مقالة منهجية

تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها

13.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56374

⸱

أغسطس 31, 2017

 , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Pittsburgh School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

والهدف من هذا البروتوكول هو علامة على وجه التحديد وعزل الحمض النووي الفيروسي من الخلايا المصابة لتحديد خصائص البروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة بشكل انتقائي.

الملخص

والهدف من هذا البروتوكول هو عزل فيروس الحلأ البسيط من النوع 1 (هامبورغ-1) الحمض النووي من الخلايا المصابة لتحديد المرتبطة الفيروسية والبروتينات الخلوية بالكتلة قياس الطيف الكتلي. على الرغم من أن البروتينات التي تتفاعل مع الجينوم الفيروسي تضطلع بأدوار رئيسية في تحديد نتيجة العدوى، تحليلاً شاملا للبروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة لم يكن ممكناً سابقا. هنا نظهر أسلوب يتيح لتنقية مباشرة من هامبورغ-1 مورثات من الخلايا المصابة. تكرار الحمض النووي الفيروسي هو المسمى بشكل انتقائي مع تعديل النيوكليوتيدات التي تحتوي على مجموعة وظيفية ألكاين. الحمض النووي المسمى هو ثم على وجه التحديد ولا رجعة فيه معلم عن طريق إلحاق التساهمية أزيد البيوتين عن طريق لنحاس (I)-حفز أزيد-ألكاين سيكلواديتيون أو انقر فوق رد. هو تنقية الحمض النووي معلم البيوتين في الخرز المغلفة ستريبتافيدين والبروتينات المرتبطة التيد وحددها الكتلي. يتيح هذا الأسلوب بالاستهداف الانتقائي والعزلة من هامبورغ-1 النسخ المتماثل شوك أو الجينوم كله من البيئات البيولوجية المعقدة. وعلاوة على ذلك، سوف تسمح التكيف مع هذا النهج للتحقيق في الجوانب المختلفة للإصابة هيربيسفيرال، فضلا عن فحص مورثات فيروسات الحمض النووي الأخرى.

المقدمة

فيروسات لديها قدرة محدودة على الاضطلاع بالمهام الأساسية، وذلك يعتمد على عوامل المضيف لتسهيل الجوانب الحرجة للإصابة بما في ذلك التعبير المورثات الفيروسية والنسخ المتماثل، إصلاح، وممارسو والنقل. وكثيراً ما تزاد أنشطة هذه العوامل المضيفة بالبروتينات المرمزة فيروسي. وبالإضافة إلى ذلك، يجب تجنب الفيروسات الكشف والتدخل بالاستجابات الخلوية للعدوى الفيروسية. ولذلك، تملي التفاعلات المضيف الفيروس نتيجة الإصابة. من الأهمية بمكان هو فهم كيفية تغير فيروسات البيئة الخلوية تكييف الآلية الخلوية لتسهيل عمليات الفيروسية. أهمية خاصة هو تحديد العوامل والعمليات التي تعمل على الجينوم الفيروسي طوال دورة المعدية.

فيروس الحلأ البسيط من النوع 1 (هامبورغ-1) هو مزدوج تقطعت الحمض النووي الفيروس الذي يصيب نسبة كبيرة من السكان. خلال الساعة الأولى من الإصابة، يدخل الجينوم الفيروسي النواة، حيث تستتبعه تتالي أمر التعبير المورثات الفيروسية في التنسيق مع النسخ المتماثل (فدنا) من الحمض النووي الفيروسي1. في النواة، جينومات تخضع لضوابط تنظيمية جينية والخضوع لإصلاح واقترانها، ويتم تعبئتها في كابسيدس، حيث يتم إنتاج فيريونس ذرية الأولى خلال أقل من ست ساعات. التقييم الشامل للبروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة طوال فترة الإصابة سترسي الأساس للتحقيق في تفاصيل العمليات التي تعمل على الجينوم الفيروسي، وسوف توفر نظرة ثاقبة العوامل الفيروسية والخلوية التي الجزيئية يشاركون في مراحل مختلفة من العدوى.

