مقالة منهجية

إعداد الخلايا الأولية من سرطان الدم الليمفاوي الحاد في مراحل مختلفة من دورة الخلية بالطرد المركزي الوترياتيون

DOI:

10.3791/56418

⸱

نوفمبر 10, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Experimental Therapeutics, University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول استعمال الوترييشن الطرد المركزي لفصل الخلايا الأولية من سرطان الدم الليمفاوي الحاد في مراحل مختلفة من دورة الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على مزامنة الخلايا تم المركزية لتعزيز فهمنا لتنظيم دورة الخلية. وتشمل التقنيات الشائعة المستخدمة المصل الحرمان؛ المواد الكيميائية التي تعتقل الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية؛ أو استخدام الانقسامية اهتزاز-إيقاف الذي يستغل التزامهم خفض. ومع ذلك، كل هذه لها عيوب. على سبيل المثال، يعمل المصل المجاعة جيدا للخلايا الطبيعية ولكنها أقل جيدا للخلايا السرطانية مع نقاط التفتيش دورة الخلية الشبهة بسبب فقدان القامع التنشيط أو الورم السرطاني. وبالمثل، يمكن السكان خلية المعالجة كيميائيا المرفأ الأضرار الناجمة عن المخدرات وإظهار التعديلات المتصلة بالإجهاد. هو أسلوب الذي تلتف هذه المشاكل كونتيرفلوو الوترياتيون الطرد المركزي (CCE)، حيث يتعرض الخلايا إلى قوتين متعارضتين وقوة الطرد المركزي وسرعة السوائل، مما يؤدي إلى انفصال الخلايا استناداً إلى حجم وكثافة. نظراً لتوسيع نطاق الخلايا المضي قدما من خلال الدورة عادة، يمكن استخدام مركز التعليم المستمر لفصل الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية. هنا نقوم بتطبيق هذا الأسلوب للخلايا الأولية من سرطان الدم الليمفاوي الحاد. تحت الظروف المثلى، يمكن الحصول سكان أساسا نقية من الخلايا في المرحلة G1 وعدد سكانها مخصب بدرجة عالية من الخلايا في مراحل G2/M في الغلة ممتازة. هؤلاء السكان الخلية هي مناسبة بشكل مثالي لدراسة دورة الخلية تعتمد على آليات عمل المخدرات السرطان والتطبيقات الأخرى. ونحن أيضا إظهار كيف تعديلات على إجراءات قياسية يمكن أن يسفر عن أداء دون المستوى الأمثل ومناقشة أوجه قصور الأسلوب. وينبغي تيسير المنهجية التفصيلية المقدمة التطبيق واستكشاف هذه التقنية إلى أنواع أخرى من الخلايا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا المستزرعة عادة تنمو بشكل غير متزامن وخلايا فردية موجودة في مختلف مراحل دورة الخلية. معرض متزامن بطبيعة الحال خلية دورات بعض الكائنات الحية أو يمكن أن تكون متزامنة بالمنبهات الفسيولوجية المحددة. على سبيل المثال، تقسيم الأنوية داخل plasmodia العملاقة من الوحل العفن بوليسيفالوم فيساروم في أزياء متزامنة عالية1، وخلايا الطحالب الخضراء كوادريكودا ديسموديسموس يمكن أن تكون متزامنة بالتناوب الضوء والظلام 2من فترات. في حين تقدم مثل هذه الكائنات سمات تجريبية فريدة من نوعها، أنها نموذج غير كاف تعقيدات خلايا الثدييات. القدرة على مزامنة مصطنع السكان خلية الثدييات قد المركزية لتعزيز فهمنا لتنظيم دورة الخلية والأساس الجزيئي لنقاط التفتيش دورة الخلية. وتشمل الأساليب الشائعة الحرمان المصل أو كتلة الكيميائية والإفراج أو استغلال الخصائص الفيزيائية3،4. انسحاب مصل غالباً ما يسبب الخلايا لدخول التتابع، وإعادة إضافة المصل تشجع عودة دورة الخلية في المرحلة G15. مثبطات الكيميائية تشمل عوامل مثل هيدروكسيوريا التي كتلة الخلايا عند حدود G1/S، thymidine الزائدة أو مثبطات ميكروتوبولي الذي عادة اعتقال الخلايا في3،م المرحلة4. وتشمل النهج التي تستغل الخصائص الفيزيائية الانقسامية اهتزاز-إيقاف التشغيل التي يمكن استخدامها لإثراء للخلايا الانقسامية لأنها ملتصقة أقل من الطور البيني خلايا6. ومع ذلك، جميع هذه التقنيات على العيوب المحتملة. على سبيل المثال، ليس كل أنواع الخلايا الحفاظ على استمرارية في عدم وجود مصل أو وجود مثبطات الكيميائية، والعائد من الخلايا بعد اهتزاز الانقسامية قبالة يقتصر دون المزامنة المسبقة مع مثبطات الانقسامية.

