مقالة منهجية

تحديد معدلات تسوس نسخة على نطاق الجينوم في الخلايا الليفية البشرية المتكاثرة وهادئة

DOI:

10.3791/56423

⸱

يناير 2, 2018

 ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, 3Molecular Biology Institute Interdepartmental Program, University of California, Los Angeles

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف لنا بروتوكول لتكاثر توليد وهادئة الليفية الجلدية البشرية الأولية، رصد معدلات تسوس نسخة، وتحديد الجينات الأثران المتحللة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التتابع هو حالة مؤقتة، وعكسها فيها الخلايا توقف انقسام الخلية، ولكن الاحتفاظ بقدرة على الانتشار. أظهرت دراسات متعددة، بما في ذلك بلدنا، أن التتابع يرتبط بالتغيرات الواسعة النطاق في التعبير الجيني. بعض هذه التغييرات التي تحدث من خلال أحداث تغييرات في مستوى أو النشاط من العوامل المرتبطة بانتشار النسخ، مثل E2F وحركة. لقد أظهرنا أن تسوس مرناً يمكن أن يسهم أيضا في التغييرات في التعبير الجيني بين الخلايا المتكاثرة وهادئة. في هذا البروتوكول، يمكننا وصف الإجراء الخاص بإنشاء ثقافات الليفية القلفة الجلدي البشرية المتكاثرة وهادئة. ثم يصف لنا إجراءات تمنع النسخ الجديدة في الخلايا المتكاثرة وهادئة مع والاكيتنوميسين د (أكتد). العلاج ActD يمثل نهجاً واضحة واستنساخه إلى الناي بالنسخ الجديدة من تسوس نسخة. عيب أكتد في المعاملة أن مسار الوقت يجب أن تكون محدودة بفترة زمنية قصيرة لأن أكتد يؤثر على بقاء الخلية. يتم رصد مستويات نسخة على مر الزمن لتحديد معدلات تسوس نسخة. يسمح هذا الإجراء لتحديد الجينات و isoforms الذي يحمل تسوس التفاضلية في تكاثر مقابل الليفية هادئة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مستويات الدولة ثابت النصوص تعكس مساهمة توليف محاضر والانحلال نسخة. وينظم واضمحلال نص منسق إليه هامة للتحكم في العمليات البيولوجية1،2،،من34. على سبيل المثال، قد ثبت معدلات تسوس نسخة للمساهمة في سلسلة الأحداث التي أعقبت التنشيط الزمانية ب عامل نخر الورم سيتوكين التحريضية5.

وقد أظهرنا سابقا أن الانتقال بين الانتشار والتتابع في الخلايا الليفية البشرية الأساسي يرتبط بالتغيرات في مستويات العديد من الجينات6نسخة. بعض هذه التغييرات تعكس الاختلافات في نشاط عوامل النسخ بين هاتين الدولتين.

التغيرات في معدل الانحلال على نسخة يمكن أن يسهم أيضا في التغييرات في مستوى التعبير نسخة في دولتين مختلفتين هما7،8. استناداً إلى نتائج الدراسة السابقة أن الانتقال بين الانتشار والتتابع يرتبط ارتباطاً بالتغيرات في مستويات متعددة ميكرورناس9، سألنا عما إذا كانت هناك أيضا مساهمة من تسوس نسخة التفاضلية في التغيرات التي طرأت على التعبير الجيني في تكاثر مقابل الليفية هادئة.

من أجل مراقبة استقرار نسخة، عقدنا العزم معدل انحلال نصوص على نطاق الجينوم في تكاثر مقابل خلايا هادئة. لتحقيق هذا الهدف، علينا رصد معدلات تسوس في تكاثر مقابل الليفية هادئة بالأخذ المانع للنسخ الجديدة ورصد معدل الذي اختفى النصوص الفردية على مر الزمن. وميزة هذا النهج هو أنه، مقارنة بالأساليب التي ترصد عموما التعبير الجيني، ببساطة عن طريق تثبيط توليف نسخة جديدة، سوف نكون قادرين على تحديد معدل الانحلال لهذه النصوص بشكل منفصل عن المعدل الذي هم نسخها.