وتشمل الأساليب السابقة لتحقيق العوامل المضيفة المعنية في العدوى الفيروسية تقارب تنقية البروتينات الفيروسية لتحليل البروتينات الخلوية المرتبطة بها2،3،،من45 , 6 , 7 , 8 , 9-هذه الاختبارات كانت مفيدة للتعرف على العوامل الخلوية التي ينطوي عليها في الردود المضادة للفيروسات المضيفة، فضلا عن تعديل الكروماتين الفيروسية، والتعبير الجيني، وإصلاح الحمض النووي. ومع ذلك، من الصعب التأكد من ما إذا كانت التفاعلات تعتمد على الرابطة مع فدنا، والبروتيوميات فقط توفير نظرة ثاقبة التفاعلات التي تحدث كدالة لعامل فيروسية معينة. وقد استخدمت إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة) لتحديد حيث ربط محددة من البروتينات الفيروسية والخلوية للجينوم الفيروسي10،،من1112،،من1314 , 15 والتهجين في الموقع نيون (الأسماك) جنبا إلى جنب مع إيمونوسيتوتشيميستري وقد مكن تصور العوامل الخلوية التي كولوكاليزي مع، فدنا16،،من1718 19 , 20-تتيح هذه الاختبارات للتحليل المكاني والزماني. ومع ذلك، تشمل القيود الحاجة إلى أجسام مضادة محددة للغاية، وحساسية محدودة، والحاجة إلى ثاقبة الفيروس المضيف التفاعلات السابقة. ولذلك قمنا بتطوير أسلوب يقوم على إيبوند (عزل البروتينات على الحمض النووي الوليدة)21 والمصابين أنيبوند (إيبوند الأصلية المعجل)22 للتسمية بشكل انتقائي وتنقية فدنا من الخلايا لتحديد غير منحازة للجينوم الفيروسي البروتينات المرتبطة بالطيف الكتلي. إيبوند كان مفيداً لتحقيق ديناميات شوكة الخلوية النسخ المتماثل.

لتنقية الانتقائي للجينوم الفيروسي من الخلايا المصابة، تكرار فدنا هو المسمى مع اثينيل تعديل نوكليوسدس، 5-اثينيل-2´-ديوكسيوريديني (إيدو) أو 5-اثينيل-2´-ديوكسيسيتيديني (EdC) (الشكل 1)، تليها التساهمية انقر اقتران لأزيد البيوتين عن طريق الكيمياء تيسيرا لتنقية خطوة واحدة من الجينوم الفيروسي والبروتينات المرتبطة بها على الخرز streptavidin المغلفة (الشكل 2). الأهم من ذلك، تنفذ العدوى في الخلايا الثابتة، التي لم تشارك في تكرار الحمض النووي الخلوي لتمكين العلامات المحددة من فدنا. وعلاوة على ذلك، هامبورغ-1 العدوى يؤدي دورة الخلية اعتقال ويحول دون تكرار الحمض النووي الخلوي23،24. الفيروسات يمكن بريلابيليد قبل الإصابة للتحليل البروتينات المرتبطة بالجينوم الفيروسية الواردة (الشكل 1A) أو المسمى أثناء النسخ المتماثل للحمض النووي للتحليل البروتينات المرتبطة بالمركب حديثا فدنا (الشكل 1B) 25-وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام التحليل تشيس نبض التحقيق في طبيعة البروتينات المرتبطة بالنسخ المتماثل الفيروسية شوك (الشكل 1)26. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تساهمي مترافق تعديل اثينيل فدنا إلى فلوروفوري للتحقيق المكاني لديناميات البروتين (الشكل 2A و الشكل 3). تصوير يسمح للتصور مباشرة من فدنا وهو نهج مجانية للتحقق التفاعلات فدنا بالبروتين، ويمكن تكييفها لتعقب الجينوم الفيروسي في جميع أنحاء العدوى. ونحن نتوقع أن هذه النهج يمكن تعديله أيضا لدراسة أي جانب من الإصابة هيربيسفيرال، بما في ذلك الكمون وتنشيطها، ودراسة أخرى فيروسات الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، وضع العلامات مع أردين 5-اثينيل (الاتحاد الأوروبي) قد تسمح لتحليل الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-خلية ثقافة والعدوى الفيروسية، ووسم الصادرات ( الشكل 1)

البروتوكول التالي ينطوي على العمل مع الفيروسات. يرجى الرجوع إلى المؤسسة الخاصة بك ' s بروتوكولات السلامة البيولوجية فيما يتعلق بالمناولة الآمنة للفيروسات وغيرها من العناصر البيولوجية. هذا البروتوكول كان أقرها "المجلس الاستعراض المؤسسي" لجامعة بيتسبرغ.

