مقالة منهجية

شرنا المجمعة الشاشة لإعادة تنشيط MeCP2 على كروموسوم X غير نشط

6.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56398

⸱

مارس 2, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Hematology Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 3Epigenetics Program, Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Departments of Medicine and Biochemistry, University of Washington

في هذه المقالة

ملخص

نحن تقرير الحمض النووي الريبي دبوس صغير (شرنا) والبروتوكول على أساس تسلسل الجيل القادم لتحديد الجهات التنظيمية للمنظمة إكستشروموسومي في خط خلية مورين مع لوسيفراس اليراع وتنصهر فيها جينات مقاومة هيجروميسين الميثيل البد ملزمة البروتين 2 ( MeCP2) الجينات على كروموسوم X غير نشط.

الملخص

شاشات الجينية إلى الأمام باستخدام الجينات مراسل إدراجها في هيتيروتشروماتين قد استخدمت على نطاق واسع للتحقيق وآليات الرقابة جينية في نموذج الكائنات الحية. وقد مكنت التكنولوجيات بما في ذلك الكشف دبوس الشعر القصير (شرناس) ومجمع إينتيرسباسيد بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) هذه الشاشات في خلايا الثدييات مثنوية. هنا يمكننا وصف شاشة شرنا على نطاق واسع للمنظمين للمنظمة إكستشروموسومي (إكسسي)، باستخدام خط خلية مورين مع لوسيفراس اليراع وطرقت جينات مقاومة هيجروميسين في ج-محطة الميثيل البد البروتين الجيني (MeCP2) 2 على إكستشروموسومي غير نشط (الحادي عشر). إعادة تنشيط بناء في خط الخلية مراسل تمنح ميزة البقاء على قيد الحياة تحت هيجروميسين ب التحديد، مما مكننا من شاشة مكتبة كبيرة شرنا وتحديد دبابيس الشعر التي أعادت تنشيط المراسل بقياس التحديد بعد تخصيب اليورانيوم باستخدام تسلسل الجيل القادم. ثم التحقق من دبابيس الشعر المخصب على حدة عن طريق اختبار قدرتها على تنشيط لوسيفراس المراسل في الحادي عشر.

المقدمة

أحد الأشكال الأكثر شيوعاً للإعاقة العقلية وراثية في الإناث، ومتلازمة ريت، بسبب الطفرات متخالف في MeCP2، جينات إكستشروموسومي الذي يقوم بترميز بروتين ضروري لوظيفة الخلايا العصبية الطبيعية1. اتباع نهج محتمل لعلاج هذا الاضطراب سيكون تنشيط اليل MeCP2 البرية من نوع الحادي عشر، كما تبين ذلك استعادة التعبير MeCP2 لعكس العجز العصبية في نموذج الفأر من هذا المرض1، 2 , 4-بيد إسكات جينية من واحد من اثنين من الكروموزومات في خلايا الإناث العاشر هو الإبقاء على أحكام طوال العمر الافتراضي لكائن حي3،4، والمرجح أن تتطلب تنشيط قوية من الجينات الحادي عشر رئيسية اضطراب في مسارات تنظيمية جينية متعددة.

تحديد العوامل اللازمة للصيانة لإسكات MeCP2 ، وضعنا أول نموذج ماوس المحورة وراثيا تحمل MeCP2-لوسيفراس-هيجروميسين مقاومة جينات انصهار (MeCP2-لوك-الموارد البشرية) على واحد من اثنين من الكروموزومات العاشر (س MeCP2-LUC-HRسMeCP2)5. على الرغم من أن MeCP2 أعرب عن بناء الانصهار أثبتت أنها غير مستقرة، وأسفرت عن فقدان وظيفة، محاكاة phenotypically MeCP2 الحذف في الذكور هيميزيجوس (X/YMeCP2-لوك-الموارد البشرية)، والتعبير عن الجينات مراسل كان من الممكن اكتشاف سهولة في نمط متسق مع التعبير عن الذاتية MeCP25. نحن ثم ولدت الحيوانات المستنسخة مخلدة تنتجها الخلايا الليفية مع البناء على إكستشروموسومي نشطة أو غير نشطة، وأكدت أن السابق أعرب عن نوع البرية MeCP2 ولا في بناء مراسل؛ معكوس كان صحيحاً لهذا الأخير. عندما تتعرض للحمض النووي ديميثيلاتينج عامل معروف أن تلغي إسكات الجينات، 5-أزاسيتيديني (5-عزة)، الخلايا مع المراسل في الحادي عشر ("خلايا مراسل") اكتسب النشاط في مقايسة الإضاءة الحيوية، مشيراً إلى أن لدينا بناء يمكن أن يعاد تنشيط وبالتالي وتستخدم للفحص الوراثي.