وباستثناء دورات الخلية الجنينية المبكرة، حيث تنخفض الخلايا تدريجيا في الحجم كما أنها تقسم7، معظم خلايا المضي قدما من خلال الدورة الخضوع لمراحل النمو وتصبح أكبر. يتم استغلال هذه الخاصية في أسلوب الطرد المركزي كونتيرفلوو الوترييشن (CCE)، التي يمكن استخدامها لفصل الخلايا التي تختلف في الحجم ومن ثم في دورة الخلية المرحلة8،9. خلال مركز التعليم المستمر، الخلايا تحت تأثير قوتين متعارضتين: قوة الطرد المركزي، الذي يدفع الخلايا بعيداً عن محور الدوران، وسرعة السائل (كونتيرفلوو)، الذي يحرك الخلايا اتجاه محور الدوران (الشكل 1). الخلايا في قاعة الوترياتيون التوصل إلى وضع توازن التي تتساوى فيها هذه القوات. هي العوامل الرئيسية لإملاء موقف التوازن قطر الخلية والكثافة. هو زيادة معدل الحل المخزن المؤقت التدفق وقوة السحب كونتيرفلوو تفوق قوة الطرد المركزي، وهو إنشاء توازن جديد، تسبب تغييرا في موقف خلايا داخل الدائرة. يتم إزاحة كافة الخلايا تجاه إنهاء الدائرة، أسفر عن أصغر منها ترك الدائرة الأولى، بينما الخلايا أكبر البقاء داخل الدائرة حتى يزداد بمعدل كونتيرفلوو بما فيه الكفاية لتشجيع الخروج. الخلايا الهروب من قاعة الوترييشن مع الزيادات المتتالية في سعر كونتيرفلوو يمكن جمعها في أجزاء محددة وكل جزء يحتوي على خلايا لزيادة أحجام تسلسلياً. بدلاً من إجراء الوترياتيون مع زيادات تدريجية في سعر كونتيرفلوو، انخفاضات متتالية في قوة الطرد المركزي بتقليل سرعة الطرد المركزي سيتم تحقيق نفس النتيجة. تتطلب عملية الوترياتيون الأمثل اعتماداً على نوع من الخلايا والوترياتيون المخزن المؤقت المستخدمة والأجهزة المحددة المستخدمة. معدل ترسب خلايا في هذه الظروف هو أفضل وصف لقانون ستوكس: SV = [د2(ρ-ρفم)/18η] ص2.ω، حيث SV = سرعة الترسيب؛ d = قطر الجسيمات؛ Ρف = كثافة الجسيمات؛ Ρm = الكثافة من المخزن المؤقت؛ Η = اللزوجة المخزن المؤقت؛ Ω = السرعة الزاوية للدوار؛ و r = موقف شعاعي من الجسيمات. وهكذا، SV يتناسب مع قطر الخلية والكثافة، وحيث يتم رفع قطرها إلى السلطة الثانية، يساهم إلى حد كبير أكثر من الكثافة وثابتة عموما من خلال دورة الخلية.

ميزة هامة لمركز التعليم المستمر هو أن خلايا لا تخضع لشروط قاسية للعلاج الكيميائي أو الحرمان التغذوي ويمكن استردادها في الغلة ممتازة دونما قلاقل أساسا. شرط أن الخلايا المذكورة تخضع لزيادة كبيرة في قطر، من 30 في المائة على الأقل، كما أنهم اجتياز دورة الخلية. والعيب الرئيسي هو تكلفة المتخصصة أجهزة الطرد المركزي، والدوار، والملحقات. ومع ذلك، القدرة على إعداد الخلايا أثري مركز التعليم المستمر في مراحل دورة الخلية المحددة سهلت إلى حد كبير البحوث دورة الخلية في الكائنات الحية من الخميرة إلى خلايا الثدييات9،10. وعلاوة على ذلك، يتم توسيع التقدم الذي أحرز مؤخرا يستخدم لفصل الخلايا من صحية مقابل الأنسجة السرطانية، والفصل بين أنواع الخلايا المختلفة في مخاليط غير متجانسة، وإلى إنتاج أنواع محددة من الخلايا للعلاج المناعي9.

وكان اهتمامنا الرئيسي في فهم إليه العمل لاستهداف عملاء (MTAs) مثل قلوانيات فينكا وتاكسانيس ميكروتوبولي. ويعتقد أن هذه الأدوية للعمل حصرا في الانقسام، حجب المغزل microtubule الدالة11،12، ولكن الأدلة الأخيرة تشير إلى أنها قد تستهدف أيضا الطور البيني ميكروتوبوليس13،14. نحن ذكرت مؤخرا أن خلايا سرطان الدم الليمفاوي الحاد الأولية (جميع) الخضوع للموت أما في المرحلة G1 أو في م المرحلة عندما تعامل مع vincristine و MTAs الأخرى في طريقة تعتمد على دورة الخلية15. القدرة على فصل كافة الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية بمركز التعليم المستمر بدور أساسي في التوصل إلى هذا الاستنتاج. في هذا المقال، وصف التفاصيل التقنية، وتقديم النصائح العملية لتطبيق مركز التعليم المستمر في إعداد المرحلة الابتدائية كافة الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,


ملاحظة: هذا البروتوكول وقد الأمثل الابتدائية ب-جميع الخلايا التي تتراوح في قطرها من حوالي 8 ميكرومتر (المرحلة G1) إلى 13 ميكرون (مراحل G2/M). وبالتالي، لا يجوز بسرعة محددة للطرد المركزي ومعدلات تدفق مضخة المطبقة على الخلايا التي تحتوي على نطاقات مختلفة الحجم. ومع ذلك، يمكن تقدير معلمات الوترياتيون المناسب باستخدام معادلة معدل الترسيب. تستزرع خلايا في متوسط خالية من المصل محددة ك وصف 16 في بكثافة أمثل من 1-3 × 10 6 خلايا/مل. وباستثناء مجموعة الكسور التي تجري عند 4 درجة مئوية باستخدام أنابيب تبريد الثلج وتجري جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة وأجهزة الطرد المركزي في 20 درجة مئوية بحد أقصى 24 درجة مئوية.