  1. تريبسينيزي المتلاقية 150 سم 2 زراعة الأنسجة قارورة من الخلايا لجنة نهر الميكونج-5 ونقل الخلايا إلى 2 سم 600 لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على 100 مل دميم بالإضافة إلى 10% FBS. احتضان عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO 2 لمدة 3-4 أيام للوصول إلى مرحلة كونفلوينسي وثابتة. ويتضمن طبق 2 سم 600 المتلاقية ~ 7 × 10 7 الخلايا. إعداد لوحة 1 لكل شرط ولوحة 1 لكل عنصر تحكم السلبية المقابلة.
    ملاحظة: يجب أن تصل إلى الخلايا في المرحلة ثابتة تحول دون تكرار الحمض النووي الخلوي لضمان أن فدنا الوحيد هو المسمى وتنقيته في الخطوات اللاحقة-
    ملاحظة: كل عينة يتطلب من المجاملة غير مسمى مراقبة سلبية أعدت باستخدام نفس ظروف الإصابة والنقطة الزمنية دون الإضافة لتنمية الصادرات-
    ملاحظة: بتقليص نسخة من هذه التجربة ينبغي أن يتم بالتوازي لاختبار لوسم الحمض الخلوي بالتصوير باستخدام نمو الخلايا القابلة للمقارنة، العدوى، تنمية الصادرات وسم الشروط، والوقت النقاط (راجع الخطوة 2)-
  2. تمييع 7 × 10 8 1 HSV بفو في 7 مل تريسبوفيريد الباردة المالحة (تبس). إزالة النمو المتوسطة وتخزينها في 37 درجة مئوية. لتصيب، إضافة 7 مل الفيروس المخفف للخلايا 5 لجنة نهر الميكونج والصخور ح 1 في درجة حرارة الغرفة. الامتزاز التالي، إزالة العدوى وشطف مع درجة حرارة الغرفة 50 مل TBS واستبدال المتوسطة النمو الأصلي. احتضان عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO 2. هذه الخطوة ينبغي أن يتم لكل حالة تجريبية والمراقبة السلبية.
    ملاحظة: العلامات زيادة الصادرات يمكن تحقيقه باستخدام HSV 1 طفرات المعيبة للتعبير عن دوتباسي الفيروسية (الجين UL50) و/أو glycosylase اليوراسيل (الجين UL2). هامبورغ-1 دوتباسي خصوصية الركازة منخفضة، ويمكن إنقاص تفعيل عدة 25 ، النظير نوكليوزيد 27-
  3. تسمية الجينوم الفيروسي مع تنمية الصادرات. اتبع التوجيهات للتسمية الواردة الجينوم (1.3.1.)، تكرار الجينوم (1.3.2.)، أو النسخ المتماثل الفيروسية شوك (1.3.3.)-
    ملاحظة: الخطوة الوحيدة 1.3.1 أو 1.3.2 1.3.3 ينبغي أن يتم اعتماداً على ما إذا كانت جينومات واردة، جينومات منسوخة أو شوك النسخ المتماثل يتم تحليلها في الخطوات اللاحقة، على التوالي.
    ملاحظة: إيدو أو إيدو ارا و يمكن أن تكون بديلاً لتنمية الصادرات. وينبغي رصد سمية النظير نوكليوزيد والتقليل إلى أدنى حد. بريلابيليد
    1. استخدام الأرصدة الاضطلاع بالعدوى في الخطوة 1.2 والمتابعة إلى الخطوة 2 أو 3 ضمن ح 4 نشر العدوى (hpi) للتحقيق في فدنا unreplicated ( الشكل 1A).
      ملاحظة: تعد الفيروسات بريلابيليد الأسهم باستخدام البروتوكول هو موضح سابقا 25. يجب أن يتم تمرير مخزونات الفيروس عن طريق عمود G-25 لإزالة أي تنمية الصادرات المتبقية.
      2. تسمية
    2. فدنا النسخ المتماثل بإضافة 5-25 ميكرومتر تنمية الصادرات إلى مستنبت الخلية من الخلايا المصابة بالنسبة 2-4 ح ( الشكل 1B). قبل إضافة، تضعف المؤسسة في 1 مل متوسط نمو.
    3. إلى تسمية النسخ المتماثل الفيروسية شوك، بعد حدوث النسخ المتماثل فدنا (≥ 4 hpi)، تسمية نبض تكرار فدنا مع 5-25 ميكرومتر تنمية الصادرات لمدة 5-20 دقيقة. لمطاردة، شطف 3 x مع تشيس المتوسطة التي تحتوي على 25-100 ميكرومتر 2´deoxycytidine (ديوكسيك)، واحتضان ثم حضور المتوسطة تشيس لمدة 20-40 إضافية دقيقة ( الشكل 1).
      ملاحظة: يجب أن اكويليبراتيد المتوسطة النبض ومطاردة إلى 37 درجة مئوية و 5% CO 2 قبل الاستخدام.
      ملاحظة: لإجراء التجارب على مطاردة نبض، من المهم النظر في مقدار الوقت الذي يستغرقه نوكليوسدس لدخول الخلية وتكون فوسفوريلاتيد قبل كان يمكن إدراجها في تكرار الحمض النووي. وهذا يجب أن يحدد تجريبيا.
      ملاحظة: لتحديد دقة نبض التجارب تشيس، حساب معدل النسخ المتماثل الفيروسية الظروف التجريبية المستخدمة. وهذا يمكن تحديده من خلال PCR الكمي للجينوم الفيروسي أثناء خطوة مفردة نمو وقت دورة 26-
      ملاحظة: للتصوير الجينوم الفيروسي المتابعة إلى الخطوة 2 وتطهير الجينوم الفيروسي المضي قدما إلى الخطوة 3-

