يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان رابطة الدول المستقلة -prenyltransferase في الإشريكية القولونية

6.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56430

⸱

أغسطس 3, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Department of Ophthalmology, Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 4Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

بروتوكول بسيط ل أوفيركسريسيون وتنقية من كودون الأمثل، رابطة الدول المستقلة الإنسان -prenyltransferase، في ظل ظروف عدم تغيير طبيعة، من إشريشيا القولونية ، جنبا إلى جنب مع فحص النشاط الأنزيمي. هذا البروتوكول يمكن تعميمها لإنتاج البروتينات الأخرى prenyltransferase cis- في كمية ونوعية مناسبة للدراسات الميكانيكية.

الملخص

برينيلترانزفيراسيس (بت) هي مجموعة من الانزيمات التي تحفز استطالة سلسلة من ثنائي فوسفات اليليك باستخدام إيسوبنتينيل ثنائي الفوسفات (إيب) عن طريق تفاعلات التكثيف متعددة. ددس (ديهيدرودوليتشيل ثنائي فسفات سينثيز) هو سلالة طويلة الأجل حقيقية سيس -PT (تشكيل رابطة الدول المستقلة رابطة مزدوجة من رد فعل التكثيف) الذي يحفز استطالة سلسلة من ثنائي فوسيل فارنيسيل (فب، ثنائي فوسفات الألييك) عن طريق التكثيف متعددة مع ثنائي إيسوبنتنيل ثنائي الفوسفات (إيب). ددس هي ذات أهمية طبية حيوية، كما طفرة غير متحفظة (K42E) في الإنزيم يؤدي إلى التهاب الشبكية الصباغي ، مما يؤدي في النهاية إلى العمى. ولذلك، تم تطوير هذا البروتوكول من أجل الحصول على كميات كبيرة من ددس تنقيته، ومناسبة للدراسات الميكانيكية. هنا، تم استخدام استخدام الانصهار البروتين، وتحسين ظروف الثقافة وكودون الأمثل للسماح أوفيركسريسيون وتنقية دسدز الإنسان نشط وظيفيا في سيس -PT بين الأنواع المختلفة تشير إلى أن هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على غيرها من رابطة الدول المستقلة حقيقية النواة -PT كذلك، مثل تلك المشاركة في تركيب المطاط الطبيعي.

المقدمة

برينيلترانزفيراسيس هي مجموعة من الانزيمات التي تحفز استطالة سلسلة من ثنائي فوسفات اليليك باستخدام إيسوبنتينيل ثنائي الفوسفات (إيب) عن طريق التفاعلات التكثيف متعددة 1 ، 2 . إنزيمات Z- نوع تحفيز تشكيل رابطة الدول المستقلة رابطة مزدوجة من رد فعل التكثيف، في حين أن E- نوع الإنزيمات تحفيز تشكيل رابطة مزدوجة عبر 3 . رابطة الدول المستقلة -Prenyltransferases (-PT رابطة الدول المستقلة، Z-نوع الإنزيمات) وكلاسيكي تصنف وفقا لطول سلسلة منتجاتها إلى قصيرة السلسلة (C 15)، متوسطة سلسلة (C 50-55)، وسلسلة طويلة (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl ثنائي فسفات سينسيز) هي حقيقية النواة سلسلة طويلة من رابطة الدول المستقلة -PT أن يحفز سلسلة من استطالة ثنائي فسفات farnesyl (FPP، وهو ثنائي فسفات allylic) عن طريق تكثفات متعددة مع ثنائي فسفات isopentenyl (IPP) 1، 5 ، 6 . وهذا يؤدي إلى تشكيل ديهيدرودوليتشيل ثنائي الفوسفات، و C 55-100 ثنائي فوسفات البولي بروبيلين بمثابة مقدمة ل دوليشيلبيروفوسفات، جليكوسيل الناقل جزيء تشارك في N- ربط البروتين غليكوسيلاتيون 1 . بين اليهود الأشكناز، طفرة غير متحفظة (K42E) في نتائج ددس في راثي متنحية التهاب الشبكية الصباغي 7 ، 8 . لذلك، تم تطوير هذا البروتوكول من أجل الحصول على ددس تنقيته مناسبة للدراسات الميكانيكية.