العلاج ActD تمنع النسخ الجديدة وتحديد معدلات تسوس نسخة طبق بنجاح في دراسات سابقة متعددة. وقد استخدمت ActD تشريح أهمية استقرار الجيش الملكي النيبالي في التغييرات في نسخة الوفرة التي تنجم عن المعاملة مع السيتوكينات الالتهابية برو5. وقد استخدمت أيضا نهجاً مماثلاً تشريح الفروق في معدل تسوس نسخة في تكاثر مقابل المتباينة C2C12 الخلايا كما أنها تعتمد على النمط الظاهري العضلات متمايزة10. وكمثال آخر، كما تم اكتشاف عالمي مرناً التنصيف في pluripotent والخلايا الجذعية الجنينية الماوس المختلفة11. في هذه الأمثلة، أظهرت مرناً تسوس هامة لتنظيم محضر وفرة وانتقال الخلايا إلى خلية مختلف الدول.

تطبيق الأساليب المذكورة أدناه، اكتشفنا التغيرات في معدلات تسوس نسخة في ما يقرب من 500 الجينات عند مقارنة الليفية في الدول المتكاثرة وهادئة12. على وجه الخصوص، فقد اكتشفنا أن الأهداف التي ميكرورنا مير-29، ودوونريجولاتيد في خلايا هادئة، استقرت عند انتقال الخلايا بالتتابع. يصف لنا هنا المنهجية التي نحن المستخدمة في تحديد معدلات تسوس في الخلايا المتكاثرة وهادئة. هذه المنهجية مفيدة لمقارنة العالمية معدلات تسوس مرناً في اثنين متميزة لكن ظروف مماثلة عند التماس معلومات عن سرعة المتحللة الجينات. ويمكن استخدامه أيضا لمعالجة مسائل أخرى مثل التأثير شروط ثقافة الخلية على اضمحلال نص، على سبيل المثال، في اثنين من الأبعاد مقابل الثقافات الأبعاد الثلاثة. معدلات تسوس يمكن أن تكون مصممة على نطاق الجينوم مع أساليب مثل [ميكروارس] أو ما يليها الحمض النووي الريبي "بدلاً من ذلك"، قبكر في الوقت الحقيقي أو النشاف شمال يمكن استخدامها لتحديد معدلات تسوس على أساس الجينات بالجينات أو إيسوفورم من إيسوفورم. ثم يمكن استخدام هذه المعدلات لحساب نصف عمر كل الجينات رصد وتحديد الجينات مع اضمحلال معدلات مختلفة في هذين الشرطين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووافق جميع التجارب التي وصفت "مجالس المراجعة المؤسسية" في جامعة برنستون، وجامعة كاليفورنيا في لوس أنجليس.

1. إعداد الليفية المتكاثرة وتحول دون اتصال لوقت أكتد بالطبع

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول تيميكورسي مع تيميبوينتس الأربعة. يمكن جمع ثلاث عينات مستقلة بيولوجيا كل تيميبوينت بجمع لوحات زراعة الأنسجة المختلفة في تجربة واحدة، أو يمكن أن تتكرر هذه التجربة عدة مرات مع مختلف الثقافات من الخلايا. في تجربتنا، يوفر طبق استنبات الأنسجة 10 سم (قطر) واحد (لوحة واحدة) الحمض النووي الريبي كاف للتحليل. إذا لزم الأمر، يمكن تجميع أطباق زراعة الأنسجة متعددة لكل عينة لزيادة عدد الخلايا في كل تيميبوينت. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤديها نفس التجربة مع الليفية المعزولة من مختلف الأفراد كما يتطابق البيولوجية مستقلة حقاً.

  1. إنشاء ثقافات المتكاثرة وهادئة للخلايا لتحليل تسوس نسخة. لتكاثر الخلايا، وتقسيم الخلايا كل ثلاثة أيام بينما الخلايا تحول دون الاتصال أصبحت تحول دون الاتصال.
    1. للخلايا التي تحول دون الاتصال، تغيير في المتوسط كل يومين لمدة 7 أيام. تقسيم الخلايا المتكاثرة 2 أيام قبل الليفية تحول دون الاتصال مستعدون لجمع. مثال لمخطط الثقافة خلية يرد في الشكل 1. توفير الخطوات المتبقية في هذا المقطع بروتوكول مفصل لإنشاء وتقسيم الخلايا.
  2. عزل الخلايا الليفية الجلدية الأولية من جلد الأطفال حديثي الولادة وفقا للبروتوكولات المعمول بها13. مرور الليفية لضمان مجموعة متجانسة من سكان.
    ملاحظة: يمكن تجميد الخلايا الليفية ومذاب، إذا لزم الأمر.
  3. ذوبان الجليد أو ريبلاتي الليفية، إذا لزم الأمر. تنمو الخلايا الليفية في دميم مع المصل 10% تحت ظروف معقمة في حاضنة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية و 5% CO2. تستخدم الخلايا الليفية التي كانت تزرع لأقل من 10 مقاطع. يجب أن تكون الخلايا الليفية < روافد 80% اليوم من تقسيم الخلايا لجعل السكان المتكاثرة وهادئة.
  4. لتقسيم طبق استنبات الأنسجة إلى لوحات متعددة، بريوارم برنامج تلفزيوني، التربسين، والمتوسطة مع المصل في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  5. نضح أو استخدام بيبيت لإزالة المتوسطة من كل لوحة زراعة الأنسجة بالخلايا تكون ريبلاتيد.
  6. بيبيت PBS الحارة على كل لوح (10 مل من محلول للوحة 150 مم، 5 مل من محلول للوحة 100 مم، 2 مل لبئر صفيحة جيدا 6)، و 1 مل لبئر 12 لوحة جيدا.
  7. أسبيراتي أو بيبيت لإزالة برنامج تلفزيوني من كل لوحة زراعة الأنسجة.
  8. بلطف بيبيت 1 × التربسين-يدتا على كل لوح (8 مل من محلول للوحة 150 مم، 3 مل من محلول للوحة 100 مم، 2 مل لبئر صفيحة جيدا 6، ومل 1 لبئر 12 لوحة جيدا).
    ملاحظة: جعل 1 x التربسين-يدتا بتمييع العقيمة 10 x يدتا التربسين في برنامج تلفزيوني العقيمة. ينبغي أن يكون الحل النهائي x 1 0.05% يدتا التربسين و 0.02 في المائة.
  9. احتضان التربسين مع خلايا لمدة 5 دقائق.
  10. اضغط برفق لوحة لإزاحة الخلايا من اللوحة.
  11. بيبيت ريسوسبيند الخلايا في تعليق خلية مفردة.
  12. نقل الخلايا في حل التربسين لأنبوب مخروطي الشكل يحتوي على نفس الحجم من دميم مع 10% مصل (8 مل من محلول للوحة 150 مم، 3 مل من محلول للوحة 100 مم، 2 مل لبئر صفيحة جيدا 6 ، و 1 مل لبئر 12 لوحة جيدا).
  13. تدور أسفل الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 1,000 س ز لإزالة التربسين.
  14. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في وحدة تخزين مناسبة المتوسطة والعد مع هيماسيتوميتير لتحديد تركيز الخلية.
  15. والبذور 5 × 105 خلايا كل 100 مم لوح زراعة الأنسجة لتكاثر الخلايا تحول دون الاتصال.
  16. باستخدام هذا الأسلوب، إنشاء العينات المنتشرة وتحول دون الاتصال اللازمة للتحليل (الشكل 1).

2-أكتد وقت الدورة

  1. ريسوسبيند أكتد بتركيز 1 ملغ/مل (ل 1 ملغ من أكتد، استخدام ميليلتر 950 من PBS العقيمة و 50 ميليلتر من العقيمة [دمس]) مخزون.
    ملاحظة: الحلول الأرصدة المجمدة من أكتد ينبغي أن يكون ثابتاً لمدة شهر في-20 درجة مئوية. ينبغي تجاهل الحلول تمييع وعدم تخزينها لاستخدامها مرة أخرى.
  2. إضافة أكتد إلى حجم متوسط بريوارميد المناسبة للثقافة البيولوجية خلية تكرار جميع اللوحات التي تم إعدادها ل 0، 120 و 240 و 480 دقيقة تيميبوينتس (الشكل 2). إضافة أكتد بتركيز 15 ميكروغرام كل مل متوسطة. مزيج جيد ونضح قبالة المتوسط القديمة، وإضافة المحتوية على أكتد المتوسطة للخلايا.
    1. بالنسبة لأسهم 1 ملغ/مل، إضافة 15 ميليلتر ActD لكل مل من المتوسطة، مثلاً، عن 10 مل متوسطة للوحة 100 مم، إضافة 150 ميليلتر ActD.
  3. لجمع العينة تيميبوينت صفر، نضح بلطف بعيداً عن أكتد المتوسطة، وبيبيت بريوارميد برنامج تلفزيوني على الخلايا. بيبيت 10 مل من محلول للوحة 150 مم، 5 مل من محلول للوحة 100 مم، 2 مل لبئر صفيحة جيدا 6، ومل 1 لبئر 12 لوحة جيدا.
  4. نضح بلطف أو بيبيت إيقاف برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات التي تنطوي على عزل الحمض النووي الريبي مع المياه خالية من رناسي وأنابيب ميكروسينتريفوجي رناسي خالية وخالية من رناسي الماصات. ينبغي ارتداء القفازات وتغيرت كثيرا عند العمل مع الجيش الملكي النيبالي.
  5. إضافة الفينول-غوانيدين إيسوثيوسياناتي الحل (1 مل/10-سم لوحة، مع 4 × 105 إلى خلايا 4 × 107 ) مباشرة إلى لوحة زراعة الأنسجة.
    ملاحظة: غوانيدين الفينول إيسوثيوسياناتي الحل هو حل أحادي الطور الذي يحافظ على نوعية الجيش الملكي النيبالي بينما ليسينج الخلايا وفصل الجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي والبروتين من بعضها البعض.
    تنبيه: إيسوثيوسياناتي الفينول وغوانيدين المسببة للتآكل. استخدام الحماية المناسبة.
  6. بيبيت الفينول-غوانيدين isothiocyanate الحل-خلية خليط صعودا وهبوطاً عدة مرات لجعل خليط متجانس.
    ملاحظة: يمكن تخزين غوانيدين الفينول isothiocyanate الحل ليساتي في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو في-20 درجة مئوية لتصل إلى سنة.
  7. جمع كل نقطة الوقت بعد اجتاز مقدار الوقت المناسب باستخدام الطريقة الموضحة في الخطوات 2، 3-2.6.

3-عزل الجيش الملكي النيبالي إجمالي من الفينول-غوانيدين Isothiocyanate الحل ليستي

  1. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لضمان حل كامل من الجيش الملكي النيبالي-البروتين المجمعات.
    ملاحظة: يمكن إجراء خطوات بروتوكول حل isothiocyanate غوانيدين الفينول في درجة حرارة الغرفة إلا إذا ذكر خلاف ذلك.
  2. إدخال النصوص سبايك في عنصر تحكم يمكن الكشف عنها مع المنهجية المستخدمة.
إدخال عناصر التحكم هذه في كل عينة في كمية معروفة وتركيز.
ملاحظة: الخارجية الجيش الملكي النيبالي التحكم كونسورتيوم (اركك) سبايك في مراقبة ميكس14 قد صممت خصيصا كعنصر تحكم سبايك لما يليها الحمض النووي الريبي يمكن استخدامه أيضا للبقع الشمالية أو qPCR في الوقت الحقيقي. سبايك في الضوابط المصممة خصيصا للتكنولوجيات ميكرواري أيضا (انظر الجدول للمواد).
  • نقل الخليط الحل isothiocyanate غوانيدين الفينول إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 2.0 مع ماصة. إضافة 0.2 مل كلوروفورم إلى خليط غوانيدين الفينول إيسوثيوسياناتي حل لكل 1 مل من محلول isothiocyanate غوانيدين الفينول المستخدم (مثلاً، إضافة كلوروفورم 0.3 مل إلى 1.5 مل غوانيدين الفينول isothiocyanate حل الخليط).
  • يهز أنبوب ميكروسينتريفوجي بقوة لمدة 15 ق واحتضان ثم خليط كلوروفورم-الفينول-غوانيدين إيسوثيوسياناتي في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
  • تدور العينات في س 12,000 ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بعد وتدور الأولى، ينبغي فصل العينة إلى طبقات 3-طبقة عضوية أحمر في الجزء السفلي، ومن الطور البيني الأبيض/الوردي في الوسط، وطبقة مائية واضحة في الجزء العلوي (الشكل 3).
  • نقل الطبقة المائية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 2.0 جديدة باستخدام ميكروبيبيتي.
    ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم الإخلال الطور البيني خلال هذه العملية. فلا بأس ترك بعض الكسر مائي. فمن الأفضل ترك بعض الكسر مائي مما تشمل أيضا بعض طبقات الطور البيني، كما بما في ذلك الطور البيني أن تلوث طبقة الجيش الملكي النيبالي مع الحمض النووي. الطبقة المائية سيكون حوالي نصف حجم الأولية، حتى حوالي 0.9 مل إذا كان المخلوط الحل/كلوروفورم isothiocyanate غوانيدين الفينول 1.8 مل.
  • تجاهل في الطور البيني والكسور العضوية.
  • إضافة وحدة تخزين متساوية من 2-بروبانول للكسر مائي وعكس الأنبوب 10 مرات. أضف تصل إلى 1 ميليلتر من 20 ملغ/مل من محلول مائي من الجليكوجين الواحدة 20 ميكروليتر من عينة، خاصة إذا كان العائد المتوقع أن تكون منخفضة لأن جمعت 10 أقل من6 خلايا.
    ملاحظة: هذا سوف ينتج بيليه الصلبة الكثيفة، والتي من السهل رصد بعد تدور الخطوات التي تتبع.
  • احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  • تدور العينات في س 12,000 ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. يكفل، في نهاية هذا الدوران، والجيش الملكي النيبالي قد عجلت بتشكيل بيليه أبيض في الجزء السفلي من الأنبوب.
  • مع ماصة، إزالة وتجاهل المادة طافية أخذ الرعاية الخاصة لا الإزعاج بيليه رنا الأبيض.
    ملاحظة: يمكن استخدام تلميح بيبيت فضفاضة عقد في متناول اليد لإزالة الزائدة الإيثانول. إذا كان بيليه الجيش الملكي النيبالي بالانزعاج، ولكن ليست مهملة، يمكن تكرار الدوران المحقق وإزالة المادة طافية مرة أخرى. تجنب إهمال بيليه كما سيتطلب هذا المحقق لتكرار الإجراء بأكمله.
  • تعد حلاً للمياه خالية من نوكلاس الإيثانول و 25% 75%. أضف 1 مل إيثانول 75% في 1 مل من الفينول-غوانيدين isothiocyanate الحل كاشف لغسل بيليه.
  • تدور العينات في س 12,000 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
  • بعد إزالة معظم المادة طافية، استخدم بيبيت لإزالة الإيثانول قدر ممكن، في حين لا يزال مع الحرص على عدم تعكير بيليه.
    ملاحظة: بيليه الجيش الملكي النيبالي هو أقل ضغط على هذه الخطوة ويميل إلى التحرك. أن تكون أكثر حذراً عند التعامل مع بيليه في هذه المرحلة لتجنب فقدان الجيش الملكي النيبالي.
  • تدور عينات 12,000 x ز لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بيليه جميع الإيثانول الزائدة.
  • إزالة جميع الإيثانول الزائدة من الأنبوب باستخدام ميكروبيبيتي مع الحرص على عدم إزعاج بيليه.
  • السماح للجيش الملكي النيبالي بيليه الهواء الجاف لمدة 5 دقائق.
  • إضافة 50 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس لبيليه الجيش الملكي النيبالي وريسوسبيند بيليه في المياه خالية من نوكلاس.
  • التعامل مع العينات مع 1 ميليلتر الدناز (2 وحدات/ميليلتر) إزالة الحمض النووي ومن ثم إلغاء تنشيط الدناز والكاتيونات (انظر الجدول للمواد).
  • تخزين عينات الحمض النووي الريبي في أنابيب ميكروسينتريفوجي مل 2.0 في-80 درجة مئوية.

    • 4-تحليل لوفرة نسخة

    1. التحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي والتحقق من الحمض النووي الريبي للنقاء باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
      ملاحظة: نسبة امتصاص في 260 nm إلى 280 شمال البحر الأبيض المتوسط ينبغي أن يكون حوالي 2.0 للجيش الملكي النيبالي.
    2. تحليل الحمض النووي الريبي مع 1% [اغروس] هلام أو عبارة عن تقنية مكافئة لتصور مدى تدهور.
      ملاحظة: اثنين واضحة العصابات تمثل 18S و 28S الرنا الريباسي يجب أن تكون مرئية بوضوح (الشكل 4). إذا لم تظهر هذه العصابات، قد تدهورت في الجيش الملكي النيبالي. وتقدم نصائح إطلاق النار المتاعب لتدهور الجيش الملكي النيبالي في المناقشة.
    3. رصد نسخة وفرة في مختبرين المجمعة من الحمض النووي الريبي مقارنة مع ارتفعت في الداخلية القياسية باستخدام [ميكروارس]15، تسلسل الحمض النووي الريبي16،17من قبكر في الوقت الحقيقي، أو اسطوانات الشمالية يقوم18.
      1. تحديد الوفرة لكل نسخة في كل مرة نقطة مقارنة مع عنصر تحكم ارتفعت في الوفرة معروفة.
        ملاحظة: ل [ميكروارس]، سوف تكون القيم كثافات الأسفار. للبقع الشمالية، يمكن قياسها كمياً العصابات على فيلم الأشعة السينية. قبكر في الوقت الحقيقي، يمكن تحديد وفرة نسخة مقارنة بالمعايير المعروفة مع أسلوبتي -σσC219. للحمض النووي الريبي-Seq، يمكن تحديد قيم طبيعية فبكم أو الأجزاء في كل كيلوبس إكسون الواحدة مليون القراءات المعينة. لمعدلات تسوس isoform محددة، يمكن أن تحلل البيانات تسلسل الحمض النووي الريبي استخدام منهجيات علم isoform مثل ديكسسيق20. أفضل تحديد أسعار تسوس Isoform محددة مع ما يليها الحمض النووي الريبي إذا أريد لها أن تكون مصممة مع البيانات ميكرواري، ثم يجب تحليل البيانات على أساس التحقيق بالتحقيق بدلاً من أساس الجينات بالجينات. المحلل يجب أن تكون حذراً عند تفسير المعلومات من عدد محدود من تحقيقات. على سبيل المثال، قد يكون هناك تحقيقات 5 أو أقل التي غنية بالمعلومات حول isoform خاصة. في هذه الحالة، سوف تحتاج إلى المحلل تحديد ما إذا كان سلوك هذه المسابر متسقة بما فيه الكفاية حتى تكون النتائج موثوقة.
    4. أداء قبكر في الوقت الحقيقي على الحمض النووي الريبي المعزولة17 في العينات التي تم جمعها لتحليل الجينات سرعة المتحللة، مثل ج-حركة وجين المتحللة ببطء مثل جابده، لكسب ثقة هذا الاضمحلال نسخة معدلات تم الكشف عنها بدقة.
      ملاحظة: لمزيد من التأكيد، تحقيقات محددة isoform قبكر في الوقت الحقيقي يمكن وضع والمستخدمة لرصد وفرة isoforms محددة مع مرور الوقت21.