2. تصوير لتنمية الصادرات المسمى الحمض النووي ( الشكل 2A)

ملاحظة: أنه من المفيد إجراء تصوير بالترادف مع أسلوب تنقية الجينوم الفيروسي للتأكد من أنه لن يتم تسمية الحمض الخلوي في التجارب. يمكن أيضا استخدام التصوير لتصور طبيعة المسمى فدنا، والتحقق من صحة البيانات البروتيوميات. وترد أمثلة للحمض الخلوي الصبغي الخلوي والفيروسية تلطيخ أنماط في الشكل 3-

  1. الاضطلاع بالعدوى، ووسم الصادرات كما هو مبين في الخطوة 1 باستثناء استخدام تقليص الشروط في كوفيرسليبس في طبق استنبات الأنسجة 12-جيدا يحتوي على 1 مل متوسط نمو.
    2. بارافورمالدهيد
  2. الخلايا الإصلاح مع 1 مل 3.7% في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 15 دقيقة في الرايت بعد التثبيت، خلايا شطف x 2 مع 1 مل 3% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني.
    تحذير: يمكن أن يسبب بارافورمالدهيد إصابة خطيرة أو الدائمة. اتباع احتياطات السلامة-
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا ويمكن تخزين كوفيرسليبس في 4 درجات مئوية في الغسيل الثانية لمدة 3 أيام-
  3. بيرميبيليزي الخلايا مع 1 مل بيرميبيليزيشن المخزن المؤقت [انظر الجدول للمواد] لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بينما هزاز.
  4. شطف مع 1 مل من جيش صرب البوسنة 3%، ومن ثم كتلة مع 1 مل 3% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بينما هزاز.
  5. إضافة 1 مل من رد فعل فوق كوكتيل [انظر الجدول للمواد] إلى كوفيرسليبس تساهمي متزاوجة أليكسا فلور 488 المسمى أزيد لتنمية الصادرات الحمض النووي. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع هزاز. نضح وشطف مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  6. وصمة عار الحمض الخلوي مع 1 مل إضعاف 1:2,000 هويشت في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بينما هزاز. نضح وشطف مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    7. الفلورة غير المباشرة
  7. وصمة عار مع الأجسام المضادة الابتدائي والثانوي وفقا لمعيار البروتوكولات 25-
    ملاحظة: فدنا المسمى كولوكاليزيس مع ICP8 أو ICP4، أو UL42، والمسمى الخلوية كولوكاليزيس الحمض النووي مع وصمة عار هويشت.
  8. جبل كوفيرسليبس على الشرائح والصور الخلايا باستخدام مجهر الأسفار.
    ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع.

3. تنقية فدنا و "البروتينات المرتبطة"

ملاحظة: عدة جوانب من هذا البروتوكول وقد تم تكييف من يونغ et al. 22
ملاحظة: ينبغي مبردة كافة المخازن المؤقتة والمواد الكاشفة على الجليد قبل الاستخدام وجميع الخطوات ينبغي أن تنفذ على الجليد، ما لم يبين خلاف ذلك.