يعتبر الإشريكية القولونية المضيف الأكثر ملاءمة وفعالة من حيث التكلفة للتعبير البروتين المؤتلف، وبالتالي هو أيضا المضيف الأكثر استخداما. ومع ذلك، عندما يحاول المرء البروتينات أوفيركسريس غير متجانسة في E. القولونية ، ينبغي أن تؤخذ الاعتبارات الخاصة بالبروتين. الحصول على مطوية بشكل صحيح، نشطe البروتينات المؤتلف من E. القولونية ، ليست مسألة بسيطة بسبب خصائص متميزة من البروتينات المختلفة. وقد وضعت نهج عديدة للتغلب على هذه العقبات. هنا، تم استخدام استخدام الانصهار البروتين، وتحسين ظروف الثقافة وكودون الأمثل للسماح أوفيركسريسيون وتنقية ددس البشري نشط وظيفيا في E. القولونية . من ملاحظة، كانت محاولة سابقة ل أوفيركسريس الخميرة رابطة الدول المستقلة -PT دون انصهار البروتين ناجحة بسبب عدم القابلية للذوبان كاملة حتى في وجود المنظفات 12 . بروتوكول وصفها هو بسيط، فعالة من حيث التكلفة، والوقت تجنيب ويسمح للمرء الحصول على الاستعدادات ددس مناسبة للدراسات الميكانيكية. ونظرا لتناظر سيس -PT بين الأنواع المختلفة، نقترح أن هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على غيرها من رابطة الدول المستقلة حقيقية النواة -PT كذلك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1 - استنساخ رابطة الدول المستقلة -PT ل أوفيركسريسيون في E. القولونية

  1. الحصول على ناقلات التعبير بيت-32b، والمصممة للاستنساخ والتعبير على مستوى عال من تسلسل البروتين تنصهر مع البروتين 109aa ثيوريدوكسين (تركس) 17 ، و E. القولونية كودون الأمثل 18 تسلسل الترميز كامل طول سيس -PT.
  2. احرص على أن يكون لTEV البروتيني (التبغ فيروس حفر البروتيني) الموقع الانقسام (ENLYFQ / G، حيث "/" يشير إلى نقطة الانقسام) 9 تليها رابط مرنة قصيرة (SGSGSG، لتعزيز موقع انشقاق الوصول) المنبع من رابطة الدول المستقلة تسلسل -PT ( الشكل 1 A ). أيضا، إضافة مناسبة 5 'و 3' مواقع تقييد للاستنساخ.
  3. استنساخ بناء الحمض النووي توليفها في ناقلات بيت-32b باستخدام تقنيات ربط القياسية 10 .

2 - Overexpreسسيون من ددس الإنسان في E. القولونية

  1. تحويل E. القولونية T7 التعبير عن الخلايا المختصة مع تركس الانصهار ددس بناء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. لوحة الخلايا المحولة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة على لب أجار تحت ظروف انتقائية الأمبيسلين (200 ملغ / لتر).
  3. تطعيم المستعمرات المختارة إلى 100 مل من وسط لب في 250 مل قوارير كاتب الثقافات مع 100 ملغم / لتر أمبيسيلين واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز المستمر في 200 دورة في الدقيقة.
  4. تطعيم 80 مل من الثقافة إلى اثنين من قوارير 5 L (40 مل لكل قارورة)، ولكل منها 1.5 لتر من 2X يت المتوسطة (16 جم / لتر تريبتون، 10 جم / لتر استخراج الخميرة، 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم) مع 100 ملغ / لامبيسيلين.
  5. احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز المستمر في 180 دورة في الدقيقة حتى الوصول أود 600 نانومتر = 0.5.
  6. خفض درجة الحرارة إلى 16 درجة مئوية والحث على الخلايا عن طريق إضافة 0.5 ملي الآيزوبروبيل β-D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (إيبت). يستهلكتينو احتضان تحت نفس الحالة لمدة 16-20 ساعة لتعبير البروتين.
  7. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي (10،000 x ز لمدة 10 دقيقة).
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا؛ يجب أن تبقى الخلايا بيليه في -80 درجة مئوية حتى تنقية.