    5.تسوس معدل ثابت العزم

    1. لكل تيميبوينت، سجل تحويل القيم وفرة لكل نسخة (الخاصة بالجينات أو إيسوفورم على حدة).
      ملاحظة: سجل تحويل القيم سيتم تحويل المنحنيات الأسية تسوس إلى الخطوط التي يمكن أن تناسب مع نموذج تسوس خطي22.
    2. تناسب الشخصية التعبير لكل نسخة (الخاصة بالجينات أو محددة isoform) إلى نموذج خطي اضمحلال. صيغة لنموذج من هذا القبيل هو f(t) = C-r * t. في هذه المعادلة، C هو ثابت يمثل مبلغ بداية من نسخة r هو معدل الانخفاض وتي أن الوقت قد حان منذ بداية التجربة. من هذه المعادلة، تحديد معدل الانحلال ك r*ln(10) (انظر المرجع11).
      ملاحظة: حزمة البرامج ماسيجبرو نهج يستند إلى الانحدار المصممة لكشف الفروق الشخصية التعبير الجيني الكبير في الوقت بالطبع البيانات23. يتوفر نموذج التعليمات البرمجية والنتائج ماسيجبرو في: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.
    3. تصفية الجينات التي لا تناسب نموذج تسوس سجل خطية. وهذا يمكن أن يتحقق مع اختبار ANOVA F.
      ملاحظة: الاختبار و يستند إلى إحصاء F، التي تعرف بأنها التباين بين الوسائل العينة مقسوماً تباين داخل عينات. تصحيح فالقيم لمقارنات متعددة عن طريق تطبيق خطي step-up بينجاميني وهوشبيرغ اكتشاف كاذبة الداخلي24. فاء-قيمة أكبر من 0.05 مع اختبار F يمكن استخدامها كقطع للجينات التي لا تناسب نموذج سجل خطي تسوس.
    4. إجراء اختبار ANOVA F لتحديد النصوص مع مصطلح تفاعل كبير بين شرط قاطع دورة الخلية والوقت (معدل اكتشاف كاذبة، فرانكلين روزفلت < 0.05).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    أبلغنا سابقا نتائج التحاليل ميكرواري معدلات تسوس نسخة في الليفية البشرية الأولية المنتشرة وتحول دون الاتصال أكثر الطبع وقت 8 ساعة12. وترد قائمة الجينات مع تغير كبير في استقرار نسخة مقارنة الليفية المتكاثرة وتحول دون الاتصال التكميلية الجدول1. يتم توفير كثافات fluorescence صفر في الوقت، ومر وقت بعد العلاج أكتد. وأدرجت الجينات على القائمة بتحديد الجينات التي تحتوي على منحدرات مختلفة اختلافاً كبيرا في ظروف المتكاثرة وتحول دون اتصال باستخدام اختبار ANO...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    يمكن أن يكون التتابع الناجم عن إشارات خارجية بما في ذلك الانسحاب من ميتوجينس أو مصل الدم، وعدم التصاق الخلايا، وتثبيط الاتصال. تثبيط الاتصال، واحدة من العديد من الأساليب الممكنة لحمل التتابع، هو عملية عالية تقحم حفظت فيها الخلايا إنهاء دورة الخلية التكاثري ردا على خلية لخلية الاتصال. نحن نركز هنا على تثبيط الاتصال كمثال على أسلوب للحث على التتابع. أفادت الدراسات السابقة أن خلية خلية الاتصال يمكن أن تؤثر على نشوء حيوي microRNA25، وبالتالي، النتائج معلومات بشأن أسلوب التتابع واحد ودراسات إضافية مطلو...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    الكتاب قد لا المصالح المتنافسة الكشف.

    شكر وتقدير

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    وكان HAC الباحث ميلتون هاء كاسل مؤسسة ألن ريتا (http://www.ritaallenfoundation.org). تم تمويل هذا العمل بالمنح إلى HAC من مركز المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة لمنح الامتياز P50 GM071508 (ديفيد بي بوتستين)، مؤسسة PhRMA منحة 2007RSGl9572، مؤسسة وطنية العلم OCI منحة 1047879 لديفيد آب/أغسطس، المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم R01 GM081686، المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة R01 GM0866465، إيلي & أديت واسع مركز الطب التجديدي & بحوث الخلايا الجذعية، مركز الصحة/جامعة كاليفورنيا كتسي المعاهد الوطنية للصحة كانتور قزحية العين للمرأة منحة UL1TR000124، وجمعية اللوكيميا اللمفاوية. وأيد البحث عنها في هذا المنشور المعهد الوطني للسرطان من "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة رقم P50CA092131. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة. HAC وعضو إيلي & "أديت مركز واسع للطب التجديدي" & بحوث الخلايا الجذعية ومعهد البيولوجيا الجزيئية في جامعة كاليفورنيا وجامعة كاليفورنيا المعلوماتية البرنامج المشترك بين الإدارات.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    أجهزة الطرد المركزي لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة قادرة على الوصول إلى 12,000 × جم و 4 درجة ؛ C
    معدات لتشغيل المواد الهلامية
    ألواح زراعة الأنسجة المعقمة والأنابيب المخروطية تقنيات
    النسر المعدل من Dulbecco11965-118
    مصل الأبقار الجنينيVWR35-010-CV
    الماصات المصلية المعقمة والماصات وأطراف الماصات لزراعة الأنسجة
    ماصات وأطراف وأنابيب خالية من الرناس ملفوفة بشكل فردي وخالية من الرناس لعزل الحمض النووي الريبي وتحليله
    قفازات يمكن ارتداؤها عند التعامل مع الكواشف وعينات
    RNaseZapInvitrogenAM9780لتطهير أسطح العمل من
    eppendorf RNase 2.0 مل
    Trypsin-EDTA  الحل 10XMillipore Sigma9002-07-07
    معقم PBSLife Technologies14190-250
    TrizolThermo Fisher Scientific15596018
    Actinomycin DMillipore SigmaA1410-2 mgيثبط النسخ
    مذيب معقم DMSOFisher Scientific31-761-00MLللأكتينومايسين د
    ChloroformThermo Fisher ScientificICN19400225MP Biomedicals، Inc منتج
    IsopropanolFisher ScientificBP2618500درجة البيولوجيا الجزيئية
    الإيثانولفيشر العلمي BP28184علم الأحياء الجزيئية الصف
    الجليكوجين الخالي من RNase (محلول مائي 20 مجم / مل)Thermo Fisher ScientificR0551لهطول الأمطار
    RNAمجموعة TURBO خالية من الحمض النوويThermo Fisher ScientificAM1907تزيل الحمض النووي مع DNase ، ثم ، في خطوة لاحقة ،   ، تعطيل الحمض النووي وتزيل الكاتيونات ثنائية التكافؤ
    AgaroseThermo Fisher ScientificICN820721MP Biomedicals، Inc منتج
    تحميل صبغة لهلام الحمض النووي الريبيThermo Fisher ScientificR0641مناسبة حتى لتغيير طبيعة علامات
    الرحلان الكهربائي Millenium RNAسلم الحمض النووي الريبي Thermo Fisher ScientificAM7150
    الحمض النووي الريبي أحاديAgilent Technology5188-5282مثال على التحكم في ارتفاع لتحليل المصفوفات الدقيقة الرشيقة
    قاعدة TrisFisher ScientificBP152-1درجة البيولوجيا الجزيئية ، لعازلة TAE
    حمض الخليك الجليديFisher ScientificA38-500ل TAE buffer
    EDTAFisher درجة الرحلان الكهربائيالعلمي BP120-500، للمواد الهلامية
    Ethidium bromideMillipore SigmaE7637للبيولوجيا الجزيئية
    ضوابط الحمض النووي الريبي الخارجي اتحاد الحمض النووي الريبي Spike-in MixThermo FisherScientific 4456740التحكم في Spike-in ل RNA Seq
    TruSeq Stranded mRNA Library Kit A (48 عينة ، 12 فهرس)IlluminaRS-122-2101ل RNA Seq
    96 بئر 0.3 مل لوحة PCRThermo Fisher ScientificAB-0600qPCR Microseal B في الوقت الحقيقي
    Bio-RadMSB1001الخالية من qPCR
    / DnaseVWR89094-662ل qPCR
    Rnase / Dnase في الوقت الحقيقي ثمانية شرائط وأغطية أنبوبيةThermo Fisher ScientificAM12230ل qPCR
    في الوقت الفعليSuperScript Reverse TranscriptaseInvitrogen18090010ل qPCR
    AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63880ل qPCR في الوقت الحقيقي
    الاغاروزالحمض النووي الريبيأنابيب ناقل طقم اللون لأختام لاصقة لخزانات الكاشف في الوقت الفعلي في الوقت الحقيقي

    المراجع

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
    2. Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
    3. Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75(2005).
    4. Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
    5. Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
    6. Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83(2006).
    7. Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
    8. Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
    9. Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121(2012).
    10. Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
    11. Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
    12. Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123(2017).
    13. Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
    14. Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
    15. Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
    16. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
    17. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
    18. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
    19. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
    20. Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
    21. Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
    22. Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
    23. Conesa, A., Nueda, M. R package version 1.46.0. maSigPro: Significant Gene Expression Profile Differences in Time Course Gene Expression Data. , Available from: http://bioinfo.cipf.es (2016).
    24. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
    25. Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
    26. Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115(2009).
    27. Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
    28. Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
    29. Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
    30. Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719(2014).
    31. Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
    32. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
    33. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
    34. Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
    35. Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    Decay RatesProliferating FibroblastsQuiescent FibroblastsActinomycin D TreatmentRNA Isolation ProtocolReal Time qPCR AnalysisHuman Dermal FibroblastsGene Expression ChangesRNA Purity CheckPhenol Guanidine Extraction

    مقالات ذات صلة