  1. حصاد الأنوية.
    ملاحظة: قبل عزلة نوى، يمكن استخدام فورمالدهايد للبروتينات التشعب للحمض النووي. ثم يمكن استخدامها يغسل شروطا أكثر صرامة خلال تنقية الحمض النووي على الخرز المغلفة ستريبتافيدين. للجمهورية التشيكيةراجع شروط أوسلينكينج ويغسل Sirbu et al. 21-
    1. استبدال المتوسطة النمو مع 20 مل المخزن المؤقت للاستخراج أنوية (NEB) واحتضانها لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية مع هزاز عرضية. الأنوية سوف تصبح مرئية في المجهر.
    2. نوى كشط من لوحة باستخدام مكشطة الخلية ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 درجات مئوية بيليه النوى، وتجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: تريبان تلطيخ الأزرق يمكن استخدامها للتحقق من عزل نواة من خلايا-
    3. برفق إزاحة بيليه النووية في برنامج تلفزيوني، نقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل، 10 مل وبيليه من سينتريفوجينج لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 ° "جيم تماما" إزالة برنامج تلفزيوني-
      ملاحظة: يمكن أن تجمد الأنوية والبروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً عند هذه النقطة. للقيام بذلك، ريسوسبيند برفق بيليه النووية في 500 ميليلتر تجميد المخزن المؤقت واحتضان الأنبوب في حمام جليد جاف إيثانول. تخزين نويات المجمدة في-80 درجة مئوية. قبل الاستخدام، إذابة النوى في درجة حرارة الغرفة، ونقل بسرعة إلى الجليد، وإضافة 10 مل برنامج تلفزيوني، روك برفق للمزيج، بيليه بالطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 درجات مئوية، وإزالة برنامج تلفزيوني. تجميد الأنوية قد يؤدي انخفاض الغلة.
  2. أزيد البيوتين تساهمي المتقارنة لتنمية الصادرات المسمى فدنا-
    1. ريسوسبيند بيليه النووية في 10 مل انقر فوق رد فعل مزيج [انظر الجدول للمواد] بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات مع بيبيت 10 مل.
      ملاحظة: من المهم أن يتم إضافة الكواشف المدرجة في مزيج فوق الرد بالترتيب الموضح.
    2. تدوير ح 1 في 4 درجات مئوية. بينما تناوب إعداد والبرد والمخازن المؤقتة B1، B2، و B3 [انظر الجدول للمواد].
    3. نوى بيليه من سينتريفوجينج لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 ° "جيم تماما" إزالة انقر فوق خلط رد فعل ويغسل بيليه بلطف ريسوسبيندينج في 10 مل برنامج تلفزيوني وسينتريفوجينج لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 ° C.
    4. بلطف ريسوسبيند بيليه النووية في 1 مل برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنبوب [ميكروفوج] 1.5 مل استخدام تلميح ماصة كبيرة وتتحمل. بيليه الأنوية سينتريفوجينج لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 ° "جيم تماما" إزالة برنامج تلفزيوني وفلاش التجميد في النيتروجين السائل-
      ملاحظة: يمكن مؤقتاً في البروتوكول في هذه المرحلة ويمكن تخزين نويات المجمدة في-80 درجة مئوية. تجميد ذوبان الجليد يساعد على تحلل اللاحقة مع ذلك فمن المستحسن أن تكون نواة فلاش مجمدة حتى عند الشروع في "الخطوة 3، 3" في نفس اليوم-
  3. النوى، وتجزئة الحمض النووي- ذوبان الجليد الأنوية على الجليد
    1. وريسوسبيند في 500 ميليلتر B1 المخزن المؤقت قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تبني على الجليد ل 45 دقيقة
    2. عينات سنكيت 6 مرات لمدة 30 ثانية كل في السعة 40% باستخدام مسبار ميكروتيب 3 مم. وضع العينات في الثلج لمدة 30 ثانية بين النبضات. بعد سونيكاتيون، يجب أن تظهر عينات واضحة ولا غائم.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون الأمثل الظروف سونيكاتيون سونيكاتورس الفردية. للحصول على إرشادات مفصلة حول كيفية تحسين ظروف sonication تشير إلى ليونغ et al. 22-
    3. بيليه الحطام خلية من سينتريفوجينج في 14,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. وينبغي تقليص حجم بيليه. تصفية المادة طافية من خلال 100 ميكرومتر خلية مصفاة والإبقاء التدفق من خلال-
    4. إضافة 500 ميليلتر B2 المخزن المؤقت للمادة طافية المصفاة. 900 ميليلتر من هذه العينة التي ستستخدم في خطوة 3.4.2.
    5. أخذ قاسمة لكل شرط لعزل الحمض النووي (50 ميكروليتر أو حجم 1/20)، وإضافة 50 ميليلتر 2 × حل الحزب الديمقراطي الصربي bicarb [انظر الجدول للمواد]. المضي قدما في البروتوكول عزل الحمض النووي (3.6 خطوة)-
    6. تأخذ قاسمة لكل شرط لإدخال البروتين (50 ميكروليتر أو حجم 1/20) وإضافة 50 ميليلتر 2 × لايملي عينة المخزن المؤقت، وتجميد في النتروجين السائل وتخزينها في-80 درجة استخدام جيم في خطوة 3.5.6.
  4. بيوتينيلاتيد ربط الحمض النووي ل streptavidin المغلفة الخرز.
    1. الخرز إعداد T1 ستريبتافيدين المغناطيسي بنقل 300 ميليلتر من الملاط حبة إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب. إعداد أنبوب واحد من الخرز كل عينة. أغسل حبات x 3 مع 1 مل B2 العازلة من فورتيكسينج ريسوسبيند، وتطبيق مغناطيس لفصل الخرز، ويسفط في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي-
      ملاحظة: الأمثل ملزمة نتيجة الظروف في الغلة مكبر وخلفية الحد الأدنى الملزم. تبين تجريبيا أن الخرز المغناطيسي Streptavidin T1 لديها قدرة ملزمة أكبر بكثير من الخرز [اغروس]، فضلا عن الخرز ستريبتافيدين الأخرى، وأقل الخلفية ملزمة من الخرز C1 ستريبتافيدين ( الشكل 4A ).
    2. ميليلتر إضافة 900 من عينة من الخطوة 3.3.4. الخرز غسلها وتدوير بين عشية وضحاها في 4 ° C.
      ملاحظة: لا دوامة الخرز حالما تتم إضافة نموذج لهم.
      ملاحظة: إذا كان يتم عزل كميات كبيرة من الحمض النووي أو البروتين في مراقبة سلبية غير مسمى، هذه الخطوة يمكن تقليل من بين عشية وضحاها إلى ح 4 للحد من الربط الخلفية.
  5. تغسل الخرز والوت فدنا والبروتينات المرتبطة.
    ملاحظة: من المستحسن استخدام تلميحات التصفية للخطوات المتبقية.
    1. مكان العينات إلى رف أنبوب مغناطيسي [ميكروفوج]، إزالة المادة طافية، ريسوسبيند برفق في 1 مل B2 المخزن المؤقت، استدارة عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5
    2. ثلاث مرات تكرار الخطوة 3.5.1.
    3. وضع العينات في رف أنبوب مغناطيسي [ميكروفوج] وإزالة المادة طافية ولطف ريسوسبيند في 1 مل B3 المخزن المؤقت، وتدوير عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5
    4. نقل 100 ميليلتر حبة خليط (حجم ال 1/10) إلى أنبوب جديد لعزل الحمض النووي منضم. ينطبق هذا الأنبوب بالمغناطيس وإزالة المادة طافية، ريسوسبيند الخرز في 100 ميليلتر 1 × حل الحزب الديمقراطي الصربي-bicarb والمضي قدما في البروتوكول عزل الحمض النووي (3.6 خطوة)-
    5. تطبيق الأنبوب الذي يحتوي على خليط حبة ميليلتر 900 المتبقية من الخطوة 3.5.3. للمغناطيس، قم بإزالة المادة طافية، وريسوسبيند الخرز في 50 ميليلتر 2 × لايملي عينة المخزن المؤقت الوت البروتين والحمض النووي-البروتين المجمعات.
    6. عينات يغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ودوامه، تدور في [ميكروفوج] بسرعة وتطبق المغناطيس. نقل النذرة بأنابيب جديدة، وتجميد فلاش، ومخزن في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: استخدام غطاء تأمين لضمان أن لا البوب أنابيب فتح أثناء الغليان.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً في البروتوكول في هذه المرحلة، ويمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية لعدة أسابيع.
    7. تحليل عينات البروتين بالأزرق أخذ تلطيخ النشاف الغربية أو الكتلي بإجراءات قياسية 25. يتم إظهار النتائج الممثلة في الشكل 4 و الشكل 5-
      ملاحظة: لتحديد ما إذا كان العائد بروتين كافية الكتلي، ميليلتر 7.5 لكل عينة من يستخدمها لتحليل الأزرق أخذ تلطيخ والمرتبطة ميليلتر 7.5 النشاف الغربية الجينوم الفيروسي الممثل البروتين (ICP4، ICP8، أو UL42). نفس الحجم من ليساتيس من الخطوة 3.3.6. يتم تشغيل جنبا إلى جنب مع إلى مراقبة مستويات البروتين الإدخال. ثم يتم تحليل العينة المتبقية (35 ميليلتر) بوسائل قياس الطيف الكتلي كما هو موضح سابقا 25-
  6. عزل الحمض النووي
    1. احتضان العينات المأخوذة من الخطوات 3.3.5. و 3.5.4. عند 65 درجة مئوية ل 4-16 h. إزالة عينة من الخرز المغناطيسي، إذا لزم الأمر.
    2. استخراج عينات مع 150 ميليلتر الفينول: كلوروفورم: إيسواميل الكحول (PCI) ونقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد.
    3. استخراج PCI المتبقية مع 100 ميليلتر يدتا تريس (TE) وإضافة المرحلة المائية إلى أنبوب جديد.
    4. استخراج عينات مع 200 ميليلتر كلوروفورم: إيسواميل الكحول (24:1).
    5. تنقية المرحلة المائية باستخدام أدوات تنقية PCR وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s-
      ملاحظة: سوف تتحول مؤشر الرقم الهيدروجيني في المخزن المؤقت PB الأرجواني عندما تضاف إلى العينة. إضافة 10 آند #181؛ ل م 3 نواك pH 5.0 انخفاض الرقم الهيدروجيني للعينة.
    6. تركيز "الحمض النووي تحديد" باستخدام فلوروميتير.
      ملاحظة: هذا البروتوكول عادة ينتج 100-400 نانوغرام حبة زمنياً الحمض النووي. الحمض النووي لا ينبغي الكشف عنها في النذرة التحكم السلبية التي لم يتم إضافة تنمية الصادرات في "الخطوة 1-3"-