لقد طورنا التالية شاشة وراثية الفائق للمنظمين لإسكات MeCP2 . خط الخلية مراسل أول مصاب بالفيروس المكتبة التي تحتوي على > 60,000 شرناس مختلفة تستهدف > الجينات 25,000 طوال5،الماوس الجينوم6، وبعد ذلك تعرض لاختيار هيجروميسين ب. مقارنة تواتر دبوس في مرحلة ما قبل وما بعد اختيار العينات باستخدام تسلسل الجيل القادم، كمراسل تنشيط تمنح ميزة النمو ضمن التحديد هيجروميسين ب وأدت إلى إثراء المسؤولين دبابيس الشعر. باستخدام هذا النهج، حددنا 30 الجينات المتورطين في MeCP2 إسكات، وأكدت في وقت لاحق النتائج ترانسدوسينج الخلايا مراسل مع دبابيس الشعر الفردية وقياس نشاطها لوسيفراس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأجريت كل الخطوات التي تنطوي على الحيوانات باستخدام بروتوكولات وافق "فريد هتشينسون بحوث مركز المؤسسية الحيوان العناية بالسرطان" واستخدام اللجنة (إياكوك). من المعروف لا والكواشف المستخدمة هنا تشكل مخاطر كبيرة على صحة الإنسان باستثناء 5-أزاسيتيديني (5-عزة).

1-توليد خط خلية مراسل مع MeCP2لوك-HR التحوير في الحادي عشر

  1. إعداد الماوس الأربطة الليفية من أنثى س سلوك MeCP2 ساعة الماوسMeCP2
    1. Euthanize يوم 10-12-أنثى القديمة س سلوك MeCP2 ساعةالماوسMeCP2 .
    2. باستخدام مقص تشريح مستقيم، جعل شق كفافى عن طريق الجلد من الجزء الذيل الدانية.
    3. عقد الذبيحة القرب من قاعدة الذيل، سحب الجلد بعيداً عن الماوس لفضح الجزء فيبروكارتيلاجينوس من الذيل. إزالة وقطع المحطة 10 ملم الأنسجة المعرضة إلى 1 ملم أجزاء طويلة باستخدام مشرط جراحة.
    4. نقل الأنسجة مجزأة إلى 15 مل مخروطية أنبوب يحتوي على 5 مل من تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) وتستكمل مع 1 يو/مليلتر البنسلين 1 ميكروغرام/مل ستربتوميسين وكولاجيناز 1.5 ملغ/مل، قبل تصفيتها عن طريق 0.45 ميكرومتر ومرشحات الشبكة ثم 0.2 ميكرون. احتضانها ح 3-4 في 37 درجة مئوية مع التناوب المستمر.
    5. أجهزة الطرد المركزي العينة في درجة حرارة الغرفة في 500 x ز للحد الأدنى 10 ريسوسبيند بيليه في 10 مل دميم تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، 1 يو/مليلتر البنسلين، و 1 ميكروغرام/مل ستربتوميسين (دميم-10) وطبق على طبق استنبات الأنسجة 6-جيدا. مرور الخلايا مرة واحدة وتوسيع لصفيحة 10 سم قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
    6. تخليد الخلايا عن طريق إجراء توصيل مع متجه تعبير يحمل فيروس الورم الحليمي البشري-16 المسرطنة الفيروسية (E6/E7)، كما هو موضح سابقا7.
  2. تحديد خلية مفردة الحيوانات المستنسخة وتميز MeCP2 المراسل التعبير
    1. حصاد الخلايا من صفيحة 10 سم. أولاً، نضح وسائط الإعلام، وإضافة 1 مل من 0.05% التربسين-يدتا، واحتضان لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية. آرو مع مل 9 من دميم-10 وجمع الخلايا ريسوسبينديد في أنبوب مخروطي 15 مل.
    2. تمييع الخلايا مع دميم-10 إلى تركيز نهائي للخلية 1/100 ميليلتر. نقل إلى لوحات 96-جيدا قبل بيبيتينج ميليلتر 100 تعليق في كل بئر.
    3. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى الآبار هي روافد، الذي يمكن أن يستغرق فترة تصل إلى 2-3 أسابيع. استبدال وسائط الإعلام مع 10 دميم جديدة كل 3-5 أيام. عندما المتلاقية، تعبئة الخلايا مع 20 ميليلتر من 0.05% التربسين-يدتا كل بئر وتقسيمها إلى مجموعتين مكررة من لوحات 96-جيدا.
    4. استخدام مجموعة واحدة من ألواح للاعتداء للنشاط لوسيفراس. استخدام أدوات تحليل لوسيفراس اليراع متجانسة التي لا تتطلب إزالة الوسائط. يتبع البروتوكول المضمنة مع هذه المجموعة.
    5. استخدام النتائج من الخطوة 1.2.4 لتحديد الحيوانات المستنسخة مع أي نشاط لوسيفراس القابلة للاكتشاف من مجموعة اللوحات الباقية. قم بتوسيع هذه الحيوانات المستنسخة إلى لوحات 24-جيدا وثم 6-جيدا.
    6. أداء نفس لاستنساخ مع النشاط لوسيفراس أعلى؛ سيتم استخدام هذا كعنصر إيجابي لأغراض التحقق من الصحة.
    7. الحصاد قاسمة لكل بئر في لوحة 6-جيدا لوصمة عار غربية. تعبئة الخلايا مع 200 ميليلتر التربسين-يدتا 0.05%. احتضان لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية. آرو مع 2 مل 10 دميم، ونقل نصف عدد الخلايا إلى 1.5 مل أنبوبة الطرد المركزي. غسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني قبل ليسينج للطخة غربية. وبدلاً من ذلك، نقل نصف عدد الخلايا إلى آخر لوحة 6-جيدا. عند إرفاق الخلايا إلى الجزء السفلي من اللوحة، شطف مع برنامج تلفزيوني للطخة غربية.
    8. أداء الغربية وصمة عار مع جسم MeCP2 المضادة للتأكد من أن الخلايا السلبية لوسيفراس express، بينما الخلايا لوسيفراس-الإيجابية لا تعبر عن MeCP2 البرية من نوع من كروموسوم X النشطة؛ اتبع البروتوكول هو موضح سابقا8. استخدام أنسجة المخ من أي ماوس نوع البرية كعنصر إيجابي.
    9. لوحة استنساخ سلبية عدة على 2 × 105 خلايا/بئر في لوحة 6-جيدا. علاج مرة واحدة مع 10 ميكرون 5-عزة واحتضانها ح 72 دون تغيير وسائط الإعلام، والاعتداء للنشاط لوسيفراس كما هو موضح في الخطوة 1.2.3.
    10. اختر استنساخ سلبي واحد (استنساخ الحادي عشر) الذي اكتسب النشاط لوسيفراس مع 5-عزة والبدء بتوسيع نطاقه إلى عدة لوحات 10 سم. تجميد المستنسخين السلبية المتبقية في النتروجين السائل كنسخة احتياطية. يمكن الاحتفاظ بها في زراعة الأنسجة استنساخ الإيجابية (Xa استنساخ) أو مجمدة حتى استخدامها مرة أخرى.

2-فرز المكتبة لتنشيط استخدام التحديد هيجروميسين ب

  1. إصابة استنساخ التجارب وتطبيق التحديد وحصاد الحمض النووي للتسلسل
    1. الحصول على مركزات الفيروسية للفيروسات الرجعية بنيات الإعراب عن دبابيس الشعر من مكتبة شرنا، أو إنتاج المادة طافية الفيروسية يتركز استخدام بروتوكول المضمنة مع المكتبة المطلوبة.
    2. قبل المتابعة مع الشاشة، تيتراتي المكتبة (باستخدام علامة التجارة والنقل، إذا كان متوفراً). هدف لعدد وافر عدوى بين 0.3 و 0.5.
      ملاحظة: أداء شاشات مستقلة على الأقل أربعة للتقليل من معدلات إيجابية كاذبة. استخدام لوحات 20 كل الشاشة للحصول على تغطية 100-fold مكتبة للحفاظ على التمثيل الكافي من دبابيس الشعر وتجنب التسرب عشوائي9. ومع ذلك، نظراً لشاشة التحديد الإيجابي ومكتبة كبيرة حجم، فمن المحتمل أن يكفي تغطية أقل.
    3. في الصباح، لوحة 1 × 106 الحادي عشر خلايا على لوحات زراعة الأنسجة 10 سم.
    4. في فترة ما بعد الظهر، تصيب اللوحات بالاستعاضة عن وسائل الإعلام مع دميم-10 الطازجة التي تحتوي على المادة طافية الفيروسية و 5-10 ميكروغرام/مل من بوليبريني. استخدام الكمية من المادة الفيروسية طافية تحديد في الخطوة 2.1.2.
    5. بعد 18-24 ساعة، نضح وسائط الإعلام وإضافة 10 مل من جديد دميم-10 لكل لوحة. الثقافة لآخر 48 ساعة.
    6. في الصباح، وتعبئة الخلايا باستخدام مل 1 0.05% التربسين-يدتا للوحة الواحدة واخماد مع مل 9 من 10 دميم للوحة الواحدة. تشغيل التعليق من خلال عامل تصفية شبكة 100 ميكرومتر. تجميع المعلقات التي تمت تصفيتها، والبذور مجموعتين من لوحات 10 سم في 1 × 106 خلايا/لوحة.
    7. في فترة ما بعد الظهر، استبدال وسائط الإعلام في مجموعة واحدة من لوحات دميم-10 تحتوي على 15 ميكروغرام/مل من هيجروميسين ب (يوم 0). في مجموعة أخرى، استبدال الوسائط مع 10 دميم الطازجة فقط.
    8. بعد 48 ساعة، تعبئة الخلايا من دون علاج مجموعة من لوحات استخدام مل 1 0.05% التربسين-يدتا. احتضان لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية. آرو مع مل 9 من 10 دميم. نقل الخلايا إلى 15 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح في supernatants والشروع فورا في استخراج الحمض النووي من الكريات. وبدلاً من ذلك، تجمع الخلايا في أنابيب أكبر قبل خطوة الطرد المركزي.
    9. استخراج الحمض النووي باستخدام خليط من الفينول وتشروروفورم ويعجل بالحمض النووي مع إيثانول صوديوم اسيتات والباردة كما هو موضح سابقا10. تجمع عينات الحمض النووي الاختيار الفردية وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
    10. مواصلة استزراع هيجروميسين ب التحديد تعيين لمدة 4 أيام أخرى. تجديد اختيار وسائل الإعلام مع دميم-10 الطازجة التي تحتوي على هيجروميسين ب بعد يومين.
    11. في يوم 7، استبدال الوسائط التحديد مع 10 دميم الطازجة فقط. تسمح 2 إلى 4 أيام للشفاء، ومن ثم حصاد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.1.8. المضي قدما في استخراج الحمض النووي كما هو موضح في الخطوة 2.1.9.
  2. تحديد دبابيس الشعر أثري في عينات ما بعد التحديد
    1. استخدام 5 'السياق (5'-أتكجتجككتجكاكاتكتج-3 ') و 3' عكس حلقة كبسولة تفجير (5 '-أكاتكتجتجكتكاكتا-3') تضخيم النصف-دبابيس الشعر من عينات الحمض النووي ما قبل وما بعد التحديد. استخدام جميع استخراج الحمض النووي في ردود الفعل PCR منفصلة مع 100-200 نانوغرام من الحمض النووي لرد الفعل.
      ملاحظة: هذه السياق التمهيدي 5 '3' حلقة عكس كبسولة تفجير تطابق وتسلسل سياق مير-30 المنبع لإدراج شرنا والتسلسل في حلقة شرنا، على التوالي. وسيتطلب مكتبات مختلفة أوليجوس مختلفة. ضبط خطوات تنقية لعزل أحجام مختلفة من المنتجات حسب الضرورة.
    2. استخدام التحديد حجم الخرز إزالة أجهزة الإشعال والحمض النووي، واسترداد المنتجات بكر بين 100 و 200 هناك يتبع البروتوكول المضمنة مع الخرز.
    3. إعداد مكتبة تسلسل تسلسل النصف-دبابيس الشعر. إنشاء على الأقل 50 مليون على ما يلي في الشاشة. يتبع البروتوكول المناسب لتسلسل مجموعة أدوات ومعدات.
      ملاحظة: يوفر 50 مليون على ما يلي في الشاشة 1000-fold تمثيل كل شرنا في المكتبة وتقريبا إذ التغطية لكل عدوى مستقلة (نفذت في تمثيل كل شرنا 100-fold)، مما يضمن التمثيل الكافي كل حدث العدوى.
    4. تعداد كل شرنا استخدام برنامج نصي Perl التي تهم تسلسل مع مباريات مثالية. اختيار شرناس الذي كان يقرأ على الأقل 10 في تجمع الاختيار الأولى لمزيد من التحليل. حساب الإثراء كنسب من بعد للاختيار الأولى بحساب وتحديد معدل اكتشاف كاذبة (FDR) على أساس التباديل 1000. اختيار الجينات المستهدفة التي شرناس مع < 5% فرانكلين روزفلت ك "هيتس لإجراء مزيد من التجارب.

3-التحقق من دبابيس الشعر التي تم تحديدها ("يضرب")

  1. لينتيفيروسيس العبوة التي تحتوي على شرناس التي تم تحديدها في الشاشة
    1. بذور 8 × 106 خلايا 293 مترا كل لوح على لوحات 10 سم.
    2. في اليوم التالي، استبدال الوسائط مع مل 9 10 دميم خالية من المضادات الحيوية في اللوحة؛ هذا 30 دقيقة قبل تعداء.
    3. أثناء الفاصل الزمني لمدة 30 دقيقة، إعداد يمزج اثنين تعداء:
      1. إعداد مزيج 1 (كل لوحة/شرنا؛ رفع مستوى وفقا لإجمالي عدد شرناس): 10 ميليلتر من 2 مغ/مل بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد) في 0.5 مل وسائط الأساسية الحد الأدنى الأمثل. مزيج من بيبيتينج واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      2. إعداد مزيج 2 (لكل شرنا): 4 ميكروغرام ناقل شرنا تعبئتها، 1.5 ميكروغرام من ناقلات المغلف ز منظمة (pMD2.G)، و 2.5 ميكروغرام ناقل التعبئة والتغليف (psPAX2)، مختلطة في 0.5 مل وسائط الأساسية الحد الأدنى الأمثل.
        ملاحظة: تشمل موجه لينتيفيرال فارغ في التعبئة والتغليف لاستخدامها في التهابات فيما بعد كعنصر سلبي.
    4. إضافة 0.5 مل مزيج 1 لكل قاسمة ميكس 2، وتخلط بلطف بيبيتينج. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    5. تطبيق هذا الخليط على كل لوح من الخطوة 3.1.2 بطريقة دروبويسي؛ دوامة اللوحة برفق لخلط.
    6. في اليوم التالي، استبدال الوسائط مع 5 مل 10 دميم الطازجة.
    7. 48 ساعة بعد تعداء الأولية، جمع المادة طافية وتشغيله من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. قبل الرطب عامل التصفية مع دميم-10 تحقيق أقصى قدر من الانتعاش.
    8. قاسمة المادة طافية المصفاة إلى المبالغ مثالية لإصابة لوحة 6-جيدا جيدا.
    9. تجميد مختبرين في-80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق، أو الشروع فورا في توصيل.
  2. توصيل واختبار دبابيس الشعر الفردية لتنشيط مراسل لوسيفراس وإعادة تنشيط الجين MeCP2 البرية من نوع في الحادي عشر.
    1. في الصباح، لوحة 1 × 105 الحادي عشر خلايا/بئر على 6 لوحات جيدا.
    2. في فترة ما بعد الظهر، تصيب اللوحات بالاستعاضة عن وسائل الإعلام مع 2 مل من دميم-10 الطازجة التي تحتوي على المادة طافية لينتيفيرال و 5-10 ميكروغرام/مل من بوليبريني. تصيب تحكم تماما مع المادة الفيروسية طافية تنتج من موجه لينتيفيرال فارغ.
    3. في اليوم التالي، استبدال الوسائط مع 2 مل من دميم-10 تحتوي على 1 ملغ/مل بوروميسين. الثقافة لمدة أربعة أيام.
    4. استبدال وسائط الإعلام مع 2 مل 10 دميم الطازجة وتسمح ح 48-72 للانتعاش.
    5. تعبئة الخلايا مع 150 ميليلتر من 0.05% التربسين-يدتا. احتضان لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية. آرو مع 1.5 مل 10 دميم. نقل الخلايا إلى 15 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. قم بإزالة الوسائط والخلايا الموجودة في المخزن المؤقت تحلل ميليلتر 100 قدم في أدوات التحليل لوسيفراس ريسوسبيند. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. نقل ليساتيس إلى أبيض 96-جيدا لوحة ومقايسة لنشاط لوسيفراس باستخدام البروتوكول المضمنة مع هذه المجموعة. استخدام خلايا Xa كعنصر إيجابي والحادي عشر الخلايا المصابة مع موجه لينتيفيرال فارغ كعنصر سلبي.
      ملاحظة: تجنب تعريض لوحات بيضاء على ضوء الفلورسنت قبل الفحص؛ وهذا الحد من الخلفية وزيادة حساسية المقايسة. تم العثور على البروتوكول بتوفيرها في أدوات التحليل لتكون أكثر فعالية إذا كان أداؤها في الظلام كلما كان ذلك ممكناً.
    7. لتحديد ما إذا دبوس كان لها تأثير على مستوى التعبير MeCP2 على X-chromosome النشطة، عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الحادي عشر تراندوسيد وقياس مستوى مرناً MeCP2 باستخدام PCR الكمي مع الإشعال تهدف إلى تضخيم فقط نوع البرية MeCP2 (f: --تككاتجككاجككااكاج 5 '-3', R: 5 '-كككاتاجاجاجاجاكاكاجك-3').
    8. الاختياري: زيادة حساسية المقايسة بإضافة 5-العزة لتركيز 0.2 ميكرون نهائي بعد أن شُفي الخلايا من التحديد بوروميسين. الثقافة الخلايا ح 72 دون استبدال وسائط الإعلام، والاعتداء ثم لنشاط لوسيفراس باستخدام طقم الإنزيم لوسيفراس التجارية.
    9. تدبير إعادة تنشيط MeCP2 البرية من نوع كاتم. تصيب الخلايا Xa، التي تأوي نوع البرية MeCP2 في الحادي عشر، مع الموجه التي تحتوي على دبابيس الشعر الفردية، اتباع الخطوات بروتوكول 3.2.1. -3.2.4. عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا وقياس مستوى مرناً MeCP2 باستخدام PCR الكمي مع الإشعال تهدف إلى تضخيم فقط نوع البرية MeCP2 (5 واو: '-تككاتجككاجككااكاج-3', r: 5 '-كككاتاجاجاجاجاكاكاجك-3').

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كانت تحصد الماوس الأربطة الليفية من سبق وصفها س سMeCP2-لوك-الموارد البشريةالمستنسخة باستخدام إضعاف الحد الماوسMeCP2 الإناث، خلدها بتوصيل النسخ العكسي المسرطنة E6 و E7 من virus7 فيروس الورم الحليمي البشري-16، واختبار ل نشاط لوسيفراس والتعبير عن البروتين MeCP2 البرية من نوع (الشكل 1A و 1B). وكان النشاط لوسيفراس قوية إذا كان المراسل على شي، ولا يمكن الكشف عنها إذا كانت في الحادي عشر؛ التعبير MeCP2 الأصلية معروضة على نمط المعاملة بالمثل. نحن نخبة من استنساخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في مؤخرا دراسة6ونحن إنشاء خط خلية مورين مع لوسيفراس وجينات مقاومة هيجروميسين تنصهر فيها MeCP2 في الحادي عشر، وترانسدوسيد أنه مع مكتبة > استهداف شرناس 60,000 > 25,000 الجينات. وجدنا 30 الجينات التي ميزة تدق لأسفل الممنوحة للبقاء على قيد الحياة تحت هيجروميسين ب التحديد، مما يوحي بدورها في مراقبة MeCP2 وإسكات X-chromosome. تم التحقق من صحة هذه النتائج ترانسدوسينج خط الخلية المبلغ عنها مع دبابيس الشعر الفردية وتقييم تنشيط المراسل لوسيفراس الصمت.

وقدمت الاس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الدكتور ليكو ساهمت هذه المادة كموظف بمركز أبحاث فريد هاتشينسون السرطان.  الآراء التي أعرب عنها هي بلده ولا تمثل بالضرورة وجهات نظر حكومة الولايات المتحدة أو المعاهد الوطنية للصحة

شكر وتقدير

ونحن نشكر ديكينس روس من جامعة ملبورن تكرم توفير مكتبة شرنا المستخدمة في الشاشة. تم تمويل هذا العمل من ريت متلازمة البحوث الثقة (أتال بيهاري).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
293FT Cell LineInvitrogenR700-07
5-AzacytidineSigmaA2385-100MG
Agencourt AMPure XPBeckman-CoulterA63881
الأجسام المضادة ل MECP2Millipore07-013
CollagenaseSigmaC2674-1G
Corning 96-Well الصلبة من البوليسترين الأبيض المجهريفيشر ساينتفيك07-200-336
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965-092
توقف التعبير ناقلات الفيروسات القهقرية المتكيفة مع microRNA (pMSCV)Open BiosystemsEAV4679
Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir مكتبةOpen BiosystemsRMM3796
مصل الأبقار الجنينيFisherbrand03-600-511
HiSeq 2500IlluminaSY & ndash ؛ 401 & ندش ؛ 2501أو ما يعادله
Hygromycin BCalbiochem400051-1MU
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
نظام فحص Bright-Glo LuciferasePromegaE2610مقايسة متجانسة لفحص المستعمرات
لوسيفيرازPromegaE4530مقايسة غير متجانسة لاختبار دبابيس
الشعر الفرديةمقياس الإضاءة TopCount NXTPerkin ElmerN / Aأو مقياس الإضاءة المماثل
MiSeq Recode Kit v2IlluminaMS-102-2001استخدم مجموعة متوافقة مع أجهزتك
Opti-MEMGibco31985-070
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
pMD2.GAddgene# 12259VSV-G ناقلات
المغلفPolybreneSigmaTR-1003-G
PolyethyleniminePolysciences23966-1
psPAX2Addgene# 12260ناقلات التعبئة والتغليف
PuromycinGibcoA11138-02
Trypsin-EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمرGibco25300-054
نظام فحص

المراجع

  1. Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
  2. Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
  3. Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
  4. Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
  5. Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
  6. Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
  7. Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
  8. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
  9. Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341(2012).
  10. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
  11. Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
  12. Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
  13. Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
  14. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
  15. Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
  16. Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12(2014).
  17. Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

X MeCP2

مقالات ذات صلة