1-إعداد المخزن الوترييشن ومواد

  1. من أجل الحد من التثاقل من الخلايا، وإعداد مخزن مؤقت الوترييشن من هانك ' s متوازنة المحلول الملحي (حبس) مع الفينول الأحمر تستكمل مع 2% مصل بقرى الجنين ( FBS)، لحماية الخلايا من الإجهاد الميكانيكي أثناء عملية الوترييشن، و 1.6 غ/لتر من الملح ديبوتاسيوم حمض 2-نافثول-6,8-دسلفنك (التجمع الوطني الديمقراطي)، مما يجعل الخلية الخارجي اتهم سلبا ويقلل من التثاقل.
    1. إضافة 1.6 غرام من التجمع الوطني الديمقراطي إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    2. تحت ظروف معقمة، إضافة 35 مل حبس من زجاجة 1 لتر إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على التجمع الوطني الديمقراطي. دوامة الأنبوب حتى حل التجمع الوطني الديموقراطي-
    3. باستخدام فلتر 0.2 ميكرون، نقل التجمع المنحل في أنبوب مخروطي عقيمة 50 مل جديدة. ثم أضف التجمع الوطني الديموقراطي إلى 1 لتر المتبقية من حبس.
      4. وأخيراً، إضافة
    4. مل 21 FBS إلى هبس للحصول على تركيز نهائي 2% (v/v)-
      ملاحظة: المخزن المؤقت الوترياتيون يمكن إعدادها وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى تاريخ انتهاء الصلاحية على هبس أو حتى يكون هناك تغيير كبير في درجة الحموضة كما أشار اصفرار صبغ مؤشر.
  2. تسمية 50 مل أنابيب مخروطية الشكل لجمع الكسور حيث لا توجد أنابيب المسمى يغسل 1 و 2 (W1 و W2)، الكسور 1-20 (F1-F20)، ووقف.
    1. قبل chill هذه الأنابيب على الجليد قبل جمع الكسور.

2. الجمعية العامة "النظام الوترييشن"

  1. أولاً، تثبيت التجميع القوية في أجهزة الطرد المركزي حيث أنه يتم تغذية التيار خارج الدائرة عن طريق المنفذ الموجود على الجانب الأيسر. تأكد من مصباح فلاش القوية في الجزء الأمامي الدائرة حيث أنها سوف يصطف مع نافذة عرض عند إغلاق النابذة.
    1. تأمين الجمعية في مكان بتشديد أول اثنين من البراغي فيليبس رئيس في اثنين من الثقوب في الجزء العلوي من كل قوس وثم تشديد الاتجار في أسفل كل شريحة.
    2. توصيل سلك الطاقة بمنفذ الطاقة القوية في الجزء الخلفي من النابذة.
  2. المقبل، مجموعة الدوار إلى أسفل على لوحة الوصل محرك أقراص جهاز الطرد المركزي وتأمين مع وجع عرافة التعامل مع تي-
    ملاحظة: إذا لم تعد ضرورية في أجهزة الطرد المركزي لأغراض غير الوترييشن، الجمعية العامة القوية والدوار يمكن أن يوضع في أجهزة الطرد المركزي بين تشغيلات.
  3. مجرد تأمين الدوار، مكان التجميع الإفراج السريع الذي يحتوي على دائرة الوترييشن، التوازن العداد، وتناوب الجمعية الختم، ولوحة تصاعد إلى الدوار.
    1. دفع أسفل بالتساوي مع يد واحدة في قاعة الوترييشن واليد الأخرى على التوازن العداد حتى البراغي في الدوار المفاجئة في الثقوب على لوحة تصاعد.
    2. وأخيراً، توصيل كبل ترسيخ وضع الدبوس على جانب واحد من الكابل في الحفرة في الجمعية ختم الدورية وتأمين إيلي على الجانب الآخر من الكابل مع أحد البراغي فيليبس رئيس (المذكورة في 2.1.1) على القوس في س الجانب الأيسر و الدائرة.
  4. بعد ذلك، تجميع النظام التدفق باستخدام مضخة متغيرة سرعة وأنابيب لضخ المخزن المؤقت إلى الوترييشن الدائرة وتجمع المخزن المؤقت كما أنها تنبع من قاعة الوترييشن.
    1. إدراج أنابيب الإدخال حجم 16 قادمة من مضخة متغيرة السرعة عن طريق الميناء في الجزء العلوي الأيسر من الدائرة أجهزة الطرد المركزي حيث أن ذلك يدخل في الدائرة-
    2. إرفاق مناسب إلى نهاية خالية من أنابيب الإدخال وإدراج المناسب في حفرة الإدخال على جانب الجمعية ختم الدورية.
    3. إدراج حجم 16 إخراج الأنابيب من خلال المنفذ وإرفاقه بأنبوب نقل أعلى التناوب ختم الجمعية.
      ملاحظة: نظام تدفق يمكن أيضا تبقى مجمعة بين تشغيلات الوترييشن.
  5. وأخيراً، تشغيل أجهزة الطرد المركزي وتعيين المواصفات اللازمة للتجربة.
    1. تغيير الدوار معرف.
    2. إذا النابذة يتطلب مدخلاً وقت، تعيين لح 2، الذي أكثر من كاف لإتمام الوترياتيون تشغيل-
    3. تعيين درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية مع درجة الحرارة الحد أقصى من 24 درجة مئوية.
    4. تعيين تسريع ماكس والتباطؤ لبطء.
    5. وأخيراً، تعيين سرعة إلى 867 س زاي

3. فتيلة "النظام الوترياتيون"

  1. أولاً من أجل تعقيم النظام الوترياتيون، ووضع أنابيب الخزان في زجاجة بلاستيكية 500 مل تحتوي على التبييض 5% ثم ضع الأنبوب الناتج في زجاجة 1 لتر نفايات بلاستيكية فارغة.
    1. تشغيل المضخة وتعيين السرعة إلى 25 مل/دقيقة والسماح للتبييض 5% إلى التدفق على طول الطريق من خلال نظام الوترييشن حتى فإنه يتم ضخ الخروج من الأنبوب الناتج في زجاجة النفايات.
    2. تشغيل أجهزة الطرد المركزي والسماح لها بالتوصل إلى الحد الأقصى لتعيين سرعة (867 س ز) بغية الإفراج عن الفقاعات وباكبريسوري-
      3. وقف
    3. الطرد المركزي. بمجرد توقف الدوار بالتناوب، فتح الغطاء وفحص الدائرة لأي تسرب.
    4. إذا كان هناك أي تسرب، اسمحوا أن الحل التبييض التدفق من خلال نظام على الأقل 5 دقيقة
  2. المقبل، طرد النظام مع يعقم ماء التبييض يمكن أن يؤدي إلى تشكيل رواسب من المخزن المؤقت الوترياتيون الذي قد يؤدي إلى التثاقل الخلايا فضلا عن التسبب في ضرر للخلايا.
    1. مكان أنابيب الخزان في زجاجة 1 لتر من يعقم المياه والسماح بتدفق من خلال لمالا يقل عن 10 دقيقة
  3. بعد التنظيف بالماء، إدخال المخزن المؤقت الوترياتيون في النظام. استخدام زجاجة زجاج 150 مل الذي كان يعقم لإنشاء خزان للمخزن المؤقت الوترياتيون والخلايا.
    1. إضافة 100 مل من الوترياتيون المخزن المؤقت إلى الزجاجة ونقل أنابيب الخزان بزجاجة حيث يكون الأنبوب في أسفل جداً.
    2. ابدأ الطرد المركزي والسماح للمخزن المؤقت لتدفق من خلال نظام لطرد الماء.
    3. بمجرد زجاجة الخزان فارغ تقريبا وهو مسح المياه تماما خارج النظام، نقل إخراج الأنابيب من زجاجة النفايات إلى الخزان حيث أن المخزن المؤقت هو يجري إعادة تدويرها من خلال النظام-
  4. وأخيراً ضبط نافذة عرض بحيث يمكن أن ينظر في دائرة الوترياتيون في السرعة الحالية. مصباح
    1. الصحافة القوية السلطة زر في الخارج من أجهزة الطرد المركزي حيث أن يضيء المصباح. تشغيل ك الوترييشننوب أيضا في الخارج من أجهزة الطرد المركزي على طول الطريق إلى اليسار-
      2. دورة
    2. بينما يبحث من خلال نافذة عرض، ببطء مقبض الباب إلى اليمين حتى يأتي دائرة الوترييشن في الرأي وعلى ضوء القوية في الوقت المناسب مع تناوب الدوار.
      ملاحظة: يمكن أن يترك النظام الوترييشن في هذه الدولة حتى يتم هيأهم الخلايا.

4. إعداد "نموذج خلية"

  1. عدد الخلايا والكوة المتوسطة 300 إلى 400 مليون في النمو في العديد من أنابيب مخروطية 50 مل. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 1210 س ز للحد الأدنى 3
  2. Aspirate إيقاف نمو الخلايا وسائط الإعلام وريسوسبيند في 25 مل من المخزن المؤقت الوترياتيون من بيبيتينج صعودا وهبوطاً بلطف.
  3. من أجل الحد من الخلية التثاقل، قياس خلايا المرور مرتين من خلال 25 إبرة.
    1. باستخدام حقنه 10 مل رسم الخلايا، ثم إرفاق إبرة قياس 25 وتمرير الخلايا عن طريق إلى الداخل جدار أنبوب مخروطي العقيمة 50 مل. كرر هذه العملية حتى مرت كل 25 مل من خلال الإبرة.
    2. الحصول على جديدة الإبر والمحاقن، وتكرار هذه العملية أعلاه مرة واحدة.
      تنبيه: يجب وضع إبر المحاقن في حاويات الأدوات الحادة-
      ملاحظة: من الأهمية بمكان أن يتم الضغط الخلايا عن طريق الإبرة مباشرة قبل إدخالها إلى النظام الوترييشن للحفاظ على الخلية التثاقل إلى الحد أدنى-

5. إدخال "نموذج الخلية" في نظام الوترياتيون وجمع الكسور

  1. إدخال نموذج الخلية في النظام الوترياتيون بصب العينة الخلية في خزان الخزان الذي قد تبقى الوترياتيون المخزن المؤقت إعادة التدوير من خلال . اسمحوا
    1. الخلايا الدخول في النظام، والتوصل إلى توازن داخل قاعة الوترييشن-
      ملاحظة: سوف تستغرق هذه العملية حوالي 5 دقائق ويمكن تعقب التقدم بمشاهدة الخلايا كما أنها تدخل في الدائرة عبر نافذة عرض. للتأكد من كافة الخلايا الموجودة في الدائرة، تأخذ قطره من الوينت، وضع على شريحة زجاجية وعرض تحت مجهر. إذا كانت العينة خالية من خلايا سليمة، وهذا يؤكد الاحتفاظ بها في الدائرة-
  2. البدء في جمع الكسور حالما دخلت كافة الخلايا الموجودة في الدائرة وهناك خط حدود مميزة في الجزء أوسع من الدائرة التي الخلايا في التوازن.
    1. تبدأ بتحريك أنبوب إخراج للأنبوبة المخروطية 50 مل المسمى W1. جمع 50 مل من المخزن المؤقت الوترييشن لهذا الكسر، مع التأكد من إبقاء عين على خزان الخزان وتجديد مع المخزن المؤقت الوترييشن عند الضرورة.
      ملاحظة: للتأكد من أن كافة الخلايا إدخالها في النظام، تسمح في خزان الخزان لتصبح فارغة تقريبا قبل إعادة تعبئة الخزان في المرة الأولى. وبعد الملء الأول ليس من الضروري الانتظار للخزان لتصبح تقريبا فارغة. أيضا، لا تسمح من أي وقت مضى في خزان لتصبح فارغة كهذا سيخلق فقاعات والضغط مرة أخرى في النظام.
    2. مرة واحدة وقد تم جمع 50 مل ل W1، في نفس الوقت تغيير السرعة إلى 821 x ز وتحريك أنبوب إخراج للأنبوبة المخروطية المسمى W2 وجمع 50 مل أكثر بهذه السرعة.
      3. ما زالت
    3. المتغيرة السرعة وجمع الكسور كما هو مبين في الجدول 1. تأكد من أن هناك وسائل الإعلام في الخزان دبابة وإبقاء هذه الأنابيب المخروطية على الجليد في جميع الأوقات. وأخيراً، قم بضبط نافذة عرض بتحول مقبض الباب إلى اليمين ببطء كما يقلل من السرعة.
    4. مرة واحدة جميع الكسور 20 قد جمعت ووقف الطرد المركزي وجمع 50 مل في أنبوب مخروطي يسمى STOP.

6. فلاشينغ من "النظام الوترييشن"

  1. بعد أجهزة الطرد المركزي توقفت تماما طرد النظام عن طريق وضع أنبوب خزان في زجاجة 1 لتر من يعقم ماء وأنبوب الإنتاج مرة أخرى في زجاجة النفايات.
    1. تشغيل سرعة ضخ ما يصل إلى 50 مل/دقيقة، والسماح للتشغيل من خلال النظام حتى أنه هو استنزاف المياه-
  2. تشغيل إيقاف المضخة، إزالة خرطوم الإدخال والإخراج من الجمعية الإفراج السريع، وسحب الدبوس من كبل ترسيخ.
    1. إزالة التجميع الإفراج السريع من الدوار.
      ملاحظة: اعتماداً على ما أجهزة الطرد المركزي ستستخدم للنظام الوترياتيون يمكن الآن أن يترك كما هو. وبخلاف ذلك، الجمعية كلها يمكن أن تؤخذ الترتيب العكسي كما هو موضح أعلاه. ويمكن إزالتها من الجمعية الإفراج السريع الدائرة الوترياتيون وتنظيفها بين تشغيل استخدام حمام الماء بالموجات فوق الصوتية. يؤدي هذا إلى إزالة الحطام والملوثات من الجدار الدائرة مما قد يؤثر سلبا على تشغيل أحدث.

7. تحليل الكسور وجمع G1 أو G2/M برك.

ملاحظة: من أجل إثبات فعالية الوترييشن، ويتم تحليل كل جزء لعدد الخلايا والخلية قطرها، ومحتوى الحمض النووي، وهي إنشاء تجمعات من الخلايا في مراحل G1 أو G2/M لتحليلات إيمونوبلوت، كما هو موضح في النتائج ممثلة. هذا المقطع البروتوكول سوف تصف كيفية إنشاء هذه المجمعات، وإعدادهم للاستخدام التجريبي.

  1. تدور كل جزء في 2000 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و aspirate إيقاف المخزن المؤقت الوترييشن.
  2. الكسور الجمع معا من أجل الحصول على بركة مرحلة G1 وبركة مراحل G2/M.
    1. G1 المرحلة تجمع، ريسوسبيند الكسور التي جمعت في نطاق السرعة 788 x ز إلى 661 x ز (F1--F5) في مجموعة 1 مل من المحلول الملحي العازلة الفوسفات (PBS) ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. لتجمع مراحل G2/M، الكسور التي جمعت في نطاق السرعة 387 × g و g x 333 (F17-F20) ريسوسبيند-
    2. تدور أسفل الخلايا في 2000 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و aspirate قبالة PBS.
  3. ريسوسبيند الخلايا في 10 مل وسائط النمو واتخاذ عدد خلية.
  4. تأخذ قاسمة من كل تجمع تحليل الحمض النووي المحتوى عن طريق تلطيخ يوديد propidium وتدفق سيتوميتريك تحليل 15-
    ملاحظة: يمكن استخدام الجزء المتبقي من كل تجمع لإجراء المزيد من التجارب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأولية كافة الخلايا (3-4 × 108) تعرضوا للطرد المركزي الوترياتيون وجمعت في اثنين يغسل الكسور والكسور الرئيسية العشرين، كما هو موضح في البروتوكول. ويبين الجدول 1 بيانات تمثيلية حيث يتم عرض إجمالي عدد الخلايا في كل جزء، فضلا عن سرعة الدوار المقابلة. وعموما كان العائد عادة ما يزيد على 80%. قياس القطر الخلية في كسور الفردية أكدت أن قطر الخلية زادت مع تقدم الوترياتيون (الشكل 2). هذه النتائج تمثل المتوسطات لاثنين من قرارات مستقلة وتعكس درجة عالية من إمكا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قمنا بوصف طريقة للحصول على الابتدائية كافة الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية باستخدام مركز التعليم المستمر. تحت الظروف المثلى سكان أساسا نقية من الخلايا في المرحلة G1 وعدد سكانها مخصب بدرجة عالية من الخلايا في مراحل G2/M يمكن سهولة الحصول عليها في الغلة ممتازة، وخلايا التخصيب في مرحلة ثانية يمكن أيضا الحصول عليها إذا رغبت في ذلك. تم التوصل إلى النتائج المعروضة هنا استخدام الابتدائية واحد تم الحصول على جميع الثقافة (على وجه التحديد، جميع-5)، وأساساً نتائج متطابقة مع ثقافة مستقلة، جميع-215....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كوثري Anisha حاليا في إدارة الخلية والبيولوجيا الجزيئية في مستشفى أبحاث سانت جود للأطفال.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل CA109821 المعاهد الوطنية للصحة (إلى TCC). ونحن نشكر بيكمان كولتر لسخاء توفير الأموال اللازمة لتغطية تكاليف النشر والمساعدة التقنية في إنشاء وتشغيل نظام الوترياتيون. ونحن نشكر الدكتور فريد فالكينبورج لتوفير الابتدائية الأولى جميع الثقافات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول الملح المتوازن من هانكسلونزا10-508Qزجاجة 1 لتر
مصل الأبقار الفيتال بلسأطلس بيولوجيكسFP-0500-Aزجاجة 500 مل
2-نابثول -6،8-حمض ثنائي الكبرفونيك ملح ثنائي البوتاسيومأكروس أورجانكس212-672-4100 جرام مسحوق
50 مل أنابيب كونسيالدينفيل ساينتفيكC1062-P500 / علبة
غشاء PES 0.22 ومايكرو. وحدة الفلتر mMilliporeSLGP033RB250 / حزمة
Avanti J-26S XPI ث / Elut. غير IVD - 50/60 هرتز ، 200/208 / 240 فولتبيكمان كولترB14544متوافق مع نظام الإزالة
طقم دوار المزاعد JE 5.0 مجموعة الدواربيكمان كولتر356900التي تتضمن الدوار ، مفتاح ربط سداسي بمقبض T ، مجموعة التحرير السريع (بدون غرفة التصفية) ، كابل التثبيت ، وغرفة التجميع
القوية ، قياسية ، 4 مل ، "A"بيكمانكولتر 356943غرفة الإزالة القياسية 
رأس مضخة Masterflex L / S سهل التحميلCole-ParmerEW-07518-10
Masterflex L / S محرك متغير السرعةCole-ParmerEW-07528-10
أنابيب مضخة سيليكون معالج بالبلاتين Masterflex BioPharm ، L / S 16Cole-ParmerEW-96420-16
25 جم × 1.5 إبرة انزلاقيةدقيقة BD305127معقمة ، إبر تستخدم مرة واحدة
10 مل Luer-Lok حقنةBD309604محاقن معقمة ذات استخدام
واحد Vi-Cell XRBeckman Coulter383556
PI / RNase تلطيخ عازلةBD Pharmingen550825بروبيديوم يوديد / RNase تلطيخ عازلة
cyclin B1 (GNS1) فأر أحادي النسيلة الجسم المضاد IgGسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-245
cyclin D1 (DCS-6) الفأر أحادي النسيلة IgG الجسم المضادسانتا Cruz Biotechnologysc-20044
P-Rb (S807 / 811) (D20B12) XPR أرنب أحادي النسيلة الأجسام المضادةتقنية إشارات الخلية8516s
GAPDH (14C10) الأرنب أحادي النسيلة الأجسام المضادة أحاديةتقنية إشارات الخلية2118s
الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) -HRP المترافقBioRad170-6516
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) -HRP مترافقBioRad170-6515
جهاز طرد مركزي النسيلة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
  2. Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
  3. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
  4. Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
  5. Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
  6. Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
  7. Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
  8. Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
  9. Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
  10. Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
  11. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
  12. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
  13. Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
  14. Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
  15. Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
  16. Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
  17. Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
  18. Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
  19. Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
  20. Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
  21. Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

G1 G2 M

مقالات ذات صلة