    7. الحمض النووي يمكن أن تكون مخزنة في ربط الحمض النووي منخفض الأنبوبة في 4 أو-20 درجة مئوية، ويمكن استخدامها لبكر في الوقت الحقيقي أو تحليل تسلسل إنتاجية عالية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وأنجز استخدام الكيمياء انقر لتنقية الحمض النووي من الخلايا أولاً ب أسلوب إيبوند21. وغرض إيبوند لتنقية شوك الخلوية النسخ المتماثل للتعرف على البروتينات المرتبطة بها. أننا قد تكيفت هذه التقنية لدراسة تفاعلات البروتين فدنا على وجه التحديد أثناء الإصابة. التلاعب بالنهج المتبع في التسمية الجينوم الفيروسي مع تنمية الصادرات (الشكل 1)، جنبا إلى جنب مع العدوى المتزامنة، سمح للعزل الانتقائي والتحقيق من السكان منفصلة من فدنا. هامبورغ-1 "الحمض الن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويشمل هذا البروتوكول العديد من الخطوات التي، إذا لم تتبع بدقة، يمكن أن يؤدي إنتاج البروتين انخفاضا كبيرا أو تلوث بالحمض الخلوي. من الأهمية بمكان أن يتم استخدام الخلايا ثابتة لجميع التجارب لضمان أن الحمض الخلوي لا المسمى وتنقيته. هذا يمكن تأكيد عدم وجود بولمرس الحمض الخلوي في العينة البروتين لأن هامبورغ-1 لا تستخدم بوليميريز الحمض الخلوي لتركيب الجينوم. خلال تنمية الصادرات وسم ونوى حصاد الخطوات، ينبغي متداخلة العينات التأكد من أن يتم معالجة كل منهما على قدم المساواة. خلال خطوات تنقية، ينبغي الحرص لا للتلاعب بنوي من بيبيتي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونعترف هانا فوكس للحصول على مساعدة في إعداد هذه المخطوطة. أيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منح R01AI030612.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خلايا MRC-5ATCCCCL-171
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Gibco26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-082تم استبداله ب 10٪ FBS ، 2 ملي مولار L-glutamine ، 12 mM & nbsp ؛ (للنمو في القوارير) أو 30 ملي مولار (للنمو في الأطباق) الصوديوم وثنائي الكربنات
600 سم 2< / sup> طبق زراعة الأنسجةThermo Fisher Scientific166508
Tris Buffered Saline (TBS) ، درجة الحموضة 7.4137 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد كلوريد ، 491 ملي مللي كلوريد ، 680 ملي كلوريد المكالسيوم ، 25.1 ملي من مخزون تريسين
HSV-1الأسهم ذات العيارات أكبر من 1x109< / sup> PFU / مل تعمل بشكل أفضل
Sephadex G-25   عمود (عمود تحلية المياه PD-10) GEHealthcare17085101
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)فيشر ScientificD128-1
5 & حاد ؛ -Ethynyl-2 & حاد ؛ -deoxycytidine (EdC)Sigma-AldrichT511307يذوب في DMSO لتحضير مخزون 40 ملي مولار ، وتخزينه عند -20 درجة ؛ ج 
2 & حاد ؛ ديوكسي سيتيدين (deoxyC)Sigma-AldrichD3897يذوب في الماء لتحضير 40 ملي من المرق ، aliquot ، وتخزينه عند -20 درجة ؛ ج 
مخزن الاستخراج النووي (NEB)تحضير طازج (20 ملي مولار هيبس الرقم الهيدروجيني 7.2 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 3 ملي مللي ملليجرام كلوريد < > 2 < / فرعي > ، 300 ملي مولار سكروز ، 0.5٪ إيجيبال)
مكشطة الخليةزجاج بيلكو7731-22000الأوتوكلاف قبل الاستخدام
محلول تريبان الأزرقسيجما ألدريتشT8154
PBS ، درجة الحموضة 7.2 (10x)1.37 م كلوريد الصوديوم ، 27 ملي كلوريد الصوديوم ، 100 ملي أمبير Na2< / sub>HPO4< / sub> ، 18 ملي مولار KH2< / sub>PO4< / sub> (يخفف إلى 1x في ماء معقم قبل الاستخدام)
كبريتات النحاس (II) خماسي هيدرات (CuSO4-5H2O) فيشرScientificC489تحضير مخزون 100 ملي وتخزينه عند 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى شهر
واحد (+) L-ascorbate الصوديومSigma-AldrichA4034تحضير مخزون 100 ملي من المرق حديثا وتخزينه على الثلج حتى استخدام
البيوتين أزيدInvitrogenB10184قم بإعداد 10 ملي مخزون في DMSO ، aliquot ، وتخزينه عند -20 درجة ؛ C لمدة تصل إلى 1 سنة 
انقر فوق مزيجتحضير مباشرة قبل الاستخدام عن طريق إضافة الكواشف بالترتيب المشار إليه (10 مل: 8.8 مل 1x PBS ، 200 مل 100 مل CuSO4< / sub> ، 25 مل 10 ملي بيوتين أزيد ، 1 مل 100 ملي أسكوربات الصوديوم)   ؛  
كوكتيل روتشي مثبط البروتيازالكامل 11697498001يذوب في 1 مل من الماء لتحضير مخزون 50x ، ويمكن تخزينه في 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى أسبوع واحد ، أو أضف مباشرة حبة واحدة إلى 50 مل عازلة
تجميد المخزنتحضير طازجة (7 مل 100٪ جلسرين ، 3 مل NEB ، 200 مو ؛ L 50x مثبط البروتياز)
Buffer B1تحضير طازج (25 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي EDTA ، 50 ملي Tris-HCl درجة الحموضة 8 ، 1٪ إيجبال ، 1x مثبط للبروتينات)
العازلة B2تحضير طازجة (150 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي EDTA ، 50 ملي ثلاثية حمض الهيدروكلوريك 8 ، 0.5٪ إيجبال ، 1 × مثبط للبروتياز)
العازلة B3تحضير طازجة (150 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي EDTA ، 50 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك 8 ، 1x مثبط البروتينات)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer مجهز بمسبار microtip 3 ممSonicsVCX 130
مصفاة خليةFalcon352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Life Technologies65601
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
أنبوب صغير دوارفيشر Scientific260750F
2x Laemmli عينة عازلةامزج 400 مجم من SDS ، 2 مل 100٪ جلسرين ، 1.25 مل من 1 M Tris (درجة الحموضة 6.8) ، و 10 مجم من البروموفينول الأزرق في 8 مل من الماء. يخزن في 4  ° C لمدة تصل إلى 6 أشهر. قبل الاستخدام ، أضف 1 M DTT إلى التركيز النهائي البالغ 200 مل.
أقفال غطاء لأنبوب 1.5 ملفيشر ScientificNC9679153
كواشف
NOVEX طقم تلطيخ أزرق غرويInvitrogenLC6025
طبق زراعة الأنسجة 12 بئرCorning3513
CoverslipsFisher Scientific12-545-100الأوتوكلاف قبل الاستخدام
شرائح المجهرفيشر Scientific12-552-5
16٪ بارافورمالديهايدعلوم المجهر الإلكتروني15710تمييع إلى 3.7٪ في 1x PBS قبل الاستخدام
ألبومين مصل البقر (BSA)فيشر ScientificBP1605تحضير 3٪ في 1x PBS
(0.5٪ Triton-X 100)Sigma-AldrichT8787تحضير 0.5٪ Triton-X 100 في 1x PBS
انقر فوق كوكتيل التفاعل - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imagingالمجسات الجزيئيةC10337التحضير وفقا لبروتوكول manufactorer
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399تحضير 10 مجم / مل في الماء ، ويمكن تخزينه عند 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى 1 سنة
من الفأر المضاد للجسم المضاد الأساسي ل ICP8Abcamab20194استخدم تخفيف 1: 200 في 1x PBS
Mouse المضاد للجسم المضاد الأساسي UL42 (2H4)Abcamab19311استخدم تخفيف 1: 200 في 1x PBS
Goat المضاد للفأر 594 مترافقتقنيات الحياةa11005استخدم تخفيف 1: 500 في 1x PBS
Immu-mountThermo Fisher Scientific9990402
SDS-bicarb2٪ SDS ، 200 ملي NaHCO3
الفينول: الكلوروفورم: كحولمزيج 25:24: 1 قبل يوم واحد على الأقل من الاستخدام ، يخزن في درجة حرارة 4 درجات ؛ C في
الكلوروفورم الداكن: كحولامزج 24: 1 قبل يوم واحد على الأقل من الاستخدام ، وتخزينه في درجة حرارة الغرفة في الظلام
10x Tris EDTA (TE) ، درجة الحموضة 8.0100 ملي تريس ، 10 ملي مولار EDTA (خفف إلى 1x قبل الاستخدام)
طقم تنقية Qiaquick PCRQiagen28104
3 M أسيتات الصوديوم درجة الحموضة 5.2
كيوبت 2.0 مقياس الفلورInvitrogenQ32866
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ32851
أنابيب فحص كيوبيتInvitrogenQ32856
مجهر مضان مجهز ببرنامج
جهاز طرد مركزي دقيق لأنابيب
جهاز طرد مركزي منضدية لأنابيب
حاضنة الثقافة خزانة
السلامة الحيوية
كتل65 درجة ؛ C و 95 درجة ؛ ج
التفاعل المؤقت معالج النشاف الغربية القياسية المخزن المؤقت للنفاذية Kit 2x محلول الأيزواميل الأيزواميل تصوير1.5 مل15 و 50 مل خلية حرارية

المراجع

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
  2. Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
  3. Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242(2013).
  4. Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
  5. Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
  6. Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
  7. Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
  8. Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
  9. Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
  10. Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
  11. Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
  12. Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
  13. Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
  14. Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
  15. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
  16. Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852(2012).
  17. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
  18. Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
  19. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
  20. Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834(2016).
  21. Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
  22. Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
  23. Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
  24. Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
  25. Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939(2015).
  26. Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166(2017).
  27. Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
  28. Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
  29. Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
  30. Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة