astrocytes. Methods in molecular biology. 814, Clifton, N.J. 415-430 (2012).
  82. Boveri, M., et al. Induction of blood-brain barrier properties in cultured brain capillary endothelial cells: comparison between primary glial cells and C6 cell line. Glia. 51 (3), 187-198 (2005).
  83. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicology in Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  84. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of Molecular Medicine. 88 (7), 653-664 (2010).
  85. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J Pharmaceutical Sciences. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  86. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12 (1), 40(2011).
  87. Neuhaus, W., Lauer, R., Oelzant, S., Fringeli, U. P., Ecker, G. F., Noe, C. R. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. Journal of biotechnology. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  89. Prabhakarpandian, B., et al. SyM-BBB: a microfluidic blood brain barrier model. Lab on a Chip. 13 (6), 1093(2013).
  90. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة