Method Article

جهاز التقاط الصور الحية طويلة الأجل لتحسين التلاعب التجريبية من اليرقات الزرد

DOI:

10.3791/56340

⸱

October 27th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 3Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 4Cellular and Molecular Pathology Graduate Program, University of Wisconsin-Madison, 5Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Wisconsin-Madison, 6Department of Pediatrics, University of Wisconsin-Madison

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذه المخطوطة في زويدجي (الزرد إصابة والجهاز الفخ للنمو وتصوير)، وهو جهاز مجزأة تهدف إلى توجيه وكبح جماح اليرقات الزرد. ويسمح التصميم ترانسيكشن الذيل وطويلة الأجل جمع الصور مجهرية الفلورية العالية الاستبانة من التئام الجروح والتجديد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرقة الزرد كائن حي نموذجا هاما لعلم الأحياء التنموي والتئام الجروح. علاوة على ذلك، اليرقة الزرد نظاما قيماً ليعيش تصوير مجهرية ذات الدقة العالية للظواهر البيولوجية الحيوية في المكان والزمان مع القرار الخلوية. بيد أن الطريقة التقليدية لتغليف [اغروس] لتصوير مباشر يمكن أن تعوق التنمية اليرقات ونمو الأنسجة. ولذلك، يصف هذه المخطوطة في زويدجي (الزرد إصابة والجهاز الفخ للنمو وتصوير)، الذي صمم وملفقة كجهاز مستقلة وظيفيا لتوجيه اليرقات للفحص المجهري عالية الدقة مع السماح زعنفة والذيلية ترانسيكشن داخل الجهاز والتنمية اللاحقة الذيل غير المقيد وإعادة النمو. يسمح هذا الجهاز لإصابة وتصوير طويلة الأجل مع الحفاظ على السلامة. نظراً لأن العفن زويدجي 3D مطبوعة، التفصيل عن هندستها تجعل من تعديلها بسهولة للتطبيقات التصوير الزرد المتنوعة. وعلاوة على ذلك، يوفر زويدجي العديد من المزايا، مثل الوصول إلى اليرقة أثناء التجريب لإصابة أو لتطبيق المواد الكاشفة، توازيها التوجه لليرقات متعددة لتصوير مبسطة، وإعادة استخدام الجهاز.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدرة التجدد الزرد اليرقات دانيو rerio جعلها كائن نموذج مثالي دراسة استجابة الجرح فضلا عن تضميد الجراح وإعادة نمو1،2،،من34. الوصول إلى مجموعة من خطوط الزرد المعدلة وراثيا والشفافية التشريحية الزرد لمواصلة تعزيز فائدتها للدراسات في فيفو الجرح استجابة الأحداث، فضلا عن عمليات التجدد الأطول أجلاً4. دراسة هذه العمليات البيولوجية استخدام الاستبانة fluorescence الوقت الفاصل بين الفحص المجهري لذلك يطالب جهاز الزرد تصوير مباشر الذي يسمح لحركة الحد الأدنى لليرقة الزرد والاستقرار عالية مع الحفاظ على استمرارية. مفتاح أن يسمح هذا الجهاز لإصابة فعالة حين الشفاء والتجديد تحدث لم يتأثر بالجهاز.

القياسية يعيش التصوير الاستقرار طريقة تضمين اليرقة في [اغروس] أثناء تصوير لايف يحد من النمو والجرح التجديد5 وقد تزيد معدلات الوفاة منذ اليرقات تبدأ في إظهار علامة على نخر الإجهاد وأنسجة القلب بعد أربعة ساعات4. ولذلك، إزالة [اغروس] من المناطق ذات الاهتمام عادة الضرورية للسماح بالنمو الطبيعي والتجديد6، تعريض اليرقات للأضرار المحتملة ك [اغروس] قطع بعيداً. وعلاوة على ذلك، مع تضمين تقنية [اغروس]، المستخدم يجب توجيه اليرقات في وقت قصير قبل أن يقوي [اغروس]5،،من67. سرعة التلاعب اليرقة لا يتطلب مهارة للمستخدم، فإنه أيضا مخاطر الضرر إلى اليرقة. على الرغم من أن قد وصف أساليب لتحقيق استقرار اليرقة لتصوير مباشر للتحايل على هذه العيوب، مثل أجار مخدد الآبار3 أو ديفيتس8، استعمال المحجم سيليكون الشحوم إلى إنشاء دائرة لتصوير مع الأنابيب البلاستيكية أو غيرها المواد6، وانابيب التناوب9، العديد من هذه الأساليب هي العمالة المكثفة، وفوضوي، وغالباً غير القابل ولا تسمح بالتلاعب بالبيئة (المخدرات العلاجات، مما أدى إلى إصابة إلخ.) بعد أن تم تحميل الأسماك.

لذلك، تم تصميم الجهاز زويدجي (الشكل 1) للتغلب على بعض عيوب أجار المتصاعدة للتصوير حية طويلة الأجل من اليرقات الزرد بينما تسمح بالتلاعب بالعينة. زويدجي يتكون من ثلاث دوائر مستقلة شبه مفتوحة (الشكل 1A) للسماح لتحميل، ضبط النفس، مما أدى إلى إصابة والتصوير من 2 إلى 4 أيام بعد الإخصاب الزرد اليرقات. الجهاز ملفقة من "بولي دايمثيل سيلوكسان" (PDMS) وتوضع على كشف غطاء صحن التصوير أسفل الزجاج 60 ملم. تصميم المقدمة هنا المقصود لدراسات الجرح الشفاء، ولكن استخدام تصميم نمطي وتكنولوجيات التصنيع القياسية تجعل تصميم زويدجي قابلة للتعديل وقابلة لمجموعة متنوعة من الإجراءات التجريبية، خاصة بالنسبة للإجراءات التي وتتطلب الحد الأدنى من ضبط النفس مع التلاعب التجريبية وتصوير طويلة الأجل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: وضعت تصميم قاعدة زويدجي لليرقات الزرد التي هي من 2 إلى 4 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) واتبع المبادئ التوجيهية "مركز الموارد الحيوانات بحوث" جامعة ويسكونسن-ماديسون-

1-تصميم وطباعة 3D من قوالب

  1. النموذجي PDMS المكون من الجهاز مع الهندسات المطلوبة وسمات في 3D النمذجة البرمجيات 5. إنشاء جمعية لقالب فارغ والجزء PDMS وتوليد قالب سلبي للجزء PDMS عن طريق إنشاء تجويف في قالب المقابلة للجزء بدسم. حفظ القالب كملف.stl للطباعة ثلاثية الأبعاد ( الشكل 2، الخطوة 1.1)-
    ملاحظة: يتوفر ملف بتنسيق (.stl) المجسمة لقالب تصميم المقدمة هنا ( الشكل 1) للتحميل في https://morgridge.org/designs/-
    2. قوالب
  2. الطباعة باستخدام طابعة 3D صانعوا ( الشكل 2، الخطوة 1، 2). جعل قوالب متعددة الطباعة واحد، إذا كان ذلك ممكناً، يمكن مصبوب حتى أكثر من جهاز مع دفعة واحدة من PDMS.
    ملاحظة: طباعة المثال الموضح في وضع مرحبا الدقة مع 0.075 مم شعاع 0.05 مم وقطرها طبقة سمك، استخدام الراتنج صانعوا 5.
    1. العفن نظيفة استخدام فرشاة الجميلة، الكحول التشويه والتحريف في زجاجة رذاذ، والهواء المضغوط بلطف فرك وإزالة الراتنج أونكوريد. إزالة أي مواد من مناطق microchannel.
    2. ما بعد علاج العفن في جهاز الأشعة فوق البنفسجية علاج منصب لمدة 60 دقيقة على كل جانب كما الاستقالة أونكوريد السمية على اليرقات الزرد 10-
  3. الرمال الجانب تجويف القالب مع 200 الصنفرة حصى على سطح مستو حتى جميع السطوح الختم على اتصال مع الصنفرة (تحميل قناة هندستها ومحيط القالب). خفة الرمال مع 400 و 600 ورقة حصى الرمال، تدريجيا، لإنتاج أسطح ناعمة دافق عبر جميع الأغطية الهندسة ( الشكل 2، الخطوة 1، 3). قياس عمق التجويف بعد الصنفرة مع مؤشر الاتصال هاتفي للتحقق من أن أنها قريبة من عمق مصممة.
    1. تنظيف العفن وتغطي الأقراص (1 قطرها ¾ بوصة × ¼ بوصة سميكة البورسليكات الزجاج أو اﻷكريليك؛ زجاج واحدة تغطي كل العفن) عن طريق وضع في الموجات فوق الصوتية الأنظف مملوءة بالماء لمدة 30 دقيقة أو عن طريق المسح تحت الماء الجاري.
    2. ضربة الجافة مع الهواء المضغوط وتنظيف كلا العفن ويغطي مع كحول الأيزوبروبيل ومصفاة الهواء المضغوط. استخدام منضدة نظيفة كمكان لاختلاق الأجهزة لتقليل التلوث الناجم عن الحطام المحمولة جوا. إجازة تغطي قوالب تنظيفها والزجاج في مقاعد البدلاء نظيفة أو طبق بيتري مغطى حتى الحاجة.

2. تصنيع PDMS زويدجي جهاز

  1. جعل PDMS واسطة 184 صب سيليكون الاستومر بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) بنسبة 5:1 (قاعدة للمنشط) في كوب بلاستيك. المزيج جيدا لمدة 2 دقيقة مع عصا القوارب خشبية، إثارة الجل على نفسه، مثل عجين الخبز. لقوالب 5، استخدام 10 جرام من قاعدة وز 2 من المنشط.
    1. دي الغاز المخلوط في مجفف فراغ ل 25-45 دقيقة حتى ولت جميع الفقاعات.
    2. ملء تجويف كل من قوالب المطبوعة 3D مع حوالي 0.75 مل PDMS استخدام حقنه 10 مل حتى العفن تجاوزات طفيفة مع غضروف ( الشكل 2، 2.1 خطوة)-
    3. الغاز دي قوالب شغلها لمدة 45 دقيقة لإزالة فقاعات الإضافية التي قد شكلت عند ملء-
  2. تطبيق قرص غطاء زجاج على رأس العفن مليئة PDMS، ضغط القرص إلى أسفل بزاوية لمنع الفقاعات من المحاصرين ( الشكل 2، الخطوة 2، 2). السماح PDMS الزائدة بطردهم كما يتم تطبيقها غطاء القرص من الزجاج-
  3. استخدام المشبك السقاطة الصغيرة عقد القرص غطاء محكم للعفن.
    ملاحظة: وهذا يخلق سطح مستو مجرد PDMS علاجه وتنتج من خلال الثقوب دافق بكشف غطاء الزجاج فيها الهندسات المطبوعة 3D. وبدلاً من ذلك، زيادة عدد الأجهزة التي يمكن علاجها في وقت واحد، بناء جهاز المشبك متعددة (على سبيل المثال. الشكل 2، الخطوة 2، 3)-
  4. علاج الجهاز PDMS في قوالب فرضت على 100 س ج في فرن لمدة 90 دقيقة ( الشكل 2، الخطوة 2، 4). إزالة القوالب من الفرن والسماح لتبرد حتى يمكن معالجتها بسهولة. إذا كان الجهاز لقط المعدن، إزالة التجميع القرص العفن وغطاء من المشبك للحيلولة دون مواصلة علاج PDMS بسبب الحرارة المتبقية المعدن.
    ملاحظة: الجهاز أسهل لإزالة من العفن في حين لا يزال قليلاً دافئة ولا يشفي تماما. ومع ذلك، حالما تتم إزالة القالب من الفرن ويتم إزالة غطاء القرص، يمكن الجلوس الجهاز لبضعة أيام قبل الشروع في ديمولدينج. إذا كان الجهاز هو ديمولديد بعد وقت قصير من إزالة من الفرن علاج، ضعه في طبق بيتري مغطاة بتقليل الملوثات بينما يسمح لعلاج تماما.

3. زويدجي البلازما-الترابط إلى "صحن زجاج"

  1. المشبك العفن التي تحتوي على الجهاز PDMS في مقعد نائب حيث العفن ' تواجه الهندسات s يصل، موازية لمقاعد البدلاء محطة العمل.
    1. ابدأ لإزالة الجهاز PDMS عن طريق الإفراج عن علامة التبويب سحب PDMS من القالب باستخدام الملقط مسطحة ذات الرؤوس. العمل حول محيط القالب مع الملاقط (مثل إزالة كعكة من عموم ( الشكل 2، الخطوة 3.1))-
    2. استخدام تصفية الهواء المضغوط وملاقط لسحب الجهاز من العفن بلطف بالضغط على علامة التبويب السحب وتهب الهواء تحت الجهاز. العمل ببطء، السماح للهواء لمساعدة منفصلة PDMS من العفن، وأخذ الرعاية الخاصة مع النصائح من الملاقط حول مقاطع رقيقة النفق.
  2. وضع الجهاز PDMS رأسا إلى داخل غلاف طبق أدنى الزجاج حيث أنه لمس الأوتاد النفق الزجري البلاستيك ( الشكل 2، الخطوة 3.2)-
    3. ضع
  3. غطاء الطبق مع زويدجي رأسا والطبق الزجاج أدنى المقابلة في بلازما أنظف مع الزجاج الداخلية التي تواجه التصاعدي ( الشكل 2، الخطوة 3.3).
    1. إجلاء البلازما التنظيف الدائرة حتى يصل الضغط إلى 500 متور.
    2. مجموعة الطاقة تردد الراديو (RF) إلى أعلى. الكشف عن الجهاز والطبق على التردد الترددات اللاسلكية لحوالي 2 دقيقة ببطء إزالة الضغط على الدائرة وإرجاع الجهاز والطبق على غطاء غرفة نظيفة.
  4. إزالة الجهاز PDMS من تغطية الطبق. اقلب زويدجي PDMS إلى الاتجاه الصحيح على الزجاج بوضعه بعناية على مركز جيد للطبق أسفل الزجاج ( الشكل 2، الخطوة 3.4)
    1. استخدام نهاية الجزء الخلفي من الملاقط، اضغط على PDMS جروح طفيفة الجهاز ضمان فقاعات الهواء لا محاصرون تحت. تطبيق الضغط حول هندستها دقيقة من القنوات الصغيرة وتذليل PDMS الحواف ( الشكل 5).
      ملاحظة: الاتصال الكامل بين PDMS والزجاج يضمن التقيد أفضل من الترابط البلازما. يمكن أن يكون الجهاز زويدجي البلازما المستعبدين إلى تنسيقات أخرى طبق زجاج القاع، مثل بلات 6-جيدا زجاج القاعﻫ ( الشكل 2).
    2. ضع غطاء فوق الطبق الجهاز قبل إزالة من هود غرفة نظيفة.
      ملاحظة: بمجرد أن تم إصلاح الأجهزة للزجاج، البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً حتى تكون جاهزة للاستخدام-

4. قناة إعداد وتحميل اليرقات

ملاحظة: تربية الزرد العامة أجرى كل كتاب الزرد، متاح على الإنترنت في http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. وأبقى الزرد الكبار والأجنة كما هو موضح سابقا 1. وقد استخدم سلالة البرية نوع AB. تتبع المؤسسة ’ s "بروتوكول رعاية الحيوان" لتفاصيل محددة بشأن الاحتياجات للتصوير اليرقات الحية-

  1. شطف القنوات مع الحد ني إيثانول 70% 100 ميليلتر كل قناة، استخدام ميكروبيبيتي شطف من خلال التقييد نفق. إزالة الإيثانول وشطف 2 أو 3 مرات بماء مقطر مزدوجة. تسمح للهواء الجاف-
  2. ملء القنوات مع اللبن المقشود (بتركيز 1% المخفف في الماء) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة التقليل من يرقات التمسك ساترة زجاجية للطبق. ثم، بلطف تغرق الجهاز عدة مرات في الماء المقطر مزدوجة شطف. تسمح للهواء الجاف رأسا على عقب.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. يمكن أن يتم إعداد هذا الجهاز زويدجي عدة أيام قبل الاستخدام. مخزن المشمولة في درجة حرارة الغرفة-
    3. الحفاظ على
  3. نقطة تحضير ذوبان منخفضة 1% [اغروس] (LMP) عن طريق الجمع بين 100 ميليلتر 2% ذاب LMP [اغروس] مع 100 ميليلتر 2 x Tricaine (0.4 ملغ/مل تريكيني-إيثيل 3-أمينوبينزواتي) في المخزن المؤقت E3 11 استعد مسبقاً إلى 38 يا جيم 1% [اغروس]/تريكيني الحل في 38 س ج في كتلة ساخنة لمنع التبلور.
    ملاحظة: للفحص المجهري مولتيفوتون 11، استخدم أما المتغيرات الزرد المصطبغة الأمم المتحدة (مثل كاسبر 12) أو الحفاظ على اليرقات في E3 الذي يحتوي على 0.2 مم ن-والفنيل لمنع تشكيل الصباغ 11 للتقليل من امتصاص موجات الأشعة تحت الحمراء القريب بواسطة الصباغ-
    تنبيه: N-والفنيل السامة. تتبع المؤسسة ' s قواعد للتخلص منها.
    4. اليرقات
  4. أنيسثيتيزي في E3 المخزن المؤقت يحتوي على 0.2 مغ/مل تريكيني (تريكيني/E3) 11. انتظر حتى يرقات بلا حراك وعدم استجابة لحافز لمس.
    5. قبل الرطب
  5. القنوات مع ميكروليتيرس عدد قليل من تريكيني/E3.
    1. بيك حتى يرقة واحدة باستخدام تلميح ماصة واسعة فوهة. إيداع اليرقات في قناة التحميل ( الشكل 3A). استخدام أداة مماثلة، أو تلميح ماصة توجيه اليرقة في قاعة تحميل أن تواجه الجانب الظهرية استقامة حافة الدائرة تحميل ووجوه الذيل نحو النفق الزجري ( الشكل 3B).
    2. بعناية سحب السائل من قاعة إصابة، مما يتيح اليرقة في التدفق إلى النفق الزجري ( الشكل 3). إزالة معظم السائل مع الحفاظ على رطوبة حول اليرقة ( 3D الشكل). هذه العملية يمكن أن يساعده إمالة الطبق قليلاً نحو الدائرة مما أدى إلى جرح-
  6. وضع 1% LMP [اغروس] في تريكايني/E3 (~ 38 س ج) عبر اليرقة ' الرأس s، شغل الدائرة تحميل ( 3E الشكل). يسمح [اغروس] ترسيخ مع اليرقة في الموضع الصحيح. إضافة تريكيني/E3 للدائرة مما أسفر عن إصابة حسب الحاجة للحفاظ على الماء. كرر هذه العملية عملية للقنوات المتبقية 2 تحميل-
  7. استخدام إبرة حقنه، بعناية إزالة أي [اغروس] التي تسربت من خلال النفق تقييدي في الدائرة مما أسفر عن إصابة ( الشكل 3F). إضافة إضافية تريكيني/E3 أما ما يزيد قليلاً على [اغروس] (لإصابة، تصوير قصير، أو عزل المعاملة الجرح) أو لملء الطبق الثقافة (لتصوير طويلة الأجل). استبدال غطاء صحن الثقافة لمنع التبخر. يمكن تصويرها في هذه النقطة (المعافين) اليرقات أو جرح-

5. اليرقات مما أدى إلى إصابة والتصوير

  1. باستخدام شفرة مشرط معقم، قطاع زعنفة الذيل الخلفي ل notochord 11 في الدائرة مما أسفر عن إصابة ( الشكل 3 ز، ح). إضافة tricaine/E3 إضافية إذا لزم الأمر، واستبدال غطاء صحن الثقافة-
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، تبعاً للإطار الزمني الإنمائية ذات الاهتمام، يرقات يمكن أصيب بجروح، ويسمح باسترداد في E3 وصيانتها في حاضنة (28.5 س ج) حتى وقت التصوير المطلوب، عندها يمكن تحميلها إلى قنوات الموصوفة أعلاه.
    2. إدراج
  2. تثبيت الجهاز زويدجي مع تخديره اليرقات إلى مجهر مقلوب في مرحلة التي سوف تستوعب الطبق أسفل الزجاج 60 ملم. قم بتحديد موقع ذيل اليرقة في قناة العلوي، وتدوير الطبق حسب الحاجة للحصول على الذيل في الموضع المطلوب. الصورة كما هو مطلوب للتجربة محددة.
    ملاحظة: زويدجي قابل للتطبيق على نطاق واسع للفحص المجهري الخفيفة عالية الدقة، بما في ذلك ويديفيلد الأسفار والليزر الفحص المجهري. وهناك عدد من الاعتبارات المعلمة عند التصوير اليرقات الزرد، ولكن التصوير معلمات محددة الصك وعينه وتعتمد التجربة. هنا، تم تصويرها الذيل اليرقات على بناء مخصصة مجهر مولتيفوتون 5 ، 11 استخدام المعلمات التالية: 40 × طويلة العامل مسافة الماء الغمر الهدف، 890 الإثارة الليزر شمال البحر الأبيض المتوسط، 445/20 نانومتر تصفية الانبعاثات والقرار 512 × 512-

6. نهاية التجربة

  1. إزالة الطبق زويدجي من المجهر. Euthanize اليرقات عن طريق وضع زويدجي في حمام الماء المثلج أو في 4 س ج لمدة 20 دقيقة على الأقل، وتقييم لغياب نبضات القلب والدورة الدموية.
    ملاحظة: لأن يتم الحفاظ على اليرقات في أماكن منفصلة، اليرقات يمكن فردياً استردادها عن طريق سحب بلطف على أجار بالملقط أو ماصة. يمكن إزالة في أجار من منطقة الرأس واليرقه المستخدمة لإجراءات إضافية، مثل تثبيت لتلطيخ جسم أو معالجتها لاستخراج الحمض النووي الريبي أو البروتين.
  2. بعد إزالة اليرقات واجار، تنظيف زويدجي مع الإيثانول والمقطر المياه، كما هو موضح في الخطوة 4، 1 وتعيين رأسا على عقب للهواء الجاف. مخزن مشمولة في مكان بارد وجاف. إعادة معطف مع اللبن المقشود (الخطوة 4.2) حسب الحاجة قبل استخدام المقبل.
    ملاحظة: زويدجيس يمكن إعادة استخدامها عدة مرات، حتى تبدأ PDMS القادمة بعيداً عن الزجاج-

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجهاز موائع جزيئية PDMS زويدجي جهاز مستقلة وظيفيا مصممة لاستيعاب المهام الرئيسية الأربعة (المذكورة أدناه) المرتبطة بتصوير لايف والذيلية الزعنفة إصابة الشفاء وإعادة النمو في اليرقات الزرد. واختير PDMS لتصنيع زويدجي لأنها ليست متاحة بسهولة إلا ومعيار الصناعة لتوافق مع الحياة، ولكن أيضا يعمل جيدا في قوالب. بالإضافة إلى ذلك، يجعل PDMS الجهاز القابل لإعادة الاستخدام وخالية من الحواف الصلبة أو الحادة حالما يتم تشكيل الجهاز. زويدجي على وجه التحديد يسمح 1) تحميل اليرقات في الجهاز، وضبط النفس 2) ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وغرض الجهاز زويدجي هو التقاط الفاصل الزمني 3D التصوير بتحقيق الاستقرار وتوجيه الأسماك ضمن المسافة العمل الصغيرة من هدف مجهر عالي الدقة. اجتماع هذه مواصفات التصميم، مع أنها أيضا تحسنا على إعداد التقليدية المستندة إلى أجار للتصوير الحي. هناك ثلاث خطوات حاسمة (أدناه) في تصنيع زويدجي، التي، إذا لم تفعل بشكل صحيح، يمكن أن يسفر عن الأجهزة المعيبة:

إعداد PDMS (الشكل 5 ألف)

لمنع حدوث فقاعات، ديغا في القوالب بعد إضافة PDMS. تحقق من أن كافة الفقا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تود أن تقر تمويل المشاريع الأولية من معهد مورجريدجي للأبحاث والمختبر الضوئية و "الأجهزة الحاسوبية". نعترف أيضا بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة # R01GM102924 (AH وكوي). خ، دائرة الخدمات الطبية المشتركة، وجمهورية صربسكا، آه وكوي تصور وتصميم الدراسة. خ، ودائرة الخدمات الطبية المشتركة أجرى تجارب جميع مع دعم من DL وعملية كيمبرلي وجمهورية صربسكا. خ، شبيبة، وجمهورية صربسكا، آه وكوي أسهم في كتابة المخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي>تصنيع القوالب< / قوي>
Solidworks المهنية البحوث المدمجة 3D النمذجة البرمجياتDassault SystemesSPX0117-01فيشر Unitech
Viper Si2 SLA3D Systems Inc.23200-902شركة 3D Systems Inc.
أكورا 60 راتنج البوليمرالضوئي 3D Systems Inc.24075-902شركة 3D Systems Inc.
الكحول المشوهSunnyside5613735Menards
جهاز ما بعد العلاج بالأشعة فوق البنفسجية3D Systems Inc.23363-101-00شركة أنظمة ثلاثية الأبعاد
قفازات النتريل TouchNTuffAnsell92-600McMaster Carr
220B ، 400B ، 600 حصى T414 ورق صنفرة أزرق bak   ؛نورتون66261139359 ، 54 ، 52
قرص زجاجي من البورسليكات MSC ، قطر 2 بوصةماكماستر كارMIL-G-47033ماكماستر كار
منظف الموجات فوق الصوتيةبرانسون1510R-MTH
كحول فرك الأيزوبروبيل 70٪هيدروكس54845T43ماكماستر كار
10 أوقية كوب بلاستيكي شفافWNAتحفة 557405أمازون
6 "عصا حرفيةPerfect StixCraft WTD-500Amazon
NameCompany Catalog NumberComments
Fabricate zWEDGI PDMS device
Sylgard 184 Silicon elastomeric Kit داو كورنينج4019862Ellworth Adhesives 
حقنة 10 ملبيكتون ديكنسون305219Vitality Medical Inc
مجففبيل آرت ساينسويرF42027-0000أمازون
4 في مشبك قضيب تصعيدبيتسبرغ68974الشحن هاربور
كوينسي لاب إنك.صناعيةعالمية 20GC
Aven549825McMaster-Carr
فوهة مصفاة بالهواء المضغوطInnotechTA-N2-2000FTغرف الأبحاث لمزة
مقعد فراغ ملزمةويلتون توت جروب63500MSC الصناعية
55 مم طبق سفلي زجاجي ؛ 30 مم بئر صغير # 1.5 غطاءزجاجي سيلفيسD60-30-1.5-Nسيلفيس
منظف البلازماهاريك البلازماPDC-001هاريك البلازما
<قوي>الاسمالشركة Catalog NumberComments
Loading Larvae
Pipetteman, P200Gilson F123601
100٪ إيثانول (مخفف إلى 70٪ بالماء قبل الاستخدام)نقل 111000200
فيشربراند13-711-5Aفيشر ساينتفيك
حليب2902887MP بيوميديكال
مزدوج ماء
N-phenylthiorureaSigma-AldrichP7629سيجما ألدريتش
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)C-FINQ-UEويسترن كيميكال
نقطة انصهار منخفضة agaroseSigma-AldrichA0701Sigma-Aldrich
(حاضنة حمام جاف)فيشر Scientific11-718-2فيشر Scientific
E3 عازلة  
طرف ماصة الفتحة الكبيرة ، 200 ميكرومترFisherbrand02-707-134العامة من فيشر ساینتفيك
، 200 ميكرولترفيشربراند21-197-8Eفيشر ساینتميك
# 15 شفرة مشرط   ؛ريشة2976أمازون
25G حقنة إبرةBD BD305122فيشر العلمي
<قوي>الاسم < / قوي >< قوي > الشركة < / قوي> < قوي> رقم الكتالوج < / strong>تعليقات < strong >
imaging < / strong >
inverted المجهر
التصوير ImarisBitplane
فرن مختبر مجموعة ملاقط ماصة فارمكو آبر مجفف خالي الدسم مقطر كتلة حرارية طرف ماصة للأغراض برنامج

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
  2. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
  3. Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
  4. Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. Sampath, K., Roy, S. , World Scientific Pubs. Singapore. (2010).
  5. Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
  6. Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
  7. Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).
  8. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
  9. Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
  10. Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
  11. LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
  12. White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  13. LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
  14. Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
  15. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish LarvaeWound HealingLive ImagingPDMS Device3D PrintingMultiphoton MicroscopyCollagen Fiber AnalysisTissue RegrowthMicrofluidic ChannelsAgarose Encapsulation

Related Articles