3 - تنقية الإنسان ددس

  1. ريسوسبيند الخلايا في المخزن المؤقت A (25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1٪ تريتون X-100، 10 ملي β- ميركابتوثانول)، 1 ميكروغرام / مل دناز الأول، وخليط مثبط الأنزيم البروتيني.
  2. تجانس الخلايا باستخدام الزجاج-تفلون الخالط.
  3. تعطيل الخلايا باستخدام ميكروفليديزر أو ما يعادلها في 12،000 - 15،000 رطل 11 .
  4. أجهزة الطرد المركزي الخلية المحللة في 40،000 x ج لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية. استعادة طاف، التي تحتوي على جزء قابل للذوبان.
  5. تحميل طاف على 5 - 10 مل الكوبالت يجمد المعادن اللوني تقارب (كو 2 + -IMAC) 12 عمود مع 10مم إيميدازول، تليها غسل شامل مع العازلة A و 10 ملي إيميدازول للحد من البروتين غير محددة ملزمة.
  6. أزل البروتينات أوفيركسرسد مع العازلة ألف تستكمل مع 250 ملي إيميدازول.
  7. إزالة إيميدازول باستخدام 53 مل التحضير العمود تحلية موازنة مع العازلة A.
  8. إضافة 6xHis الموسومة تيف البروتيني (1 ملغ تيف البروتيني لكل 50 ملغ من البروتين) إلى البروتينات إلوتد لإزالة بهم 6XHis الموسومة تركس البروتين الانصهار في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  9. تحميل البروتينات المشقوق على كو 2 + عمود -IMAC، معايرتها مع العازلة A تستكمل مع 5 ملي إيميدازول، لإزالة المشقوق 6X له الموسومة تركس البروتين الانصهار وتيف البروتيني.
  10. جمع تدفق من خلال والتركيز على 3-4 مل باستخدام 30 كيلو دالتون الوزن الجزيئي مرشح الطرد المركزي قطع.
  11. تحميل البروتين المركزة على العمود اللوني سوبيرديكس-200 حجم الاستبعاد معايرتها مع العازلة A لتنقية النهائية. البروتين يوت كما ديمر (~ 76 كيلو دالتون).
  12. حدد الكسور ذات الصلة بمقارنة الملف الشخصي شطف لمنحنى معايرة العمود.
  13. تقييم نقاء إعداد باستخدام سدز-بادج.
  14. تحديد تركيز البروتين اللازمة للتجريب المصب وتجميد فلاش أليكوتس من البروتينات المنقى، وتتركز في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4 - التحليل التحليلي الاستبعاد اللوني (سيك)

  1. لضمان قدرة البروتين على تحمل دورات تجميد ذوبان الجليد، ذوبان الجليد قسامة من البروتينات المجمدة وأجهزة الطرد المركزي في 21،000 x ز لمدة 10 دقيقة لإزالة المجاميع غير قابلة للذوبان. جمع طاف.
  2. تحميل البروتينات على عمود تحليلي سوبيرديكس-200 قبل معايرة مع 25 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 0.02٪ تريتون X-100، 10 ملي β- ميركابتوثانول، وذلك باستخدام فائقة الأداء نظام اللوني السائل 13 ، 14 -
  3. رصد التربتوفان فلورسسينس (λ إكس = 280 نانومتر، λ إم = 350 نانومتر) للكشف عن الملف الشخصي شطف شطف البروتينات. تأكد من وجود منحنى معايرة صالحة لتقييم الوزن الجزيئي - مثل هذه المنحنيات المتاحة من خلال الشركات المصنعة العمود سيك.

5. إنزيم كينيتيكش - النشاط المعتمد على الوقت 15 ، 16 ، 17

  1. لضمان نشاط البروتين المنقى، مزيج 5 ميكرومتر من ددس المنقى مع 10 ميكرومتر فب و 50 ميكرومتر 14 C-إيب لبدء التفاعل في العازلة A مع 0.5 ملي مغكل 2 في 22-30 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد تختلف ظروف التفاعل الدقيق مع استعدادات رابطة الدول المستقلة -PTs مختلفة من ددس. وعلاوة على ذلك، يعتمد نشاط ددز أيضا على درجة الحرارة و [مغ 2+ ].
    الحذر: 14 C-إيب هو مشع وينبغي أن تستخدم وفقا للوائح السلامة الإشعاعية المحلية.
  2. سحب 15 ميكرولتر عينات من رد فعل في 0 و 2 و 4 و 6 ح، بعد التبريد الفوري من رد فعل بإضافة 15 ميكرولتر العازلة ألف تستكمل 20 ملي إدتا (إلى تركيز النهائي من 10 ملي إدتا).
  3. إضافة 1 مل H 2 O المشبعة 1-بيوتانول ودوامة تماما لاستخراج منتجات التفاعل.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا والعينات يمكن أن تبقى للقراءة في وقت لاحق.
  4. إضافة كوكتيل التلألؤ إلى العينات، وذلك باستخدام عداد التلألؤ، ومنتجات التفاعل كوانتيتات في مرحلة بيوتانول تشمل 14 C، جنبا إلى جنب مع النشاط الإشعاعي من 15 ميكرولتر من خليط التفاعل، وهو ما يمثل النشاط الإشعاعي الكلي.
  5. طرح قراءات الخلفية تقاس باستخدام عينات 0 ساعة من كل نقطة زمنية وحساب نسبة 14 C-إيب المستخدمة.
  6. حساب صافي 14 C-إيب دمج في كل نقطة زمنية عن طريق حساب النسبة المئوية المستخدمة من المجموع 14 C-إيب تركيزات، ورسم النتائج كدالة من الزمن. ومن المتوقع زيادة في صافي دمج 14 C-إيب مع الوقت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وتظهر نظرة عامة على البناء المستخدمة هنا وعملية التنقية في الشكل 1 . وتظهر العينات التي تم الحصول عليها في كل خطوة تنقية في الشكل 2 . ويظهر هذا التحليل سدز-بادج تنقية تدريجي من ددس، مما أدى إلى منتج عالي النقاء. ويبين الشكل 3 نتائج سيك التحليلية من الانزيم المنقى، وكشف عن أن البروتين لوحظ فقط باعتباره هوموديمر. ويبين الشكل 4 فحص ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بروتوكول وصفها هنا لتنقية ددس البشري وظيفية في E. خلايا القولونية بسيطة وفعالة، والسماح لأحد أوفيركسريس وتنقية البروتين في 3 - 4 أيام مرة واحدة في بناء مناسب هو متاح. هذه البروتوكولات لتنقية البروتين ذات أهمية خاصة نظرا للاختراقات في تسلسل الجينوم، والتي قدمت مجموعة كبيرة من المعلومات المتعلقة بعلم الوراثة من العديد من الأمراض 18 ، مما يتطلب تطوير طرق الإنتاجية العالية لتوصيف آليات المسببة للأمراض على مستوى البروتين 19

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مركز التميز العلمي في مؤسسة العلوم الإسرائيلية (I-كور) في علم الأحياء الخلوي الهيكلي (1775/12) ومؤسسة العلوم الإسرائيلية تمنح 1721/16 و 2338/16 (ي) و 825/14 (دك) ). إن الدعم الذي تقدمه مؤسسة أراضي الإقليم إلى جمهورية الكونغو الديمقراطية هو محل تقدير كبير. تم تنفيذ هذا العمل من قبل ايلان إدري وميشال غولدنبرغ في الوفاء الجزئي لمتطلبات أطروحة دكتوراه في الطب من كلية ساكلر الطب، جامعة تل أبيب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
pET-32bNovagen69016-3
T7 Express   lysY  كفء  الإشريكية القولونية  (كفاءة عالية)NEBC3010I
cOmplete ، كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTARoche11873580001
راتنج TALON-superflowGE Healthcare28-9574-99
HiPrep 26/10 عمود تحلية المياه   ؛جنرال إلكتريك للرعاية الصحية17508701
هاي لود 16/60 superdex-200 28989335GE
Healthcare Superdex-200 بمقدار 5/150 GL  جنرال إلكتريك للرعاية الصحية28990945
14C-Isopentenyl بيروفوسفاتPerkin-ElmerNEC773050UC 
عبر ، عبر فارنسيل بيروفوسفاتسيجما44270-10 مجم
زيادة

المراجع

  1. Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
  2. Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
  3. Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
  4. Imperiali, B., O'Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
  5. Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
  6. Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
  7. Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
  8. Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
  9. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  10. Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
  11. Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
  12. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
  13. Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
  14. Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457(2011).
  15. Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
  16. Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
  17. Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
  18. Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).
  19. Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
  20. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  21. Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21(2014).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

DHDDS SDS PAGE
أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان رابطة الدول المستقلة -prenyltransferase في الإشريكية القولونية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.