إعداد الخلايا الأولية من سرطان الدم الليمفاوي الحاد في مراحل مختلفة من دورة الخلية بالطرد المركزي الوترياتيون

ملخص

ويصف هذا البروتوكول استعمال الوترييشن الطرد المركزي لفصل الخلايا الأولية من سرطان الدم الليمفاوي الحاد في مراحل مختلفة من دورة الخلية.

الملخص

القدرة على مزامنة الخلايا تم المركزية لتعزيز فهمنا لتنظيم دورة الخلية. وتشمل التقنيات الشائعة المستخدمة المصل الحرمان؛ المواد الكيميائية التي تعتقل الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية؛ أو استخدام الانقسامية اهتزاز-إيقاف الذي يستغل التزامهم خفض. ومع ذلك، كل هذه لها عيوب. على سبيل المثال، يعمل المصل المجاعة جيدا للخلايا الطبيعية ولكنها أقل جيدا للخلايا السرطانية مع نقاط التفتيش دورة الخلية الشبهة بسبب فقدان القامع التنشيط أو الورم السرطاني. وبالمثل، يمكن السكان خلية المعالجة كيميائيا المرفأ الأضرار الناجمة عن المخدرات وإظهار التعديلات المتصلة بالإجهاد. هو أسلوب الذي تلتف هذه المشاكل كونتيرفلوو الوترياتيون الطرد المركزي (CCE)، حيث يتعرض الخلايا إلى قوتين متعارضتين وقوة الطرد المركزي وسرعة السوائل، مما يؤدي إلى انفصال الخلايا استناداً إلى حجم وكثافة. نظراً لتوسيع نطاق الخلايا المضي قدما من خلال الدورة عادة، يمكن استخدام مركز التعليم المستمر لفصل الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية. هنا نقوم بتطبيق هذا الأسلوب للخلايا الأولية من سرطان الدم الليمفاوي الحاد. تحت الظروف المثلى، يمكن الحصول سكان أساسا نقية من الخلايا في المرحلة G1 وعدد سكانها مخصب بدرجة عالية من الخلايا في مراحل G2/M في الغلة ممتازة. هؤلاء السكان الخلية هي مناسبة بشكل مثالي لدراسة دورة الخلية تعتمد على آليات عمل المخدرات السرطان والتطبيقات الأخرى. ونحن أيضا إظهار كيف تعديلات على إجراءات قياسية يمكن أن يسفر عن أداء دون المستوى الأمثل ومناقشة أوجه قصور الأسلوب. وينبغي تيسير المنهجية التفصيلية المقدمة التطبيق واستكشاف هذه التقنية إلى أنواع أخرى من الخلايا.

المقدمة

الخلايا المستزرعة عادة تنمو بشكل غير متزامن وخلايا فردية موجودة في مختلف مراحل دورة الخلية. معرض متزامن بطبيعة الحال خلية دورات بعض الكائنات الحية أو يمكن أن تكون متزامنة بالمنبهات الفسيولوجية المحددة. على سبيل المثال، تقسيم الأنوية داخل plasmodia العملاقة من الوحل العفن بوليسيفالوم فيساروم في أزياء متزامنة عالية¹، وخلايا الطحالب الخضراء كوادريكودا ديسموديسموس يمكن أن تكون متزامنة بالتناوب الضوء والظلام ²من فترات. في حين تقدم مثل هذه الكائنات سمات تجريبية فريدة من نوعها، أنها نموذج غير كاف تعقيدات خلايا الثدييات. القدرة على مزامنة مصطنع السكان خلية الثدييات قد المركزية لتعزيز فهمنا لتنظيم دورة الخلية وا....

البروتوكول

ملاحظة: هذا البروتوكول وقد الأمثل الابتدائية ب-جميع الخلايا التي تتراوح في قطرها من حوالي 8 ميكرومتر (المرحلة G1) إلى 13 ميكرون (مراحل G2/M). وبالتالي، لا يجوز بسرعة محددة للطرد المركزي ومعدلات تدفق مضخة المطبقة على الخلايا التي تحتوي على نطاقات مختلفة الحجم. ومع ذلك، يمكن تقدير معلمات الوترياتيون المناسب باستخدام معادلة معدل الترسيب. تستزرع خلايا في متوسط خالية من المصل محددة ك وصف ¹⁶ في بكثافة أمثل من 1-3 × 10 ⁶ خلايا/مل. وباستثناء مجموعة الكسور التي تجري عند 4 درجة مئوية باستخدام أنابيب تبريد الثلج وتجري جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة وأجهزة الطرد المركزي في 20 درجة مئوية بحد أقصى 24 درجة مئوية.

النتائج

الأولية كافة الخلايا (3-4 × 10⁸) تعرضوا للطرد المركزي الوترياتيون وجمعت في اثنين يغسل الكسور والكسور الرئيسية العشرين، كما هو موضح في البروتوكول. ويبين الجدول 1 بيانات تمثيلية حيث يتم عرض إجمالي عدد الخلايا في كل جزء، فضلا عن سرعة الدوار المقابلة. وعموما كان العائد عادة ما يزيد على 80%. قياس القطر الخلية في كسور الفردية أكدت أن قطر الخلية زادت مع تقدم الوترياتيون (الشكل 2). هذه النتائج تمثل المتوسطات لاثنين من قرارات مستقلة وتعكس درجة عالية من إمكا.......

المناقشة

لقد قمنا بوصف طريقة للحصول على الابتدائية كافة الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية باستخدام مركز التعليم المستمر. تحت الظروف المثلى سكان أساسا نقية من الخلايا في المرحلة G1 وعدد سكانها مخصب بدرجة عالية من الخلايا في مراحل G2/M يمكن سهولة الحصول عليها في الغلة ممتازة، وخلايا التخصيب في مرحلة ثانية يمكن أيضا الحصول عليها إذا رغبت في ذلك. تم التوصل إلى النتائج المعروضة هنا استخدام الابتدائية واحد تم الحصول على جميع الثقافة (على وجه التحديد، جميع-5)، وأساساً نتائج متطابقة مع ثقافة مستقلة، جميع-2¹⁵........

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
محلول الملح المتوازن من هانكس	لونزا	10-508Q	زجاجة 1 لتر
مصل الأبقار الفيتال بلس	أطلس بيولوجيكس	FP-0500-A	زجاجة 500 مل
2-نابثول -6،8-حمض ثنائي الكبرفونيك ملح ثنائي البوتاسيوم	أكروس أورجانكس	212-672-4	100 جرام مسحوق
50 مل أنابيب كونسيال	دينفيل ساينتفيك	C1062-P	500 / علبة
غشاء PES 0.22 ومايكرو. وحدة الفلتر m	Millipore	SLGP033RB	250 / حزمة
Avanti J-26S XPI ث / Elut. غير IVD - 50/60 هرتز ، 200/208 / 240 فولت	بيكمان كولتر	B14544	متوافق مع نظام الإزالة
طقم دوار المزاعد JE 5.0 مجموعة الدوار	بيكمان كولتر	356900	التي تتضمن الدوار ، مفتاح ربط سداسي بمقبض T ، مجموعة التحرير السريع (بدون غرفة التصفية) ، كابل التثبيت ، وغرفة التجميع
القوية ، قياسية ، 4 مل ، "A"	بيكمان	كولتر 356943	غرفة الإزالة القياسية
رأس مضخة Masterflex L / S سهل التحميل	Cole-Parmer	EW-07518-10
Masterflex L / S محرك متغير السرعة	Cole-Parmer	EW-07528-10
أنابيب مضخة سيليكون معالج بالبلاتين Masterflex BioPharm ، L / S 16	Cole-Parmer	EW-96420-16
25 جم × 1.5 إبرة انزلاقية	دقيقة BD	305127	معقمة ، إبر تستخدم مرة واحدة
10 مل Luer-Lok حقنة	BD	309604	محاقن معقمة ذات استخدام
واحد Vi-Cell XR	Beckman Coulter	383556
PI / RNase تلطيخ عازلة	BD Pharmingen	550825	بروبيديوم يوديد / RNase تلطيخ عازلة
cyclin B1 (GNS1) فأر أحادي النسيلة الجسم المضاد IgG	سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية	sc-245
cyclin D1 (DCS-6) الفأر أحادي النسيلة IgG الجسم المضاد	سانتا Cruz Biotechnology	sc-20044
P-Rb (S807 / 811) (D20B12) XPR أرنب أحادي النسيلة الأجسام المضادة	تقنية إشارات الخلية	8516s
GAPDH (14C10) الأرنب أحادي النسيلة الأجسام المضادة أحادية	تقنية إشارات الخلية	2118s
الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) -HRP المترافق	BioRad	170-6516
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) -HRP مترافق	BioRad	170-6515

جهاز طرد مركزي النسيلة